【doc】毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和脱氧核糖核酸的合成产物

【doc】毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和脱氧核糖核酸的合成产物 毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和 脱氧核糖核酸的合成产物 第24卷 l996年3Jf】 舟圻化学(FENXIHUAXUE1究简援 C]:{J~eseJeurnal0fAnalyticalChen:istry 3 毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和 脱氧核糖核酸的合成产物z ,/, 兰重夏林睫姚开泰,,蕊j 研究所,长沙4i.078).,f 摘要表文将毛锢舒凝脏电溶方法用r低聚l忮苷酸豆DNA台成产物的分离{盘测.井掠_l 了低聚棱苗酸构精度与茸碱基数的戋系噩迁移时郓相对迁移时的重现性 关键词毛磐B管凝腔电泳.低聚核苷酸,脱氯棱糖梭酸 l引言 基因搽针阳DNA扩增引物均为低聚桉苷酸目前大都采J_i=I液相包谱法和平板凝胶电泳 法分离检测.这些方法操作麻烦,分析时问长因此,发展一种高敏,快速分离俭删低聚梭苷酸 的新方法在生占f『科学中具有重要意义 毛细管凝腔电泳分离效率高,能区分相差一个碱基的核苷酸.为低聚核苷酸提出一?币{:高 赦,快速的分离检测方法.然而凝胶住制备困难.限制了这种方法推广应用.最近研究结果表 fI,毛细管凝腔柱制备失败原因主要在于丙烯酰胺在聚合时严生气泡阳收缩.本文 总结了凝腔 柱制备失败原因,参照文献:2]凝胶牲的制备方法,成功地制备了毛细管凝胶柱,用]:低聚核营 艘和DNA产忉的分离检测,获得彳艮高的分离度和重现性. 2实验部分 2.1仪器与试剂 P/ACE5500型毛细管电泳仪(羹国.贝克曼公司).带有二极管阵列捡测器.pHS一2C型精 密酸度计(上海雷磁仪器厂). (dA)…(低聚脱氧核腺苷酸片段和橙G(orangeG,f目标物)均由贝克曼公司提供.其余 低聚核-ff酸自行台成(由DNA合成仪合成)(y一甲基丙烯酰)丙基三甲氧硅烷.丙烯酰胺.N, N..四iI]基乙二胺(TEMED)过硫酸铵.NN一二甲基双丙烯酰胺(BS)均为Sigma公司 产品其它试刑均为国产分析纯.缓冲溶液为90mmol/LTris90mmo1./L?3BO一2mmo[/L EDTA(pH一8.5.Tris,三(羟甲基)氟基甲烷). 2.2毛细管凝胶柱制备方法 毛细管}_乇57Cn:,有效长度50cm.内径1O0,RIB(河北永年光纤厂).参照文献"方法制 备聚丙烯赋职毛细管凝胶柱.首先用lmol/LNaOtI溶液{洗毛细管2Om[n.再用蒸馏水冲 洗10I【l『)-j将(y甲基烯酰)丙基三甲氧醚烷与甲醇混合液(1;1)注入毛!管牲中.放 置了3h后,J{:蒸馏水冲洗5min.将含7.76丙烯酰胺,3Bis(占丙烯酰胺和Bts的总量的 3)和一定量的TEMED的缓冲溶液超声脱气5rain后.加入一定量的过硫酸铵溶液,混合后 立注入毛细管中,于常温下聚台以上冲洗和注柱均在P/ACE5500型毛细管电泳披上借曲 199504—14l幅{lq95n28接受 * 中国陴士后盘台资助谋题. 第3期任吉存等;毛细管凝硅电慷分离和垃侧低聚核苷酸和髓氧晦精棱酸约?成物331 于压力冲洗过程完成.聚台好的毛细管柱在冰箱4,8Crf】放置两天后可使用. 2.3毛细管电泳方法 新{备的毛细管凝胶柱在进行样铀分离前,需要坝电泳以除去凝脏【十一聚台f=j舒1的"杂 质",使电泳池中的缓冲溶液组成与凝胶巾缓冲溶液尽可能j=HJ耐.在预电泳中.分段逐步增加电 泳电压直到分离中所需的电压,时问约为1h在7.skVl进样3s.蹲次电浓结求后再电环 l0rain舌进行进样.保持较好的重删性 3结果与讨论 3.L检测波长的选择 紧丙烯酰胺凝腔桂在紫外区有较强的吸 收,采f二板麓阵列睑删器获得棱苷酸在聚丙 烯酰胺凝腔巾吸收光谱.结果如图1所示. 由图1可见,棱苷酸在该介质中最大吸收 位1:260tm处.实验巾检测波长选为2601 3.2低聚核苷酸的分离 图2为低聚核苷酸的电泳图谱.由恩2可 见.在臻雨烯酰胺凝腔中,(dA).(共21个片 a/nm LJl救l上一l呲般_rl, Fig.1Absorptionspectrumof(Jg()}()tlticl[1 polyacrylamidegel 段.每个片段相差一一个碱基)得Ye,J~4好分离.图3为低聚脱氧腺苷酸的迁移时问r)与对应的 碱纂数目()(或休聚台度)的关系,在这种凝胶介质中.棱苷酸的迁移时间与碱基数目响l 议好的线性关系.饺正曲线方程,一0.327n一20.848(r二=0.99997)低聚榜酸片段的捎度(") 与其对应的碱基数目的倒数校正曲线方程为"一1.820×10/,J十4.842yj0(r一0.998)从 围3和校正曲线方程可知.核苷酸在毛细管凝胶介质中电泳行为完全符合偏箍艘行』? "J 仳棠挂苷酩浩谙 , 圈3tdAJH段吐傍:tnJ』k., Fig.2E1ectrophoIegram0f0】igonu一.'一一 c]eot_【jesFig-3ThereIa*ionshipbetweentilechalr~]cllgl1andche 电诛条件(condition*):缓冲落藕(buffer):90miRrati0ntmc0ho不Iod,gcamerff!cny~icc1A一Jid :"H1电2(……2)10×mol/LNazH?Y;电压(v.Itage):15.?"…"""……?ig kv,12j土"1c:样品总浓窟t?a{u】1 ".n"jJt1…fcdA】-j:20m,L. 332分析化学第24卷 3.3DNA合成产物的检测 DNA合成产物为低聚核苷酸,主要作为基因探针和PCR反应引物.需要对合成产物的纯 度进行检测.目前主要采用紫外吸收法和 液相色谱法进行检测.紫外吸收法只能粗 略估计DNA产物的浓度,不能检测其纯 度.液相色谱方法操作麻烦.我们将毛细 管凝胶电泳方法成功地用于DNA产物的 检测,结果如图4所示. 3.4迁移时间和相对迁移时间的重现性 表1表示了3种低聚核苷酸在同一根 毛细管凝胶电泳中迁移时间和相对迁移时 间的重现性.由表1可见,在聚丙烯酰胺凝 胶介质中,低聚核苷酸相对迁移时间具有 很好的重现性.实验表明凝胶柱寿命一般 在5O次以上(每次约40min).但对于不 同凝胶毛细管,迁移时间的相对偏差为 8左右.但相对迁移时间的相对偏差小于 1. 2030 图4DNA台城产物电泳l Fig.4E]ectrophoregramsof DNA~ynt]xet[zer 电诛兼件与围2相同(conditionsasinF.2),产物序列(se quenceofDNApredu~ts):A.TGCTGCTCCC CTCC'IGCCAC}B.CAGTAACAGGTAATCTCTGG}C. CGCGCA1AATGGCGGACC 表1迁移时间和相对迁移时间重现性 Table1Thereproducibilityofmigrationtimeandrelativernigratiorttime(5) 低聚棒苷酸序列和电泳条件与围4相同(sequenceofollgonueleotide(A,B,c)andltoph0州l.dl1].nsRS inFig4). 参考文献 CohenAS,PaulusA?KargerBL.Chrontalog~raphia,1987,24:15 BabaY,MatsuuraT,WakamoteK,TsuhakoM.Ch.L".,1991:19口 ArakawaH,UetanakaK,MacdaM.TsujiA.JChromatog1.,1994,644:89 LumpklnOJ,DejardinP,ZimmBH.Bioplymers,1985-24:1573 Separationof0ligOnucleOtidesandProductsFromDeOxyrjbOnucleic AcidSynthesizerUsingCapillaryGelElectrophoresjs RenJicun,LiZhongkui—Xialinqlng,YaoKaita[ (CancerResearchlnstilute-tlunan~,ledicalUniversily,Changsha410078) AbstractInthispapercapillarygeleleetrophoresisisemployedtoseeoligonueleotide andsoftieproductsfromDNAsynthesizer.Therelationshipbetweenmigrationtinleandbase numbersofol】 gonuc1eotidefragments,andthereproducibilityofmigrationtimeandrelative migrationtimehavebeeninvestigated? KeywordsCapillarygeleIectrophores,olig0nucleotide,deoxyribonucle;cacid (Received14April1995:accepte~f鹅J1995j