酞酸酯类药物残留分析方法的研究（可编辑）

酞酸酯类药物残留方法的研究（可编辑） 酞酸酯类药物残留分析方法的研究 江南大学 硕士学位论文 酞酸酯类药物残留分析方法的研究 姓名:徐丽广 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:胥传来 20090601摘要 摘要 酞酸酯是一类环境激素。它干扰生物体内保持平衡并调节生长过程的激素正常的产 生、释放、转移、代谢、反应和消除,或引起生物后代不健康的影响和内分泌功能的改变。 免疫检测技术是国内外小分子快速检测的重要领域之一。本文针对邻苯二甲酸二辛酯 的结构、合成了一种半抗原,并制备得到了一种抗原。用原料.硝基邻苯二甲酸经过 与正辛醇进行酯化反应,得到.硝基邻苯二甲酸二辛酯。通过将苯环上的硝基还原形成苯 环上具有氨基的半抗原,用重氮化法将此氨基偶联到载体蛋白牛血清蛋白作为免疫 抗原.,用重氮化法将此氨基偶联到载体蛋白卵清蛋作间接反应 的包被原.。用紫/可见分光光度计对合成的人工抗原进行鉴定,与半抗原和偶 联物、蛋白的扫描结果进行比较,结果显示偶联物具备半抗原和蛋白的双重特征吸收峰, 因此可以判断偶联成功,并估算免疫原和包被原的偶联比分别为和.。 用上述合成的人工免疫抗原.免疫两只新西兰大白兔,制备出抗血清,效价 依次为、,针对与半抗原结构最相似的邻苯二甲酸二辛酯,建立间接竞争 检测方法并对包被时间、封闭时间、抗体的工作量、品稀释液甲醇含量、竞争时间、 显色时间等条件进行优化。包被原的稀释倍数为,抗体工作浓度为血清稀释倍, 为./,检测限为./,线性范围为./,并在此条件对种酞酸酯和 类似物进行交叉反应试验,达到对邻苯二甲酸二辛酯残留快速检测的要求。 确立聚氯乙烯中种酞酸酯残留的../检测方法。其针对、、 、、、、、、的检测限分别为:、、 、、、、、、/。 和..?两种方法对的检测结果具有一致性且相关性达到 了.. 关键词:酞酸酯;残留;间接;../; . , , , ,.. ?? , . . ??., ? . . . ?,? , ,.? . , ? ? ./, ./ /. 硼 . ? .%、.%、.% .% 、、、 ,. /..%~.%..%~.%,、、~ 、、、、、、、、 、、、、、、/,. ;;??;..../; : ?独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苓人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名: 日 伶丽厂 期: 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定: 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文, 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名: 导师签名: 整叠乏 日 期:脚乡引言 引言 “民以食为天”,食物是维持人类生存、发育及成长的必需品。人体通过不 断摄取食物, 以满足机体对蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素和水的需要。讲 究营养和食物 安全是预防疾病,增进人体健康的保证。但是国内食品安全面临的形势却越 来越严峻。苏 丹红等一些新型食品安全问题开始出现,城乡结合部和农村地区仍属食品安 全工作中的薄 弱环节。年月雀巢奶粉被爆碘超标、年月高露洁牙膏可能致癌、年 月麦当劳肯德基被爆含苏丹红、年月立顿奶茶涉嫌含有氟化物、年的婴幼儿 奶粉中的三聚氰胺事件【。近年来,为满足检测需要现已建立了许多残留检测方法,主要 有:微生物检测法、理化检测法、免疫分析法及其他一些用于免疫分析法的检测技术。 .酞酸酯概论 酞酸酯又称邻苯二甲酸酯类化合物 ,作为塑料工业的增塑 剂被广泛应用于食品包装工业、人造革及医疗用品等方面并且在涂料、香料及油漆等化工 产品中其亦被广泛应用。由于其和塑料分子是相容的,二者之间是通过范德华力和氢键相 互连接,因此在含有酞酸酯作为增塑剂的塑料与食品中的油脂和酒精等脂溶性的物质时酞 酸酯就会从塑料中溶解出来进入到食品中。常用的酞酸酯增塑剂包括邻苯二甲酸二甲酯 ,、邻苯二甲酸二乙酯 ,、邻苯二甲酸 二丙酯 ,、邻苯二甲酸二正丁酯?. ,、 邻苯二甲酸二正戊酯.. ,、邻苯二甲酸二己酯 , 、邻苯二甲酸二环己酯 ,、邻苯二甲酸二辛酯.. ,、邻苯二甲酸二丁基苄基酯 ,、邻苯二甲酸二 .乙基己基酯一,等【。 ..酞酸酯的理化性质及代谢 酞酸酯的种类及理化性质 酞酸酯的结构如图所示: ? ? ? 和的结构可以相同也可以不同。酞酸酯为无色粘稠状液体,难溶于水,不易挥 发。其比重与水相近,凝固点较低,易溶于有机溶剂和类脂,属于芳香族二羧 酸酯,包括 多种化合物。酞酸酯一般是由于邻苯二甲酸和相应的醇发生酯化反应生成?。 酞酸酯的代谢 酞酸酯可经口、皮肤及呼吸道进入到生物体内。经口给予大鼠后,可迅速在 胃肠 道被吸收,在小肠内被非特异性酯酶水解成稳定的邻苯二甲酸单丁酯.. 江南大学硕士学位论文 ,,和其它代谢产物与葡糖苷酸结合后随尿排出。有试验证实,% 的在大鼠体内代谢为%和邻苯二甲酸%,小时后随尿排出。人体皮肤 对的吸收率较低为.//,而以/./的剂量经皮肤给大鼠染 毒,一周后%的随尿排出,%的仍保留在染毒位置,其它组织仅含有小于 .%的。经呼吸道吸入后,在大脑组织能检测到且较其它组织的含量高。 ..酞酸酯的毒理学性质 由于对酞酸酯缩聚物构成的可再生塑料容器对的渗透有非常好的抵抗力,特别适 合于包装饮料、饮用水、食用油等。然而,国家水处理技术专家李仲钦提出,环境激素是 一种有机污染物,它会引起人体致癌、致畸、致突的“三致”反应,对人体的毒害程度名列 五大毒性物质榜首。其毒性主要表现为慢性中毒,危害往往在多年以后才表现出来【。 ‘ 酞酸酯对人类生殖的影响这是当前关注的焦点【,其主要表现在男性精液质量下 降、不育率增高、性腺发育不良、生殖器官肿瘤发病率增加、先天性畸形等【。据调查, 法国男性从.年年来精子数量由个/下降到个/,下降了 近一半且精子活动能力减弱。苏格兰研究表明,年以后出生的人精子数/ 个/比以前出生的人个/显著降低.。除精子数下降,精液量 减少外,精子正常形态率、活动率都呈明显下降趋势。我国男性的平均精子数量仅为 多万个,比年以前少了多万个,每对夫妇就有对不育。 ..酞酸酯在食品中的残留现状 近几年与人类生活与身体健康最为相关的食品和生物中的污染程度也有研究报 道,如陈文锐等 】将市场上出售的来自欧盟国家的奶粉共个样品用正己烷或乙腈振荡 提取,过滤或离心后直接进样用.进行检测,结果显示有种奶粉含有邻苯二甲酸 二丁酯,含量范围为.~./,平均为./。郑力行、诸建辉等将样品匀浆后 加乙腈和正己烷于旋涡混合器上混匀提取,离心浓缩后进行.分析,测定出水产 品中的三种邻苯二甲酸酯。蔡智鸣、王枫华、张前龙等取杭白菊样品采用有机溶剂回 流提取、低温浓缩的处理方法后用..测定和含量分别为:. “以 和士./。蔡智鸣、史馨等采用..技术测定蔬菜水果及干货食品样品 中和的含量分别为./和./。 随着聚碳酸酯塑料制品以及其它高聚物制品的大量使用,双酚和邻苯二甲酸二丁酯 对饮用水的污染已引起世界各国的高度重视。用塑料桶装食用油,食用油中会溶进对人体 有害的增塑剂,由于我国相关标准滞后,这其实只是增塑剂污染的“冰山一角”。增塑剂使 用范围之广,污染面积之大,影响人数之多,比农药、等有过之而无不及。 厉曙光科研小组分别采集了市场上不同品牌和不同出厂日期的塑料桶装大豆色拉油、 调和油、花生油,以及市场上销售的散装豆油、某快餐店煎炸食物的固体起 酥油、居民厨 房抽油烟机收集的冷凝油等检测样品及进行测定后发现,几乎所有品牌的塑料桶装食用油 中,都含有和,食用油中检出的增塑剂主要来源于其塑料容器。 ..酞酸酯残留分析方法 理化检测方法 ?分光光度法 颜文红等人用双波长等紫外吸收分光光度法测定水中的的含量,当含量在 /到/时满足比尔吸收定律。郎庆【等人建立了用荧光分光度法测定环境水样 中的方法检测的检测限为./,线性范围为../,回收率在 ..%。分光光度法具有操作简单,设备要求较低,费用较低且样品无需特别的萃 取处理等优点,但是其检测限较高。 ?色谱学检验方法 色谱学检验方法主要包括薄层色谱检测、气相色谱检测、高效液相色 谱检测、气质联用.、液质联用.等。 等人研究了不同的溶剂配比对酞酸酯的迁移率的影响得到最低检测限为 嵋。陈惠等采用薄层色谱扫描测定塑料食品袋中种酞酸酯、、和, 四种的检出限分别为.、.、.和.且线性关系较好,种样品的加标回收率在 .%.%。但是其存在的问题是薄层色谱的检测限比较高,手动点样精密度和重 现性较差。方法具有设备简便、操作简单易行、费用低廉、可以进行批量处理及适用 范围广且前处理简单等优点。 王明林】等人将蔬菜样品经弗罗里硅土和石墨化炭黑研磨均匀后,用乙酸乙酯淋洗净 化,测定种邻苯二甲酸酯、、、和在.一./范 围内具有良好的线性,样品的添加回收率为%%,相对标准偏差为%%,种 邻苯二甲酸酯的检出限为../。 贾丽【等人采用将塑料样品经粉碎后,用乙醇溶解后超声提取进行高效液相色谱分 析,外标法定量检测塑料中的邻苯二甲酸酯类化合物、、、其检 出限分别达到了.、.、.、.,回收率.%.%。 张副】等人利用反相液相色谱.电喷雾.串联质谱法同时分析了水体中的种邻苯二甲 酸酯、、、、和,检出限分别为.、.、.、.、.、 ./,线性范围分别为.、.~、.、.~、.~、.~/。 色谱法检测酞酸酯具有灵敏度和准确性高等优点作为一种物质残留的确证方法不可 或缺但因其设备昂贵,需要专业的操作人员和复杂的样品前处理等一些不利的因素不利于 大面积的推广。 免疫分析方法 免疫分析技术是基于抗原抗体的特异性及可逆性反应的基础上建立起来的,具有快 速、简便、准确等特点且较仪器分析法又不需要昂贵的仪器设备、专业的操作人员,其对 样品前处理的要求也较低【。 建立免疫分析方法的关键在于具有特异性高的抗体,制备特异性高的抗体的关键又在 于有良好的免疫原,制备良好的免疫原的关键又在于半抗原的合成。 半抗原合成设计的基本原则是半抗原与载体连接后在结合抗原中能最大程度保持和 凸出待测物的结构,特别是立体结构。半抗原一般是由下列结构部分组成:待测物的特征 结构、用于连接特征结构和载体的间隔分子间隔臂和末端的活性基团。间隔臂一般应 江南大学硕士学位论文 远离待测物的特征结构部分和官能团,一般选择.一个碳为宜的饱和链烃。 免疫原的分子量一般在以上。分子量在以下的物质半抗原必须与 大分子的物质偶联后才具免疫原性,分子量介于二者之间的物质,免疫原性很弱,必须延 长免疫时间或与大分子物质偶联才能产生高特异性的血清。酞酸酯分子量在以下不 具备免疫原性,需要分子量大的载体一般为蛋白质进行偶联以共价键偶联,偶联后要 突出其特定的结构或突出这一类药物中共有的特征结构部分,免疫动物后制 备的抗体相应 被称为化合物特异性抗体和簇特异性抗体。 .】等人采用.羟基邻苯二甲酸二甲酯为原料采用一系列衍生化的方法合成了 半抗原后通过活性酯法与牛血清蛋白偶联合成免疫原,通过相同的方法与卵清蛋 白偶联合成包被原。利用制得的免疫原免疫兔子制备多克隆抗体建立了时间分辨荧光免疫 分析方法测定水中的邻苯二甲酸二甲酯的含量。其得到的检测限为./,线性范围 在./至/之间,且与、、、等交叉反应性较好。 .】等人利用碳二亚胺法使半抗原与偶联,免疫制得单克隆抗体以为 标准品建立直接,对酞酸酯的最低检测限为/。 .等人利用.硝基邻苯二甲酸为原料与不同的醇发生酯化反应生成相应 的.硝基邻苯二甲酸酯后经过还原硝基生成.氨基邻苯二甲酸酯的思路合成出了、 、、、等的半抗原后分别与偶联免疫兔子制得多克隆抗体,建立 了竞争方法得到对的检测限为/.,为./,对及 的浓度在.到/可以检测。 等人利用.氨基邻苯二甲酸二丁酯通过重氮化法与偶联制备多 克隆抗体分别建立了抗体包被和包被原包被的竞争荧光免疫法检测邻苯二甲酸二丁酯分 别测得为./、检测限为./和./、线性范围为.一/ 和.~/、交叉反应率..%均小于%。 综上所述,酞酸酯残留检测的方法目前主要有分光光度法、色谱学检测方法及免疫分 析方法等。分光光度法具有简便、易操作等优点但其准确性和灵敏度都较差,色谱学检测 方法具有高的灵敏度及准确性作为酞酸酯检测的确证方法是必要的,但由于设备昂贵、专 业的操作人员及复杂的样品前处理因此色谱学检测方法也难以普及,免疫学检测方法具有 快速、简便、准确、灵敏度高、不需要专业的操作人员、样品前处理操作简单的优点使得 其具有良好的应用前景。利用抗体和纳米粒子结合建立出一些快速简便的检测方法,例如 技术上比较成熟的免疫层析试纸条,染料检测方法及量子点技术应用在酞酸酯的检测上, 利用将抗体与电化学结合而产生的免疫传感器技术也为能快速有效的检测酞酸酯残留提 供了一个有效的工具或者是利用免疫亲和柱富集标准品进行色谱检测。 .本课题研究内容、目标 设计合成邻苯二甲酸二辛酯的半抗原和免疫原并免疫兔子。筛选出具有高特异性的抗 体建立间接竞争法并与../方法做对照。 实验材料与方法 实验材料与方法 .药品与试剂 香港泰兴盛铭精细化工有限公司 .硝基邻苯二甲酸, 正辛醇 国药集团化学试剂有限公司 丁二酸酐 上海化学试剂公司 牛血清蛋白 , 上海伯奥生物科技公司 卵清蛋白, 公司 完全和不完全弗氏佐剂 公司 康成生物工程公司 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 华美生物工程公司 四甲基联苯胺 浙江龙游县化工试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 还原铁粉 国药集团化学试剂有限公司 甲醇 无锡民丰化工厂 氯化铵削 青岛海洋化工有限公司 薄层层析硅胶, 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯 国药集团化学试剂有限公司 正己烷 考马斯亮蓝 上海伯奥生物科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钠?四 国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 国药集团化学试剂有限公司 氯化钠?四 国药集团化学试剂有限公司 硼酸 硼酸钠 国药集团化学试剂有限公司 公司 甲醇色谱纯 乙腈色谱纯 公司 三氯乙酸 南京化学试剂公司 以上试剂若无特别说明均为分析纯 .仪器与设备 石英自动双重纯水蒸馏器 金坛市荣华仪器制造有限公司. .. 。水平摇床 太仓科教器材厂 孔 可拆酶标板 上海吉泰生物科技有限公司酶标仪 公司 可调试移液器 公司 江南大学硕士学位论文 电子天平 上海 .精密酸度计 上海天达仪器有限公司 .紫外扫描仪 日本岛津 .型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 .型定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂 型高效液相色谱一质谱联用仪 美国公司 电热恒温水浴锅.. 上海仪表集团供销公司 上海沪西分析仪器厂 .微型旋涡混合仪 酶标仪 公司 台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂 高效液相 包括 和 质谱仪 公司旋涡混合仪 上海沪西仪器公司 ..低速离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司 型电子分析天平 德国赛多利斯公司 昆山市超声仪器有限公司 .型超声波清洗器 真空旋转蒸发仪 .溶液系统 .,. .磷酸盐缓冲液 ./磷酸氢二钠:磷酸氢二钠.加水至。 ./的磷酸二氢钠:磷酸二氢钠.加水至。 .的磷酸盐缓冲液。 将的磷酸氢二钠与的磷酸二氢钠混合即为 .,./ .硼酸盐缓冲液 ./硼酸钠:十水合硼酸钠.加水至。 ./硼酸:硼酸.加水至。 .的硼酸盐缓冲液。 将.的硼酸钠溶液与.的硼酸溶液混合即为 .包被缓冲液./,.的碳酸盐缓冲液 . . 加蒸馏水至 .的磷酸盐缓冲液 .. /, ‘ . 实验材料与方法 加超纯水,全部溶解,室温定容至,用时稀释倍。 .封闭缓冲液:含%的溶液。 .洗涤缓冲液:含.%.的溶液。 .抗体稀释液:含.%明胶的溶液。 .底物液:液./柠檬酸水溶液:柠檬酸.,超纯水定容至:液 ./ :.?,超纯水溶解后,定容至,保存备 %。 用。使用时,.液与.液混合,加入超纯水及. .:.溶于乙二醇。 .终止液:/的溶液。 .半抗原的合成 邻苯二甲酸二辛酯原药没有活性基团,为了使其具有如羧基、氨基等能够偶 联 蛋白质的活性基团,因此本文以.硝基邻苯二甲酸为原料采用酯化方法使其 和正辛醇进行 酯化反应合成.硝基邻苯二甲酸二辛酯而后将苯环上的硝基还原得到.氨基 邻苯二甲酸二 辛酯作为半抗原。 坠 盐酸 其中可以代表为正辛醇 图.反应.勰图 . ..酯化反应 称取.的一硝基邻苯二甲酸于三颈烧瓶,加入.正辛醇,加入 苯助溶,磁力搅拌,缓漫加入.浓硫酸,加热升温至?,反应,减压蒸去有 机溶剂,将油状残留加入到冷水中并用%的溶液洗至下层水层无色,上层得到 暗红色的油状粗品,用无水乙醇重结晶得到.硝基邻苯二甲酸二辛酯。 ..还原反应 称取的还原铁粉于圆底烧瓶,加入水、氯化铵,水浴加热 。另取.硝基邻苯二甲酸二辛酯.,用甲醇溶解,分次加入上述反应 液中,回流反应。趁热过滤铁粉,将滤液减压蒸馏,得到的橙红色残留用少量 热甲醇溶 解,低温析出.橘红色油状液体.氨基邻苯二甲酸二辛酯作为半抗原备用。 ..半抗原鉴定 将最终样品先进行薄层层析通过相对迁移率值的改变初步鉴定而后用液质 联用.鉴定确证。 江南大学硕士学位论文 .免疫原合成 ?液制备:取.半抗原于烧杯,加入二甲基甲酰胺、.水和 .的/盐酸,形成黄色溶液,冷至.?。然后逐滴滴加/亚硝酸钠溶液, 用淀粉碘化钾试纸监测,直到试纸变蓝灰色停止滴加,下搅拌。 ?液制备:称取的牛血清蛋白溶于 .硼酸盐缓冲液,。保存。 ?在搅拌下,将液逐滴滴加到液,并用/的氢氧化钠溶液调节,使 保持在,?搅拌过夜,即得到免疫原。 ?用去离子水透析.天得到邻苯二甲酸二辛酯.牛血清蛋白.。 .包被原的合成 ?液制备:取.半抗原于烧杯,加入二甲基甲酰胺、.水和 .的/盐酸,形成黄色溶液,冷却至.?。然后逐步滴加/亚硝酸钠溶液, 用淀粉碘化钾试纸监测,直到试纸变蓝灰色停止滴加,?下搅拌。 ?液制备:称取的卵清蛋白溶于的.硼酸盐缓冲液,保存。 ?在。搅拌下,将液逐滴滴加到液,并用/的氢氧化钠溶液调节,使 保持在,。搅拌过夜,即得到包被原混合液。 ?用去离子水透析.天得到邻苯二甲酸二辛酯.卵清蛋白.。 .免疫原和包被原的鉴定 估算偶联物中被偶联的两种分子的比率偶联比的方法,虽然种类很多,但都 是依据 检测偶联物中被偶联的两种分子含量或相对含量的原理建立起来的。分光光度法是利用 物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与 小分子偶联物中,两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱,并表现出图谱迭加的性质。 ..偶联物蛋白浓度测定 采用考马斯亮蓝染色法法确定抗原蛋白质的含量。 配制浓度为,,,,,,,/的牛血清蛋白溶液 .,加入考马斯亮蓝染色液,立即混匀,水浴温热分钟,每个浓度做平行 样。在处测吸光值,绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀 释,在处测定抗原溶液的吸光值,从曲线上得到抗原溶液相应的蛋白浓度。通过乘 以相应的稀释倍数即得到抗原的蛋白含量。 ..偶联比的测定 用甲醇配制酞酸酯类物质溶液,通过紫外扫描可知最大吸收波长,记录吸光值并计算 摩尔吸光系数 。 根据考马斯亮蓝法测定的偶联物中蛋白质的浓度,配制溶液,使两者的蛋白浓度 一致。在波长为~的范围内分别进行扫描。根据参考文献中介绍的紫外分光 光度 法计算偶联比。 实验材料与方法 .抗血清的制备 ..原理:用免疫原免疫动物后获得的免疫血清为多克隆抗体。通常抗原分子具有 多种抗原决定簇,免疫动物后可刺激多种具有相应抗原受体的淋巴细胞发生免疫 应答,因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体,这些由不同克隆淋巴细胞产 生的抗体称为多克隆抗体。 ..免疫方案油包水抗原乳化剂的制备所用的佐剂有助于促进免疫反应,也能起 到保护不稳定抗原的作用,使抗原在体内的吸收期延长,这就可减少加强免疫的次 数,在弗氏不完全佐剂中加入杀死的分枝杆菌或卡介苗就制成弗氏完全佐剂,分枝 杆菌能增强局部淋巴结的反应,扩大免疫原性,从而促进了最终高亲和力抗体的形 成,故首次可以用完全佐剂以后几次选用不完全佐剂。 方法:用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂.混合.的./的免疫原和 .的生理盐水,用注射器混合,将混合好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中,若 一滴乳 化剂状态完整的停留在水面上而不扩散,表明形成稳定的油包水免疫原乳化 剂。 表兔子免疫程序 ..抗血清分离 塑料离心管倾斜度,室温静置,待血液凝固后,冰箱。过夜,血清自然析出。 将血清吸出后,/离心,取上清,与前面吸出的血清混在一起。配制成含.% 的硫柳汞钠盐和%甘油的混合溶液,分装,.。保存备用。 . 抗血清纯化 采用饱和硫酸铵盐析法对抗体进行纯化处理: 盐析:取抗血清,加入等量生理盐水,摇匀后,缓慢加入饱和硫酸铵溶液, 边加边摇匀,充分混合后置冰箱内小时。取出后离心,/,。弃上清, 加入生理盐水,溶解沉淀物后,加入.饱和硫酸铵,使硫酸铵的饱和度达%, 边加边摇匀,充分混匀,置。冰箱内。取出后离心,以%饱和度的硫酸铵溶液洗 涤 沉淀两次。 脱盐:将离心后的上清液弃去,用生理盐水溶解沉淀物,装入透析袋中。以 ./ .磷酸盐缓冲液,冰箱中透析天,每天数次换液,每次。 江南大学硕士学位论文 .间接方法的建立 采用间接方法,方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度,同时测定 抗 抗体的效价,标记的羊抗兔选用推荐浓度:。 、包被:将合成好的.,用包被缓冲液作系列稀释,即:、:、:、 :、:、:,稀释后包被孔酶标板, /孔,于?冰箱过夜; 、洗涤:次日取出酶标板回温至室温,每孔注入 溶液,摇床上振荡, 甩干,重复洗涤次; 、封闭:封闭液封闭酶标板, /孔,?温育箱内孵育后取出后洗涤、拍干; 、一抗:将血清稀释成抗的血清作:、:、:、:、:、 :、:、阴性血清和抗体稀释液, /孔,?孵育后洗 涤、拍干; 、二抗:每孔加入 ,:稀释的标记的羊抗兔,?孵育 后洗涤、拍干; 、显色:每孔加入 显色液与底物液比例为:,暗处?反应; 、终止:显色结束,每孔加入 终止液/的硫酸,用酶标仪测定光密度 值。 阳性血清的值在.左右,同时与阴性血清的值差距最大的抗原包被浓度、 抗体稀释度为最佳工作浓度。 阳性血清的 阴性对照孔的.倍并且大于.,此时血清的稀释倍数即为 血清的效价。 .间接竞争各参数的优化 影响的条件很多,每一参数的改变都有可能产生不同的结果,而且重复性差。 每一个的检测条件都不尽相同,因此,对重要的参数需要多次的实验进行优 化,使 得整个过程在比较适合的环境下进行。一般认为下列参数影响比较大: .包被时间的选择 。 用方阵滴定确定抗原包被最适工作浓度,将其稀释。最适工作浓度包被,每孔 设置?孵育、?过夜和?孵育后再?过夜三种条件,找出最佳包被时间。 .封闭时间的选择 类似方法设置封闭条件分别为?下封闭、和?过夜封闭,以确定最佳封闭 条件。 .抗体最佳工作量的选择 以先前确定包被最佳条件和封闭最佳条件为工作条件,设置个抗体与药物的 工作配 比:、:、:和:,作间接竞争,确定最佳的药物与抗体体积比。 .标准品稀释液甲醇含量的确定 以先前确定包被、封闭和抗体最佳工作量的条件下确定标准品稀释液中甲醇 含量的最 佳条件,设置了标准品稀释液中含%,%,%,%的甲醇四个条件做间接竞争, 实验材料与方法 确定最佳有机溶剂含量。 .最优竞争时间的选择 在药物竞争这一步中,在。下分别分别设置.、和,确定最优竞争时间。 .最佳显色时间的选择 , 将显色时间分别设置为 和 ,确定最佳显色时间。将显色时间分 别设置为 , 和 ,确定最佳显色时间。 .利用间接竞争方法建立标准抑制曲线 对间接竞争中的各影响因素优化后,采用优化的最佳条件建立间接竞争 方法检测的标准曲线。以无抑制时的值为值,相应浓度抑制时的 值为值,以抑制率/为纵坐标,以浓度的对数值为横坐标,绘制标准曲线, 得出标准曲线并得到抗体的、最低检测限和线性范围。 .交叉反应率的测定 利用间接竞争检测的结构类似物对抗体的抑制反应。操作步骤同., 但是包被抗原与抗体稀释度都为工作浓度,并且在加入抗体之前,要分别加 入系列浓度的 邻苯二甲酸二辛酯等其他酞酸酯或结构类似物的标准溶液,即酞酸酯标准品 用溶液 %的甲醇溶液配制成浓度为、.、.、、、、、/的标准溶液。 以空白的值为值,相应浓度酞酸酯抑制时的值为值,以抑制率/为纵坐 标,以酞酸酯浓度的对数值为横坐标,绘制标准曲线,得出邻苯二甲酸二辛酯 的标准曲线。 将.硝基邻苯二甲酸二辛酯、.氨基邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、 邻苯二 甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二己酯五种标准品分别稀释至、.、.、、、、、 /浓度,测定各自的抑制曲线。计算各竞争物的值,并用以下公式计算交叉 %。 反应率:.,%结构类似物/ .确立酞酸酯残留的?/检测方法。 ..样品的前处理及提取净化 将厚度为.至样品,剪成方块,备用。称取预处理好的样品 .一.,用滤纸包好,放入安装好的索氏提取器中。水浴加热索氏提取器,水浴 温度 控制在。,用::抽.。回收提取液转移至容量瓶中,然后 加入色谱纯的甲醇并定容,此时会有少量析出,将溶液于/的速度离心, 过滤,备用。 .. /方法 ... 条件 色谱柱: ,岬,. 流动相:醋酸铵的超纯水溶液/体积比的甲酸 流动相:甲醇 流速:./江南大学硕士学位论文 梯度洗脱程序: %,.. %.%,.? %,. %.%,.. % 柱温:常温 进样量: ...质谱条件 离子源:电喷雾离子化电离源,正离子监测即 扫描方式:选择离子检测 电离源温度:。,去溶剂温度:。 雾化气、鞘气为高纯氮气,碰撞气为高纯氦气 喷雾源气体流速/,去溶剂气体流速:/ 喷雾电压、碰撞电压等电压均优化至最佳灵敏度 选择离子条件见表?。 表 ./法测定酞酸酯的电喷雾离子源的设置 / 实验材料与方法 邻苯二甲酸二环己酯,,,. 邻苯二甲酸二辛酯 ,, . 邻苯二甲酸二异葵酯 “ 丝窆,,, . 邻苯二甲酸二异辛酯 ,,. 秘苯 徽丁 糙基 酯 酊酯 肌 批 圳唧咖 盼卿 混标做液质时它出现个分峰。它是第二个峰 ..标准曲线的绘制 配制./的各种酞酸酯储液再用甲醇色谱纯稀释得到/中间标准溶液。 再将此溶液混合并用甲醇稀释得到各种所需浓度的混合标准工作溶液。 以流动相稀释酞酸酯中间标准溶液得到、、、、、/系列混合 标准溶液。每一浓度进样两次,以此标准工作液的浓度为横坐标,各种药物的 定量子离子 的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。 ..样品的确证 用/对样品的确证需满足三个条件:、待测样品的保留时间与外标标准 样品的保留时间偏差小于或等于正负.%;、选择定性离子/特征离子对的信 噪比/大于;、与外标标准样品相比,样品中待测组分的两个定性离子的相对 丰 度比在许可的范围内。 江南大学硕士学位论文 ..定量分析 以各酞酸酯的特征离子对中信号响应最高且无干扰的/离子对为定量离子,进行 外标法定量分析。具体方法为:运行工作站软件,以一系列不同浓度的标准溶液的特征离 子对的信号响应值建立强度.浓度校准工作曲线,将样品与此对照得到定量分析。 ..检测限的测定 计算空白样品在预期保留时间范围内定量子离子的三倍信噪比所对应浓度,得到对样 。 品的定性检出限, 计算定量子离子的信噪比,以信噪比大于计算所对应的添加浓度,取个平行空白 样品进行添加回收测定,按照...和...方法处理净化样品,测得基线噪音平均 值,如符合..要求,则定为定量检测限, 。 ..添加回收率的测定 称取.聚氯乙烯,加入的酞酸酯标准工作溶液,得到/浓度水平的添 加样品,进行添加回收实验。样品设置次重复处理检测。 .两种方法的相关性比较 采用?方法对间接竞争和...进行实验数据相关性的评价。 结果与讨论 结果与讨论 .半抗原的鉴定 .. 一硝基邻苯二甲酸二辛酯的鉴定 .硝基邻苯二甲酸二辛酯的结果分析 .硝基邻苯二甲酸与反应产物分别用少量甲醇配成溶液,毛细管在硅胶板上 离底边 处点原料液、反应液两种样品,层析液为乙酸:正己烷,体积比为:,在波 长观察,反应液的迁移率值和原料液的值不同,初步表明有新物质生成。 .硝基邻苯二甲酸二辛酯的结果分析 即? .“ . 《 . .? . .? . : 月 . .? 芦.一硐 。妒 妒. ~ 江南大学硕士学位论文 稿肇各畚二??二毒壕 ? 粥 期揖 再图液相图;正离子液相质谱图紫外图 . 图.中,图是在紫外吸收波长的液相色谱图,其在保留时间.有一 峰形尖锐、对称的峰出现,表明此时间段,有较强紫外吸收的物质出现。图是 在分子离 子的正离子液相图其主要峰出现在保留时间.时,故而通过图和图互为应 证得到第一步酯化反应成功。图为的质谱图分子离子主要出现在符合 的分子离子的特征,推测它为【】,为】。图为的全程紫外吸收图 说明的最大吸收峰在。由于.硝基邻苯二甲酸二辛酯结构的原因,负离子液 相中并没有产生吸收峰。通过?的鉴定说明已经合成出.,第一步酯化反应成 功。 .. 一氨基邻苯二甲酸二辛酯的鉴定 .氨基邻苯二甲酸二辛酯的结果分析 与反应产物分别用少量甲醇配制成溶液,毛细管在硅胶板上离底边处点 溶液和反应液两种样品,层析液为乙酸:正己烷,体积比为:,在波长观 察,反应液的值和的值不同,初步表明有新的物质生成。 .氨基邻苯二甲酸二辛酯的.结果分析 ? 结果与讨论 氨基邻苯二甲酸二辛醋加 撑 : . 型岛、【:. 哩?? /.一.. ? 搿 .氨基邻苯甲酸二辛醋 图正离子液相图;质谱紫外图 . 图.中,在正离子液相图中可以看到在时间为.的时候,有一个较强的峰, 表明在此时间段,有较多的正离子碎片出现,产物的相对分子质量为,进行质 谱分析, 从.的正离子全扫描可以看出,含有相对分子质量为的碎片,推测它为】。 液相、质谱图相互应证,由于.氨基邻苯二甲酸二辛酯结构的原因,负离子液 相中并没有 产生吸收峰。图表明最大吸收峰在处。通过.图进行确证合成出 .氨基邻苯二甲酸二辛酯。第二步还原反应成功。 .免疫原的鉴定 .. 免疫原的鉴定 .紫外扫描的结果分析 从图.可见,在整体的曲线上看,.曲线在.左右兼具了 以及的光谱学特征并且有相应的光谱叠加的情况。在处.的吸 收值与比较明显出现了吸光值减小的情况,而在的吸收曲线上,说明 这一吸紫外吸收带与的紫外吸收叠加效果明显。并且.在后具 有与相似的吸收,而在后是没有吸收的。由以上分析,可以认为 与偶联成功。 江南大学硕士学位论文 肋 肋 泐 嘲 湖 嘲 鼬 图川考马斯亮蓝标准曲线 . 考马斯亮蓝.试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高,最低测试蛋白质量在左右。 本实验考马斯亮蓝方法建立标准曲线见图,测定的蛋白浓度为./,浓度高于 免疫浓度达到要求,免疫原用时使用生理盐水稀释至/。 .的偶联率的测定 摩尔吸收系数 :配制.氨基邻苯二甲酸二辛酯浓度为,,,“的% 乙醇溶液,通过紫外扫描见图.可知.氨基邻苯二甲酸二辛酯的最大吸收波长 为, 在处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为: 吸光值/摩尔浓度。 结果与讨论 本实验计算得./。 偶联比测定:配制/牛血清蛋白的%乙醇溶液,将偶联产物用%乙醇稀 释到,在处测吸光值,以%乙醇为空白,测出的吸光值为,,则 偶联比率为:厂?一/×。/,本实验计算得?。同法估算? 中,?.。 ..讨论 抗原设计的好坏最终会在抗体制备和测定方法中体现出来特别是方法的检测限和选 择性。理想的交联复合物不仅要保持小分子的特征结构特别是立体化学特征,还要保证 小分子的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞所识别和结合,这样才能制备出具有预期 选择性和亲合性的抗体。本论文设计免疫原时,主要从以下几个方面来考虑: 载体的选择 多肽和蛋白质均可作为半抗原的载体。一般实验室常选择蛋白质作为与半抗原交联的 载体,如球蛋白片段,血清蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、甲状腺球蛋白和纤维蛋白原。蛋 白质类载体不仅具有很强的免疫原性,同时,它们表面或一端具有自由氨基 和自由羧基, 很容易和半抗原结合。而且,蛋白质的溶解度较大,即使溶液中含有一定浓度的有机溶剂 如吡啶、二氧六环、二甲基甲酰胺等,交联后的复合物仍可保持可溶状态。因此,蛋白 质是制备半抗原结合物首选的优良载体。和价廉易得,溶解度较大,本论文即 选择此两者为载体。 交联方法的选择 半抗原分子结合到载体蛋白分子的方法种类很多,常用的有碳化二亚胺法、戊二醛法、 混合酸酐法和重氮化法,根据半抗原分子上的功能基团选择合适的交联方式。但是.氨基 邻苯二甲酸二辛酯为苯环上的氨基应采用重氮化法进行偶联。 重氮化法:含芳香氨基的半抗原可与亚硝酸钠反应生成重氮基,重氮化产物与蛋白质 的水溶液中进行,在低温条 分子中的组氨酸、酪氨酸、赖氨酸进行连接,反应在 件下反应迅速完成。采用重氮化法与交联。借鉴国外的相关文献,本论文亦采 用重氮化法合成免疫原.。通过紫外扫描来鉴定交联产物,结果表明这分 子确实已与分子结合。动物实验,证明两种偶联物能够刺激兔子产生高效价的、针对 性强的抗体,表明重氮化法是合成免疫原行之有效的方法。 最佳交联数目 每分子载体上结合半抗原的分子数,即两者的偶联比,对抗体的产生也有一定的影响。 结合数目过多或过少,都会减弱免疫反应,不利于诱发抗体的产生。但是,每个载体分子 上结合多少个小分子最佳,不同的实验,有不同的答案。一般认为,每个蛋白质分子上结 合、一个半抗原分子比较合适。 偶联比的测定方法有很多,比较简便和常用的是紫外分光光度法。 紫外分光光度法估算偶联比是根据大分子与小分子肽类除外的偶联物中,若两种分 子均有各自不同的紫外吸收峰,并且,在偶联物的紫外扫描光谱中表现出各自光谱图叠加 的性质来估算的。首先,测定结合物中的蛋白质浓度,然后调整结合物的浓度使之与载体 江南大学硕士学位论义 的浓度相同,分别测定半抗原、载体和结合物的光谱吸收曲线。在半抗原的特征吸收峰处, 根据光谱图叠加的性质可以算出结合物中半抗原的浓度,即可求出偶联比。依照该化合物 的摩尔吸光系数和吸光度的比值,便可算出结合到蛋白质分子上的半抗原分 子数。详细计 算方法见前述。 .抗抗体的效价和工作浓度的测定 第五次免疫后第天耳缘静脉采血,进行效价测定。测定时均以免疫前所采血清作 为阴性对照,每个样品重复三次,各兔血清效价结果见表.和.。由于第五次免疫后, 效价没有提高,反而有下降的趋势,所以第五次免疫后两个星期进行冲刺免疫,免疫后两 天进行心脏取血。 表 号兔抗血清效价的测定妯 .. ’ 抗体\包被原 表 号兔抗血清效价的测定蜘岫 .. ’ 只兔子号和号的抗血清分别做间接实验:将作为包被抗原, 并用包被缓冲液配制成/溶液,继而系列稀释成:、:、:、:、:、 :,抗的血清作:、:、:、:、:、:、: 稀释。用方阵滴定法确定包被抗原、血清的工作浓度及效价,结果见表.和?。根据 检测的要求,选择吸光值在.左右时的抗原抗体浓度为最适工作浓度,则号兔 二结果与讨论 包被抗原稀释度为:,抗体浓度:;号兔包被抗原稀释度为:,抗体浓度 :。若以阳性血清的~?阴性对照的.倍且吸光值大于.抗血清的最大稀释倍数 作为抗血清的效价,由测定结果可知号兔抗血清的效价较高为,号兔抗血清效 价为。 . 各参数的优化 本实验分别对下列参数进行了优化。实验完全按照优化的顺序进行。每个参数的优化 都采用了之前优化的参数作为实验条件。评判的依据很多,本研究采用、觚以及缸/ 来作为整个优化过程的依据。是个很重要的参数,很多文献中都用此来作为判断 依据。 .包被时间的选择 不同包被时间的选择见表.,由表可见在条件孵育和?孵育后过 夜的觚/值很接近,而条件过夜的?值最大,为最合适包被条件。 表弼包被条件的优化 ..封闭时间的选择 不同封闭条件见表,由表可见下封闭和过夜封闭这两种条件戤/ 值都不是最理想的,所以下封闭的条件成为最合适封闭条件。 表纠封闭条件的优化 ..抗体最佳工作量的选择 抗体与药物不同配比见表.,由表可见抗体的工作量太高或者太低都会影响 ? 值,而抗体配比为:时候值最大,为最合适抗体工作量。 表抗体工作量的优化 .江南大学硕士学位论文 .标准品稀释液甲醇含量的确定 标准品中不同的有机溶剂的含量见表.,由表可见甲醇的含量太高或太低都 会影响 舣/值,甲醇含量%时值最大,为最合适的标准品的稀释溶液。 表“甲醇含量的优化 ..最优竞争时间的选择 不同竞争时间对反应的影响见表.,由表可见经过,?值最大因此选 择作为竞争的最佳时间。 表”竞争时间的优化 ..最佳显色时间的选择 不同显色时间对竞争反应的影响见表.,由表可见,显色时间后一值趋于 稳定,而值变化不大,因此显色达到最佳。 表瑚显色时间的优化 . .优化后的 经过上述的优化,建立了间接的检测方法,具体的操作如下: .取两条孔的酶标板,以最佳包被浓度:对.稀释并进行包被,. /孔,分别设置两个平行于冰箱过夜,次日取出酶标板回至室温,每孔注入“ 溶液,摇床上振荡,用力甩掉洗涤液,在吸水纸上拍干,继续洗涤次。以下洗涤 方 法相同; .充分洗涤后,用封闭缓冲液封闭酶标板,弘/孑,于孵育后取出洗涤、 拍干; .第一排加抗体稀释液,第二排起分别加个浓度的标准溶液标准品稀释液含 有 结果与讨论 %的甲醇,/孑。以最佳稀释度:稀释抗体,/孑,于振荡器上充分振荡, ?孵育后洗涤、拍干; 后洗涤、 .每孔加入,:稀释的标记的羊抗兔,?孵育 拍干; ,取出 .每:入显色液与底物液比例为:,暗处?反应 后每孔加入“终止液/的硫酸,用酶标仪测定吸光度。 在上述的各优化条件下,建立间接竞争法测定的标准曲线。为了各点的 连线平滑,更接近于真实的标准曲线,通常在一定浓度的范围内作一条平滑 曲线,使标准 点吸光值尽可能多的落在曲线上,即进行标准曲线的拟合。通过在最优条件 下测定 的抑制率得到以下结果,见图?,从图中可以读出为./,为./, 线性范围.为/。完全符合对检测要求。 图.利用间接方法测得的的标准曲线 . .交叉反应 间接反应的特异性有交叉反应率来体现,因此,我们利用制备好的抗体在. 操作条件下对及其代谢物进行了交叉反应率的测定,结果如表.。 表利用间接测定抗体的交叉反应率 . ?江南大学硕士学位论文 间接竞争测定抗体特异性结果见表。列出了的结构类似物和衍生物, 抗体除了对.硝基邻苯二甲酸二辛酯和.氨基邻苯二甲酸二辛酯存在较高的交叉反应外, 与结构相似物的交叉反应均小于%。说明抗体对有较高的特异性。 . 种酞酸酯的标准色谱图及质谱棒状图 在..所述的液相色谱和质谱条件下,种酞酸酯标准品溶液及聚氯乙烯空白和聚 氯乙烯加标的标准离子液相色谱见图.。从图中可看出种酞酸酯色谱峰峰形尖锐且对 称,噪音较小,在多反应监测模式下检测,可为定性定量分析提供了足够的分子 结构碎片和信号。酞酸酯在正离子方式下表现出很强的信号响应且在一级全 扫描 图谱中,除了的基峰为【】外,其余种酞酸酯的基峰均可质子化为准分子离子 峰【】。以】或】作为母离子进行得到各酞酸酯的二级质谱图, 如图.。选择灵敏度较高的子离子进行定性定量分析。 ?哪们 瓣镯’搿潮标措蚪寞 矿’时’’’’’??‘。蚶涮。?拍。?’一’口誓 结果与讨论 ,刚 . 图标准毫子色谱图 . . 图中的和标准溶液中各酞酸酯的保留时间一致且峰面积基本一致可以用 ...检测此实际样本。 譬童 ? 习页一麟.’ : 薹 瓦蝌导。.... 目 莲 : 习 天晰巍 : ?? ?二 芝一: ~一仃凝:『。 ’?‘?‘?乞??’赫’一?幽二’’~.幽 设 习 蠢。漱 蓁 夏亨 疰 垦 ? 巍 习 页 ? 薹 “ ?? 挣 :’‘‘。。试’’’幽’’’。’’’’“ 一几糕 ?? ’??‘’’‘??。’?‘?江南大学硕士学位论文 :品墨嚣,;‰嚣‰。。。 娑”“”“州 ? 叫 戳 觯 ? 习 蠢 ’倒 伯‘ ? 疽 戮 薹 一 ? 一 溅 : ? 叫 ?? .: ? ?. ? 懈 ?? “ ? ~几黧 。 ?。’ ’‘’ ’“’’ : ? ? ??? ??? 嚣嚣黝搿甓 埔’?嘶。’辨肘‘。。州??‘‘ : ‘ 昝 漱 ?: ? 页 ?; 一 种 ? 遢 警二。 薹 主 ?? 宴 灭瓣漱 ?: ? ?? “ .三 ? 一 ?”? ,‘? . 瓣 ?? ’’’;。。’???’。’’。 一几戮:『。 自一;品嚣盏,;二誊:螂弧,??.一博,?. ’?墨蠲 ?? ?‘ 习粉 ? ?? 噼 州 习.时徽: 疰 通一一器: : ‘ 黼: 叫 习 俏 酝: 訇 ? ??一 ,? ? ?膏?爿??耵 ??,??口撕??扣?捌埘.一???糟,??嘲???嚆? ? ?湮 擀 习 四。 习 直 兰 癌 遏一鹣: : 溉: 雪 : 靛: :耋 习 .: ?‘霉 ?蟮‘? ? 一‘?‖。‖ 江南大学硕士学位论文 ????????????一 ??“?翻 ?对?搿吃?哪 ?? 譬”’‘“”’“ ? 一 习瓣 ?? 酬” 耋 ??肇: : 一 融一 一 妻 崩 一?? 一 “ 四赫? 萄 萄??. ? ? ? ? ? 霄 。“’鲁 ?。’南乜’’幽’’。。粕 ?? 图. 种酞酸酯的电喷雾二级质谱图 . 种酞酸酯的电喷雾的二级质谱图的碎片离子峰和理论计算的碎片离子峰具 有一致 性。选择各酞酸酯的特征离子对中信号响应最高且无干扰的/离子对为定量 离子,进 行外标法定量分析。 啊?嚼.硝?眨?..’’ 口 , 廿 ’ 帆四 图 /的种酞酸酯的./总离子色谱图 . / . ?方法的线性范围、回收率、精密度和检出限 对空白聚氯乙烯进行/浓度水平的酞酸酯添加回收实验,按照..方法处理 净化样品,用在选定的条件下,方法的回收率及精密度、检出限及可接受的标准曲线相关 系数的范围值见表.。结果与讨论 由于酞酸酯作为增塑剂等在日常生活中广泛应用存在,且极易分解溶出,因而酞酸酯 的添加回收率极易受到各种复杂因素的影响。在实验过程中应尽量避免使用任何的塑料制 品,应使用玻璃器皿,且所用的玻璃器皿要用清洁剂洗,再用水洗、丙酮洗,然后分别用 重蒸的正己烷和二氯甲烷清洗两次,在?至少烘焙,然后保存在干净的铝箔中备 用。然而液质联用系统中也有很多管道是塑料制品,因而酞酸酯的回收率不可避免受到较 大影响。同时实验所用的试剂也有很多酞酸酯的残留,尤其是正己烷和甲醇 中的酞酸酯含 量很高,但是酞酸酯却很难从试剂中完全除去,因此试剂对酞酸酯的回收率和检测限影响 很大。在日常生活中分布最广泛,所以其噪音背景也最高,色谱纯的甲醇中含的 非常高,导致最终的检测限也非常高,而且不稳定,达到~。 . 样品的前处理 酞酸酯类物质一般分子量较大且不易挥发,所以./是对其污染残留进行确证 分析的理想方法。 因为酞酸酯类物质是弱极性的,根据相似相溶性的原理,应该尽量用弱极性的有机溶 剂进行提取。为此曾用过正己烷直接提取聚氯乙烯中的酞酸酯,然后离心取上清液真空旋 干并用色谱纯甲醇溶解旋干物定容进样。结果发现正己烷对和等会构成很大 的污染,即使正己烷像有些文献说的那样重蒸过,其背景仍然很高。因此正己烷不适合用 于本实验中要同时检测的种酞酸酯的提取回收。 设计了空白实验对比,发觉进样前用塑料注射器过膜时,会对回收率有影响,即噪音 背景偏高,因此在前处理过程中不能过膜,但要尽量在分层沉淀离心中使最后的提取液澄 清而不带颗粒杂质,以