RP-HPLC直接测定水果中维生素C含量

RP-HPLC直接测定水果中维生素C含量 1 *刘贵花 潘富友 (台州学院 医药化工学院 浙江临海 317000) (5 ,m 4.6×250 mm),摘 要:应用反相高效液相色谱法对时令水果中维生素C含量进行直接测定。方法, 色谱柱Eclipse XDB-C18 流动相乙腈-水(40?60 v/v),流速1.0 ml/min,检测波长275 nm。实验结果明维生素C在10 ~ 640 μg/ml范围内呈良好线性,2R=0.99996,回收率为99.3% ~ 104.5%,RSD=1.65%。本法操作简便,结果准确、重现性好,为测定水果中维生素C的含量提供了一种有效方法。 关键词:水果,维生素C(Vc),反相高效液相色谱(RP-HPLC) 中图分类号: 文献标识码:A 文章编号: Determination on Vitamin C in Fruits by RP-HPLC Liu Guihua, Pan Fuyou (Taizhou University School of Pharmaceutical and Chemical Engineering Zhejiang Linhai 317000) Abstract: The vitamin C in fruits of the season was tested directly by reversed-phase high performance 1iquid chromatography.The methods was that the Eclipse XDB-C Column (5 ,m 4.6×250 mm) was used and the mobile phase was a mixture of acetonitrile and water 18 (40?60 v/v) and The flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 275 nm. The experiment results showed that the better linear relation was achieved when the concentration of vitamin C was 10 ~ 640 μg/ml, the related coefficient was 0.99996 and the rang of recovery was from 99.3% to 104.5% and the relative standard deviation was 1.65%. The mothod is easy to operate with precise result and good reproducibility, which establishes a reliable method for determination of vitamin C in fruits. Key words: Fruits; Vitamin C(Vc); Reversed-phase high performance 1iquid chromatography(RP-HPLC) 方法所需试剂多且操作繁琐，测定结果准确性也存0 引言 ,6在一定问题,。近年来发展了用高效液相色谱法测 维生素C，又称抗坏血酸(AH2))。医学研究发定维生素C含量的方法，具有高效、快速、稳定、现它不但具有生理活性，而且在人体内能阻止亚硝可靠等特点，但文献报道的所用流动相体系均较复 ,1,,7-10,胺的形成，具有一定的防癌作用。但人体自身不杂，一般都采用了缓冲盐或者低浓度酸。本文应能合成维生素C，必须由食物中摄取，所以测用反相高效液相色谱法，采用乙腈-水(40?60 v/v)定水果和蔬菜中维生素C含量，将对鉴别水果和蔬作流动相，直接测定了时令常见水果中的维生素C菜的营养价值具有重要意义。目前水果和蔬菜中维含量，取得了理想的效果。 ,2,生素C测定的方法除了药典的碘量法，还有 ,3,,4,,5,比色法、紫外分光光度法、荧光法等，但这些 收稿日期: 1 实验部分 基金项目:浙江省自然科学基金(M2003115) 1.1 主要仪器与试剂 1 刘贵花，女，在读硕研，(1983-)，主要从事色谱研究 *通讯联系人，教授，硕导，panfy@tzc.edu.cn 1 Agilent 1200液相色谱仪，配有VWD检测器;μg /ml的溶液，用0.1%磷酸溶液作参比溶液，在UV-2450紫外分光光度计;Milli-Q纯水超纯水系统; 200~400 nm波长扫描，结果发现在275 nm波长处HS-120D超声波清洗机;AP-01过滤器;FA2004A 电有最大吸收。故本文以275 nm为检测波长。 子天平。 2.3 流动相和流速的确定 甲醇、乙腈(色谱纯)，TEDIA公司;抗坏血取抗坏血酸适量，用0.1%磷酸溶液配成约160 酸(分析纯)，无锡展望化工试剂有限公司;磷酸(分μg /ml的溶液，实验过程中尝试了甲醇、甲醇-水乙析纯)，无锡飞达化工厂;超纯水(由Milli-Q纯水腈、乙腈-水等不同体系及配比的流动相，并对流速超纯水系统制备)。 从0.5,1.5 ml/min之间进行反复实验，结果表明，1.2 色谱分离条件 当流动相为乙腈-水(40?60 v/v)，流速为1.0 ml/min 色谱柱:Eclipse XDB-C18(5 ,m 4.6×250 mm)，时，不但能得到了良好的峰形、适当的保留时间和流动相:乙腈-水(40?60 v/v)，流速:1.0 ml/min， 波较高的理论塔板数，同时能对果汁中其它物质得到长:275 nm;进样量:10 ,l。 较好的分离;而且避免了流动相体系中加入缓冲盐1.3 溶液配制 和低浓度的酸，既保护了色谱柱，又使得实验操作1.3.1 标准贮备液的配制 更简便，维生素C的定性分析图见图1。 精密称取抗坏血酸0.25 g，置250 ml容量瓶中， 加0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。得1000 μg /ml的标准贮备液。 1.3.2 标准溶液的配制 分别精密量取1 ml、2 ml、4 ml、8 ml、16 ml、 32 ml 、64 ml的标准贮备液至100 ml量瓶中，用 0.1%磷酸溶液稀释至刻度，得10 μg /ml、20 μg /ml、 40 μg /ml 、80 μg /ml、160 μg /ml、320 μg /ml、640 μg /ml的系列标准溶液。 1.3.3 供试品溶液的配制(样品前处理) 将买来的新鲜水果洗净，晾干后分别置于匀浆 机中匀浆，用布氏漏斗过滤，再精确称取10 g滤液 图1 维生素C的定性分析谱图 至50 ml容量瓶中，用0.1%磷酸稀释至刻度，进样 Fig 1 The qualitative analysis chromatography of Vitamin C 前用0.45 μm针头式过滤器过滤。 1.4 测定方法和结果计算 根据色谱分离条件，将仪器调节到进样分析状2.4 标准曲线和线性范围 态，用平头针头精确量取10 μl进样分析，保存色谱精确吸取上述不同质量浓度的系列标准溶液10 图记录峰面积，并根据质量浓度-峰面积作标准曲线μl，按色谱分离条件进样分析，保存色谱图记录峰用外标法进行计算。 面积。并以质量浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y (mAu*s)为纵坐标作图，得标准工作曲线的回归 方程为Y = 2.51601 + 3.55617 * X，相关系数R2为 0.99996。结果表明:维生素C在10 ~ 640 μg/ml之2 结果与讨论 间呈现良好的线性关系，见图2。 2.1 溶剂的选择 维生素C具有较强还原性，且易受空气、热、 光、碱性物质、金属离子等因素影响，但在酸性溶 ,11,液中稳定，为防止分析过程中维生素C的破坏， 实验采用0.1%磷酸溶液作溶剂配制各种溶液。 2.2 检测波长的确定 取抗坏血酸适量，加0.1%磷酸溶液配成约160 2 表1 不同水果中维生素C的含量测定 2500 Table 1 Determination on Vitamin C in different Fruits Y = 2.51601+ 3.55617 * X 2000峰面积质量浓度 每100克中Vc含量2)R=0.99996水果名称 (mAu*s) (μg/ml) (mg) 1500mAu*s563.92 157.89 78.93 菠萝 1000699.79 196.08 98.04 面积(草莓 峰 938.95 263.33 131.67 圣女果 500 1118.34 313.78 156.89 猕猴桃 0 2.6 精密度实验 0100200300400500600700 质量浓度(ug/ml)取草莓供试品溶液，按上述的色谱条件连续进 样6次，保存色谱图并记录色谱图中的维生素C对图2 维生素C的标准曲线 应的峰面积。结果峰面积相对标准偏差RSD为 Fig 2 The standard curve of Vitamin C 0.9416%，表明本法精密度较高，重现性较好。实验 。 结果见表22.5 样品测定 2.7 稳定性实验 2.5.1 样品定性分析 准确称取20.0 mg的抗坏血酸分别置于两洁净精密吸取各供试品溶液10 μl，按色谱分离条件 的50 ml烧杯中，其中一份用超纯水溶解，稀释定进样分析，保存色谱图记录峰面积，并根据在同一 容至50 ml容量瓶中，另一份用0.1%磷酸溶解、稀实验条件下纯物质保留时间定性，得出各水果样品 释定容至50 ml容量瓶中。每隔2小时对两溶液按中维生素C的相对应的归属峰。猕猴桃的色谱分离 色谱分离条件进样分析，保存色谱图并记录色谱图图见图3。 中的维生素C的峰面积，然后计算并比较两溶液中 维生素C含量的变化情况。结果表明:用0.1%磷酸 溶解的维生素C在4 h内较稳定，而用超纯水溶解 的溶液稳定性则相对较差，因此更进一步说明了维 生素C在酸性条件下相对比较稳定;但随着时间的 推移，维生素C含量也将逐渐减少，这同时表明新 鲜水果要尽快食用，以免营养成分流失。实验结果 见表3。 表2 方法精密度实验结果 Table 2 The result of degree of precision of this method 编号 峰面积(mAu*s) 质量浓度(μg/ml) RSD值(%) 图3 猕猴桃中维生素C的分析谱图 1 704.85 197.49 Fig3 The chromatography of V in Chinese gooseberry C2 691.18 193.65 3 707.19 198.15 0.9416 2.5.2 样品定量测定 4 700.08 196.16 精密吸取各供试品溶液10 μl，按色谱分离条件5 692.54 194.04 进样分析，保存色谱图并记录色谱图中的维生素C6 702.94 196.96 对应的峰面积，然后根据外标法对各时令水果中的 维生素C含量进行定量计算，各时令水果的维生素表3 方法稳定性实验结果 ,分析结果见表1。 Table 3 The result of stability of this method 时溶剂为纯水 溶剂为0.1% RSD(%) RSD(%) 3 间 的V量(mg) 磷酸的V量(mg) CC 0 20.00 20.00 2 18.34 19.98 4 16.88 19.88 6 15.46 24.91 18.68 7.68 8 12.90 18.07 10 11.42 17.86 12 9.86 16.15 2.8 回收率实验 回收率实验选在圣女果中进行。分别精确移取 圣女果的供试品溶液5 ml于5个50 ml洁净容量瓶 中，再分别直接准确加入2、4、6、8、10 ml质量 浓度为320 μg /ml的维生素C标准溶液，然后用 0.1%磷酸稀释到刻度，按色谱分离条件测定，保存 色谱图并记录色谱图中的维生素C对应的峰面积， 然后根据外标法定量计算，同时计算回收率，实验 参考文献: 结果见表4。 [1] 彭家泽,刁洁.抗坏血酸的生理功能及其在食品中的应用 [J].食品与机械,1994,(4):29. 表4 维生素C的回收率实验结果 [2] 中国人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药Table 4 The result on recovery ratios of Vitamin C 典二部[M].北京:化学工业出版社,2005:669. 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