植物RNA的提取及其电泳鉴定.doc

植物RNA的提取及其电泳鉴定.doc 实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定 一、原理 植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80,左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占1,,5,。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3ˊ末端都具有20,200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。 植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。 内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等;RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。 外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯CHs-O-CO-O-CO-O-CxH)，它能与25RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO 2及CHOH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.05,,0.1,25 DEPC，37?处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22μm 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180?烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1,的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。 提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3, H0溶液中，22室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。 尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这是因为RNase活性的抑制只 是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。 影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖;采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化;或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。 (一)总RNA的提取 用于研究基因达的总RNA提取时首先要考虑的问题是材料的选取及预处理。由于基因表达与生理状态密切相关，因而取材时必须考虑材料的生理状态，必要时还要对材料进行预处理，即施加某种因素，诱导目的基因表达，如进行光照、暗处理、或加入诱导物等。 材料的破碎与植物细胞总DNA的提取相同，采用液氮冷冻及在液氮中研磨。预处理过的材料要尽早地投入到液氮中，投入前要尽可能保持材料完整及新鲜，不要让材料压碎及破损。因为植物材料在破损时会引起多酚类物质的积累及氧化，使组织变褐而影响RNA分离。细胞膜裂解也与DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。 由于细胞内RNA主要以核蛋白体形式存在，所以总RNA提取的路线是细胞破碎，使核蛋白体从细胞内释放;采用使蛋白质变性的做法，令核蛋白体解析，RNA迅速与蛋白质分离，大量地释放到溶液中;然后用酚、氯仿有机溶剂抽提，去除蛋白质杂质，使核酸进入水相;再选择性沉淀RNA，使之与DNA分离;所得RNA再进行必要的纯化，最后用乙醇或异丙醇沉淀RNA。 至于植物细胞总RNA的提取方法，同植物总DNA提取一样，没有一种固定的通用方法。文献中报导的植物细胞总RNA的提取方法很多，但综合起来看，分离的主要依据不外乎如下几点:? 用酚及去污剂SDS或Sakosyl破碎细胞膜并去除蛋白质;? 酚、氯仿反复抽提纯化核酸;? LiCl选择性沉淀去除DNA及其它不纯物;? 3mol,L乙酸钠(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中;? CsCl密度梯度离心，去除多糖等杂质，纯化RNA。 目前用于Northern 杂交植物总RNA提取方法根据主要试剂可分为苯酚法、异硫氰酸胍(或CTAB)法及氯化锂沉淀法: 1、苯酚法 该法利用苯酚协助破碎细胞;酚,氯仿变性蛋白质并反复抽提核酸;3mol,L乙酸钠选择沉淀RNA;提取液中使用4—氨基水杨酸及三异丙基萘磺酸盐抑制RNase活性。该方法操作简单、经济，可用于从植物叶、茎、根及萌发幼苗中提取总RNA或核RNA。 2、异硫氰酸胍法 异硫氰酸根及胍离子都是很强的蛋白质变性剂。异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠合用可使核蛋白体迅速解体;与还原剂β—巯基乙醇合用能强烈抑制RNase 活力，因而是制备RNA的一种 常用试剂。 传统的异硫氰酸胍法需利用CsCl离心分离RNA(沉到管底)。这种做法操作时间长、设备要求高。经改进，目前使用的方法使操作大大地简化，并可同时提取多个样品。做法是将异硫氰酸胍、β—巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠三者合用，强有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白体的解离，将大量的RNA释放到溶液中，然后用酸性酚进行抽提，既可保证RNA稳定，又可抑制DNA解离，使DNA与蛋白质一起沉淀，RNA被抽提进入水相，用异丙醇沉淀RNA后，经酚,氯仿再次抽提进行纯化。该方法提取的RNA 用于Northern 杂交可以得到满意结果。 3、氯化锂沉淀法 该方法的主要原理是在一定的pH条件下，Li+使RNA发生特异性沉淀，通过多级沉淀可提高RNA的纯净度。利用氯化锂选择性沉淀时，因提取缓冲体系不同有多种不尽相同的氯化锂法，有的使用硼酸缓冲液，加入还原剂二硫苏糖醇抑制RNase活性，用SDS变性核蛋白;有的使用Tris—HCl缓冲体系，用苯酚及蛋白酶K处理蛋白;还有的使用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制 +RNase。氯化锂沉淀法虽也有效，但沉淀过程较为繁琐，并存在着Li的污染问题。 (二)mRNA的分离 从总RNA中分离mRNA主要是利用亲和层析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)结构，可用oligo(dT)—纤维素(寡聚(dT)—纤维素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—琼脂糖)亲和层析技术来纯化mRNA。总RNA在流经寡聚(dT)—纤维素层析柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 3,—端多聚(A)残基与连接在纤维素柱上的寡聚(dT)残基间配对，形成氢键，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)结构的RNA，不能发生特异性结合而从柱中流出。结合在柱上的mRNA可以用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。因为在高盐溶液中碱基间的氢键稳定，在低盐状态下易解离，水打破poly(A)与(dT)间的氢键，使mRNA洗脱。 层析中涉及到的缓冲液有两种，一是上样缓冲液，也有人称结合缓冲液。各文献报道的结合缓冲液都由Tris?C1、EDTA、氯化物盐类及去污剂组成。不同之处是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol,L的LiCl。不管使用哪种盐，都为高浓度，以促进poly(A)与寡聚(dT)结合。第二种是洗脱缓冲液，除Tris、去污剂的浓度减半外(也有Tris 量不减半的)，最大的变化是不含氯化物或含低浓度的LiCl。其作用是解除Poly(A)与寡聚(dT)的结合，使mRNA洗脱下来。 在没有特制的层析柱时，可以用无菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做层析柱，出口端用无菌硅烷化过的玻璃纤维填充。寡聚(dT)纤维素用上样缓冲液悬浮后装柱。柱体积在0.25ml左右。装柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上样缓冲液平衡。RNA的样品量一般在2~5mg，体积为lml左右。上样前样品要经过变性处理，置沸水浴中加热数分钟后立即置冰浴中。上样后就要立即收集流出液，这时流出液中可能含有一些未能与纤维素结合的mRNA。将流出液加热至65?维持6~7分钟，然后快速冷却再重新上样，如此反复多次，以使mRNA充分被吸附在纤维素柱上，用5~10倍体积的结合缓冲液洗柱，这时rRNA、tRNA 等逐渐被冼脱，而mRNA挂在柱上。洗脱至流出液的OD260值几乎为零，换用低盐的洗脱缓冲液洗脱mRNA，部分收集器收集，测定每管中 的mRNA浓度，合并含mRNA的洗脱液，用乙醇沉淀mRNA，于-70?保存。 (三)RNA样品质量检测 用于Northern杂交的RNA样品应是纯净的，无明显的DNA、蛋白质污染，无小分子有机物复合，无提取试剂的污染。分子完整，无严重降解。同DNA样品质量检测相同，主要有紫外吸收法及琼脂糖凝胶电泳法两种。 1、紫外吸收法 ? 纯度检测:在分光光度计上分别测定样品在230nm、260nm、280nm的吸收值，计算A260/A280及A260,A230的比值。纯净的RNA样品A260/A280的比值应在1.7~2.0之间，若小于1.7则表明样品中有蛋白质或酚试剂污染。此时，可用等体积的酚,氯仿重新抽提去除蛋白质;用氯 60,)。A260/A230的比值应大于2.0，如仿、乙醚抽提去除残酚。在抽提过程中RNA损失较大(约 小于2.0则表明RNA被异硫氰酸胍污染。这时可以通过乙醇或异丙醇重新沉淀(可反复几次)来去除。关于DNA杂质的存在与否紫外分光光度法不能予以明确。 ? 浓度测定:纯净的RNA样品(无DNA及核苷酸杂质)260nm的光吸收值等于1.0时，RNA的含量为37 µg/m1。根据此吸收值与浓度的关系可求出任一RNA样品的浓度。 RNA含量(μg,m1),A × 稀释倍数× 37 μg,m1 当对含量要求不十分精确时，可近似认为A=1.0 时的RNA浓度为40µg/m1。测定时如果260 按如下做法可使计算简化:取4µl RNA样品，加蒸馏水至lml，以蒸馏水或TE为空白测定A260值，该数值× 10 即为样品RNA浓度(µg/µl)。 2、琼脂糖凝胶电泳法 由于RNA分子结构与DNA不同，因而RNA电泳时有着与DNA电泳的不同之处。因RNA为单链分子，链内配对碱基很易通过氢键结合而形成二级以至三级结构。不同的RNA分子空间结构不同，因而RNA分子在未变性的条件下分子量与泳动率无严格的相关性。在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构，才能使RNA的泳动距离与其分子量对数值成正比。变性后的RNA泳动速度比天然RNA小1/2左右。在不需要测定RNA分子量时，使用浓度1.0,~1.4,的非变性琼脂糖凝胶也可将不同的RNA分子分离。当需要对所提取的RNA样品进行快速检测时可使用非变性胶。 总RNA样品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。电泳后在胶板上呈现三条明显的条带。在上样量小时，5SrRNA的条带有时显示不清。若在变性胶上，这三条带的迁移率分别与5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的RNA的迁移率相近。从量上看，溴化乙锭染色后28SrRNA条带的亮度应为18SrRNA的两倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA条带，表明样品中RNA有降解。发生降解的原因主要是RNase灭活不好，或操作中温度过高。防止的方法是操作全过程在4?低温条件下或冰上进行。操作中一次性手套要经常更换，尽量避免RNase污染。 二、植物总RNA的提取方法 主要有苯酚、异硫氰酸胍、CTAB、LiCl密度梯度、Trizol等方法。 (一)CTAB法 1、材料:植物幼嫩组织器官或种子萌发的幼苗。 2、器材:研钵、液氮、带盖离心管、 移液器，涡旋震荡器，高速冷冻离心机，台式离心机， 水浴锅。 3、试剂: ? DEPC’d ddHO 2 每1000ml水加入1ml DEPC，搅拌完全溶解后37?暗处理12小时，高温灭菌。 ? 1 M Tris(pH8.0) 1L 2L DEPC’d ddHO 800 ml 1600 ml 2 Tris 碱 121.1g 242.2g 用HCl(约42ml)调节 pH8.0，DEPC’d ddHO定容后，高温灭菌 2 ? 10%SDS 称取10g SDS，加入DEPC’d ddHO溶解。 2 ? 5 M EDTA(pH8.0) 1L 100ml EDTA•Na 181.6 g 18.2 g 2 ddHO ~900 ml ~90 ml 2 NaOH 20 g 2 g 调pH至8.0，定容。加DEPC(0.1%)混匀，灭菌。 ? CTAB RNA extraction buffer(100ml) CTAB 2g 0.5M EDTA(pH8.0) 5ml NaCl 11.8g 定容至90ml，高温灭菌后加入 PVP(polyvinylpyrrolidinon K30) 2g 1M Tris-HCl (pH8.0) 10ml β-mercaptoethanol 0.2ml(用前加) ? SSTE buffer(100ml): NaCl 5.9g 0.5M EDTA(pH8.0) 0.2ml 定容至94ml，高温灭菌后，加入 10%SDS 5ml 1M Tris-HCl (pH8.0) 1ml 注意事项: ?玻璃移液管、烧杯、量筒、三角瓶、搅拌子、研钵均要在180?烘烤10 小时 以上,?实验所用的塑料离心管要用0.1% DEPC浸泡12-24小时后灭菌～国产的eppendorf tube 以及枪头～也要进行以上处理。 4、操作步骤 ? 离心管中加15ml CTAB提取缓冲液，于65?加热。 ? 液氮研磨2~3克样品，加入上离心管中，迅速涡旋30秒，65?短时间加热(5分钟 加入15ml 氯仿/异戊醇，混匀。 ? 10000rpm，15分钟(室温)，上清转移另一离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽 提一次。 ? 水相转移，加8M LiCl 使终浓度为2M(约为水相的三分之一)，4?，过夜。 ? 15000rpm，3 0分钟，4?，沉淀RNA，弃上清。沉淀先用500ul 70%乙醇洗，再用 500ul无水乙醇洗。 ? 加入500ul SSTE溶解沉淀，转移至1.5ml离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇抽提一 次(13000rpm，10分钟，室温)。 ? 上清转移，加2倍体积的无水乙醇，-70?至少30min或-20?放置2hr沉淀RNA。 ? 4?，13000rpm离心20min。沉淀用400ul 70%乙醇洗，再用400ul无水乙醇洗，干燥 后加50ul DEPC水溶解。取适量电泳检测。 注意:实验过程中要勤换手套～尽量避免手上和唾液中RNase的污染。 (二)异硫氰酸胍—LiCl—酸性酚法 1、材料:植物幼嫩组织器官或种子萌发的幼苗。 2、器材:研钵、液氮、带盖离心管、移液器、涡旋震荡器、高速冷冻离心机、台式离心机、 水浴锅。 3、试剂: ? 异硫氰酸胍提取液溶液: 4mol/L 异硫氰酸胍 25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0) 0.5%十二烷基肌氨酸钠 0.1mol/L巯基乙醇 ? 2mol/L NaA(pH4.0)和3mol/L NaAc(pH5.2):DEPC’HO水配制，灭菌。 C2 ? 4 mol/L LiCl:配制4 mol/L LiCl，加DEPC处理，灭菌。 ? 水饱和酸性酚(