胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究 胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛 素分泌细胞分化的实验研究 生物医学工程与I临床2007年3月第l1卷第2期BME&ClinMed,March2007,Vo1.11,No.2 胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞 向胰岛素分泌细胞分化的实验研究 周光纪,徐海伟,屈纪富,杨丽 一 143一 ? 细胞工程? 摘要:目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导,为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础.方法将 胚胎干细胞(ESC)在成纤维细胞(MEF)饲养层上扩增后脱离饲养层,让ESC自发分化成拟胚体(EB),再将EB诱导为 巢蛋白(nestin)阳性的神经前体细胞(NPC),最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞(IPC).结果ESC在MEF饲养层上扩 增4d后,在悬浮培养状态下自发分化为EB.将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后,ESC先分化为上皮样细胞, 再分化为神经细胞样细胞.经过nestin免疫组化.在经过NPC培养基诱导4d的细胞,nestin阳性细胞占86.5%. nestin阳性细胞在[PC选择性培养基中诱导5,6d后,可分化成胰岛素分泌细胞.结论ESC来源的nestin阳性细胞 既可以分化为NPC.也可以分化为IPC. 关键词:胚胎干细胞;神经前体细胞;巢蛋白;胰岛素分泌细胞 中图分类号:R318.15文献标识码:A文章编号:1009—7090(2Oo7)02-O143一o4 Experimentalstudyonembryonicstemcellderivednestinpositivecellsdifferentiatedintoin sulin-producingcells ZHOUGuang-jP,XUHai—wei2QuJi— fu3,YANGLi(J.DepartmentofPhysiology,GuangdongMedicdCollege,Guan~hou 524023,Cu~gdong,China;2.DepartmentofPhysiology,TheThirdMUU~yMedicdUn&e~hy,Chongqing400038,China;3. EmergencyDepartment,SouthwesternHo~ital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China) Correspondingauthor:.ZHOUGuang-ji Abstract:ObjectiveTostudy山einductionofembryonicstemcelltoinsulin— producingcellsandestablishthebasisforcell transplantationthempyindiabetes.Me~odsEmbryonicstemcells(ESC)wereamplifiedfor4daysinmouseembryonic fibroblastfoedlayer(MEF),tllentlleamplifiedESCsweredetachedfromMEFandculturedinsuspensionculturestoform embryoidbodies(EB).TheEBwerecultivatedinneuralprecursorcellselectivemediaforabout4to5daystodifferentiateto neuralprecursorcells.Byaddingnicotinamide,betacellulin,activin— A,hepaticgrowthfactorandglucoseinserumfreeinsulin— producingcells(IPC)selectivemedium,tlleditllezone—positive ?.Cwereharvested.ResultsTheEBdifferentiatedinto endothelia-likecellsintllefwst2days.Theendothelia—likecellsdifferentiatedintoneuron —likecellsatlaterculture.86.5%0f tlleneuron-likecellswerenestinpositive.Thenestinpositivecellsdifferentiatedintoinsulin—producingcellswhenexposedin insulin-producingcellsehctivemediaforabout5to6days.ConclusionItiSdemonstratedtllattlleembryonicstemcell derivedneonpositivecellscanbeinducedintoneuralprecursorandinsulin—producingcells. K呵words:embryonicstemcell;neuralprecursorcell;nestin;insulin—producingcell 胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)是来源于 早期胚胎内细胞团的全能型未分化细胞.在适宜的条 件下,ESC可分化为人体各种组织细胞.将ESC定向 诱导分化为人们希望得到的细胞或组织,用于替代修 复病损的组织器官,将有可能使某些疾病彻底治愈【1]. 作者单位:1.广东医学院生理教研室,广东湛江524023;2.第三 军医大学生理教研室,重庆400038;3,第三军医大学西南医院急诊 科.重庆400038 收稿日期:2006-10-12;修回日期:2006-11-27 作者筒介:周光纪(1960-),男,云南楚雄市人,博士,副教授,主要 从事干细胞和组织工程方面研究. 基金项目:国家自然科学基金(30200129) 通讯作者:周光纪 由于对胚胎发育分化的机制所知甚少.ESC的体外定 向诱导还处于探索阶段.深人开展ESC分化的研究, 对于阐明胚胎发育和细胞分化,乃至于细胞癌变机制 都有重要意义.此前,笔者所在的研究小组已将ESC 定向诱导为巢蛋白(nestin)阳性的神经前体细胞 neuralprecursorceils,NPC),用于大鼠帕金森病 (PakinsonSdisease,PD)的治疗,并取得一定疗效圆.近 来的实验发现,胚胎干细胞源性nestin阳性细胞可以 被诱导分化为胰岛素分泌细胞(insulin—producing ceils,IPC).这不仅对了解ESC和NPC的分化有重要 意义,也为糖尿病的治疗带来了新的希望. 1材料与方法 —.144——生物医学工程与临床2007年3月第11卷第2期BME&ClinMed, 兰!!:!!!!:三 1.1药品试剂 DMEM高糖培养基(GIBCO公司).DMEM/F12 (1:1)培养基(Hyelone).优级胎牛血清(Hyelone公 司).优级新生小牛血清(兰州民海生物工程公司).胰 蛋白酶,N2,B27,双硫腙,纤维连接蛋白,多聚鸟氨 酸,烟酰胺(Sigma公司),碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF;GIBCO公司).活 化素A,B一细胞素和肝细胞生长因子(Merck公司). 重组人白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor, LIF;Chemicon);巢蛋白(nestin)抗体(Pharmergen).兔 抗鼠胰岛素抗体,cy3免疫荧光组化试剂盒,ABC免 疫组化试剂盒(武汉博士德).转染绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein,GFP)基因的小鼠ESC 系MESCPU35(ESC/GFP)由北京大学生命科学院引 进,笔者实验室鉴定,保存. 1.2方法 1.2.1胚胎干细胞的培养,扩增和鉴定 按笔者研究组以前报道的方法制备小鼠胚胎成 纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEF)饲养层, 培养扩增ESCm.ESC每4d左右可传代1次.根据 ESC的生长状态不同可按l:3,l:6分瓶传代扩增. 根据细胞集落的特殊形态,GFP的达和碱性磷酸酶 染色进行ESC的鉴定. 1.2.2胚胎干细胞向巢蛋白阳性细胞分化的诱导 先将经过3,4d扩增的ESC用0.25%胰酶消化 为单细胞,在拟胚体(embryoidbodies,EB)培养基 (DMEM高糖培养基,含浓度200ml/L优级胎牛血清, 终浓度为0.1mmol/L的B一巯基乙醇,不含LIF)中悬 浮培养4,5d,将ESC诱导为EB.收集EB后,以5× 10,9×l&/ml密度接种于经多聚鸟氨酸和纤维连接 蛋白预处理过的6孔细胞培养板中,37?静置培养.在 EB培养液中培养24h后,待大部分EB贴壁后将培 养液更换为NPC选择性培养基『不含血清,含N2,碱性 成纤维细胞生长因子(bFGF,质量浓度100g,L),纤 维连接蛋白(fibrionectin,质量浓度50g,L)和B27的 DMEM~12】,每24h更换新鲜培养液1次,连续诱导 培养4,5d,使EB定向分化为神经前体细胞.培养 期间在显微镜(Olympus,IV7O)下做形态学观察,部分 细胞做nestin免疫组化染色鉴定. 1.2-3巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导 在NPC选择性培养基中诱导4,5d后,将选择 性培养基更换为IPC培养基:无血清DMEM~12培养 基,添加烟酰胺(浓度10mmoiJL),B一细胞素,活化 素一A和肝细胞生长因子(质量浓度均为l0g,L).每 天更换1次新鲜培养液,连续培养4d后,在培养基 中添加葡萄糖(浓度10mmol/L).24h后葡萄糖浓度 增加到20mmoUL,继续培养24h后做IPC鉴定. 1.2.4胰岛素分泌细胞的鉴定 1.2.4.1双硫腙染色鉴定取无水乙醇3rId,加浓氨 水(浓度约13mol/L)50l.称取双硫腙50mg,溶于氨 水一无水乙醇混合液中,充分溶解后用pH7.2的磷酸 盐缓冲液稀释至总体积30rId,作为贮存液4?避光 贮存.使用时取贮存液1ml,用pH7.2的磷酸盐缓冲 液稀释成20rId,经0.45m微孔滤膜过滤后直接用 于培养细胞染色.培养细胞用pH7.2的磷酸盐缓冲 液洗2次后加双硫腙染液适量,37?孵育15min,倒 置显微镜下观察,摄像. 1.2.4.2胰岛素免疫组化染色鉴定胚胎体(EB)形 成后,将EB种植经多聚鸟氨酸和纤维连接蛋白处理 过的洁净盖波片上,培养于6孔培养板中,制作细胞 爬片.培养条件与其他各组完全一致.细胞爬片经4% 多聚甲醛固定后按免疫组化ABC染色的常规方法进 行胰岛素免疫组化染色,DAB显色后拍照留取资料. 2结果 2.1小鼠胚胎干细胞的体外培养,扩增和鉴定 ESC接种于经丝裂霉素处理过的饲养细胞后, ESC呈克隆状生长,增殖迅速.接种24h后可见由数 个细胞组成的细胞克隆.以后每天更换新鲜培养液. ESC迅速增殖,克隆增大.显微镜下观察:ESC体积细 小,细胞核大,胞浆少,细胞呈密集型集团样生长,形 成致密的"鸟巢"状集落.集落内细胞间界限不清,但 ESC克隆与饲养层有清晰边界(封三插图图1).ESC 克隆呈致密圆形或椭圆形,发出明亮的绿色荧光,碱 性磷酸酶染色阳性. 2.2胚胎体的形成 扩增3,4d后,生长良好的ESC经胰蛋白酶消 化成单细胞后接种于不含白血病抑制因子和饲养层 的培养液中,ESC在无黏附性的培养皿中呈悬浮生 长,增殖迅速.24h后可见由数个细胞组成的悬浮生 长的细胞团,以后细胞团迅速增大.培养至第4天,可 形成由数百个细胞组成的大小不同的EB.EB细胞团 呈致密球形,表面不光滑,可见多个结节状突起,发明 亮的绿色荧光. 2-3胚胎体向巢蛋白阳性的神经前体细胞分化的诱 导 收集悬浮培养4,5d的EB,转移于NPC选择性 培养基中培养,大部分EB呈贴壁生长.24h后,贴壁 生长的EB向周围散开,边缘长出"伪足"样突起,集 落中央仍为致密而细小的圆形ESC样细胞.培养72h 后,EB中央的圆形细胞大量死亡,脱落,边缘生长的 "伪足"样细胞分化为大而扁平的上皮样细胞f封三插 图图2).此后,上皮样细胞逐步变成多突起的神经样 细胞,这些细胞经免疫组化染色检测(封三插图图 生物医学工程与临床2007年3月第11卷第2期BME&ClinMe!!!!:!!!!:-145 — 3).nestin阳性细胞占86.5%. 2.4巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导 nestin阳性细胞在含活化素A,B一细胞素,肝细 胞生长因子和烟酰胺的无血清培养基中培养2d左 右.多突起的NPC样细胞数量减少,存活的NPC样细 胞边缘长出许多细小的圆形细胞.继续培养后,圆形 细胞进一步增多,细胞体积无明显变化.诱导后第3 天.圆形细胞逐渐增多并积聚成团.至第4天,在培养 液中添加葡萄糖(浓度10mmol/L),继续培养.24h 后.葡萄糖浓度增加至20mmol/L.此时细胞体积变 大.细胞数量增加,集落进一步增大.24h后做双硫腙 染色.大部分细胞为双硫腙染色阳性细胞.进一步做 胰岛素免疫组化染色,集落中的大部分细胞呈胰岛素 阳性(封三插图图4). 3讨论 神经干细胞(NSC)或神经前体细胞(NPC)起源于 胚胎外胚层神经上皮.器官分化后,NSC主要分布于 中枢神经系统的大脑,中脑和脊髓等部位.出生后, NSC集中分布于室管膜下区和海马.这些细胞保留了 干细胞的自我更新(Self--renewa1)和多向分化fmulti— potentdifferentiation)潜能,并能向脑内不同部位迁 移,分化成神经细胞,神经胶质细胞和星形胶质细胞, 用于修复,替代衰老病损的神经组织[41.NSC的发现为 神经系统损伤和神经退行性疾病的治疗带来了希望. 胚胎干细胞(ESC)属于胚胎发育早期的全能型 未分化细胞,在适宜的条件下可定向地分化为人们期 望得到的组织细胞,被认为是组织工程的万能种子细 胞.由于成体干细胞数量稀少,增殖能力有限,不易分 离扩增,这些问题成为限制成体干细胞临床运用的关 键因素.ESC具有全能分化特性,且增殖能力强,可在 体外大量扩增.将扩增后的ESC定向诱导为NSC.可 望用于PakinsonSdiseasefPD),AlzheimerSdiseasef AD)等神经系统疾病的治疗. 胰腺起源于胚胎原始前肠内胚层.在小鼠胚胎发 育的9.5d时,胚胎原始前肠内胚层的背侧首先出现 细胞增生并向外突起,形成背胰芽.随后,腹胰芽形 成.胚胎14.5d时,背,腹胰芽融合,形成胰腺.胚胎 14,18d,在上皮细胞间散在分布的内分泌细胞向间 充质内迁移,形成以B细胞为中心的胰岛样结构嘲.神 经系统起源于原肠胚外胚层,和胰腺组织在胚胎起源 上相距较远,因而认为脑组织和胰腺在器官分化上联 系不密切.但近年来发现,胰岛内分泌细胞和神经细 胞在发育上有许多相似之处.内胚层起源的胰腺B细 胞和外胚层起源的神经元拥有一些共同特征.许多与 胰腺p细胞功能密切相关的细胞膜离子通道,葡萄糖 转运体也在神经元有表达.胰腺B细胞也表达一些与 神经递质合成有关的酶,如酪氨酸羟化酶,多巴脱羧 酶,谷氨酸脱羧酶等.nestin被认为是NSC的特征性 分子标志.近年来发现,起源于胰腺导管上皮和胰岛 的干细胞都表达nestin,因此nestin也被认为是胰腺 干细胞的分子标志之一问.Burns等从大鼠脑组织分离 出神经干细胞,在体外扩增后,再做定向诱导,最终形 成了具有胰岛B细胞特征的胰岛素分泌细胞(IPC)171. Hori等从来自人脑组织的NSC诱导出了胰岛素分泌 细胞阎.姚忠祥等也从大鼠大脑组织来源的NSC诱导 出了IPCt~.2001年,Lumelsky等首先报道将ESC诱导 成了IPCt~Ol.其中一个重要的阶段就是先将ESC诱导 为nestin阳性的NSC,再进一步诱导为IPC.这些现象 提示,起源于胚胎内胚层的胰腺和外胚层起源的神经 细胞在发育学上有某些交叉.果蝇等低等生物没有胰 腺和胰岛组织.其所需的胰岛素来自脑组织.这也进 一 步提示,脑组织是产生胰岛素的另一个重要器官. 胰岛B细胞和神经细胞可能存在发育上的相似途径. 这不仅对传统的"胚层发育"理论提出了挑战.也为神 经系统疾病和糖尿病等胰腺相关疾病的治疗提供了 新的思路. 笔者研究组曾将ESC定向诱导成了NSC,移植 于AD大鼠后,发现这些移植细胞可在大鼠脑内存活 增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,AD大鼠的运 动功能也有明显改善.在此基础上.将nestin阳性的 NSC做进一步定向诱导,形成了具有胰腺B细胞染色 特征的双硫腙染色阳性细胞.双硫腙是一种Zn鳌合 剂,能和Zn2十结合而使含Zn的细胞显红色.胰岛素合 成后和Zn结合成复合物贮存于B细胞中,因此B细 胞属于富含Zn的细胞,双硫腙染色也被视为B细胞 的特异性化学染色方法.经过胰岛素免疫组化染色进 一 步证明,从nestin阳性细胞分化来的胰岛B样细胞 含胰岛素.说明ESC来源的nestin阳性细胞可以被诱 导为具有胰岛素分泌功能的IPC,这为糖尿病的细胞 移植治疗打下了一定基础 过去的研究表明,从胰腺组织中发现的胰腺/胰 岛干细胞均表达nestin[~.而nestin作为神经干细胞的 特异性分子标志已经得到公认.从ESC诱导生成的 nestin阳性细胞可以分化成神经元和神经胶质细胞也 为早期实验所证实.笔者将这些nestin阳性细胞诱 导成了胰岛素分泌细胞.但由于所用的诱导方法没有 得到100%纯净的nestin阳性细胞(从ESC诱导生成 的NSC,nestin阳性率为86.5%),所以尚不能断定这 些细胞就完全来自神经前体细胞(虽然胰腺/胰岛干细 胞和神经干细胞均表达nestin).目前已有多家报道证 明从大脑组织来源的NSC可在体外被诱导为胰岛素 分泌细胞(IPC),但由于所用的NSC没有得到100% 纯化,所得结果还不足以证明神经干细胞可以分化为 - 146-生物医学工程与临床2007年3月第l1卷第2期BME&— C— lin — Med,March2007,Vo1.1l,No.2 IPC.这些IPC可能来自NSC,也可能来自一种特性尚 不明确的,也表达nestin的干细胞.从ESC诱导生成 的nestin阳性细胞,既可能是NSC,也可能是胰腺,胰 岛干细胞.或二者兼而有之,具体问题有待深入研究. 参考文献: PolakJM,BishopAE.Stemcellsandtissueengineering:past, [1】 present.andfuture[]].AnnNYAcadSci,2006,1068:35一66. 『21XuH,FanX,WuX,eta1.NeuralprecursorceUsdifferentiated frommouseembryonicstemceUsrelievesymptomaticmotor behaviorinaratmodelofParkinsonSdiseasefJ1.Biochem BiophysResCommun.2005,326(1):ll5—122. 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Fig3hnp"',,,at ? .rialme. gr.~ingini.1lial,~ria40% …'"" }I1I?{f IM}增4IESC业糟巢状cx1001. 2NPC选择培荐甚肆3tl帅EB什化批}心J旭样 cxl00) FigIM'J…ll_fESC?1lI,liytln…l?l.illi~lil4,lay~iHt ~[EFt×1f】m-Fig21,7BilchltIIIiiLNPCl…li{uIIurIlJtJiUlil art3days(x1001 口3在NI地枰忡培rli谱导5d?Ell"化成#11替m胞 佯凡"l性匀?1rl?tcy3包.2I?1.4nIPC 选择性埘养巾诱导6dFill细啦集蒂旱岛谁…【l}^RB Bxl00) ?E3EBindu(edf}riN1sleliv?lu0ur~mJILII~IaOw5Ij8v n~$1Jnposili…rlll…【uJllHI—v3f__1lm…1l1x2?1?4Cl d,myl】vERlT1fJl?-J(irlIPCs.^ltt1vPit1jLI|nrn1iu…fier^rI… f1rl~llIilp,~sifivPD^Bl,,Ioratitltlxl0(】1 VEGF转染大鼠[『『【管内皮细胞对新生血管膨成影响的实验研究(文第149页插 罔 / 4hm齿内应缃胞vEGF龟瘫组化靴色(x4cH】)f^.对日大忤脏IIE色【x40(I)t^:"蛸:B:I转 蛆,B?空白转.C:襄驻蛆1组C:蛮赊1 F4VEGFim?川l…一histochmnisiry血ufrul…ulalF5RaiklrlnevlissuHE…tai(^ignlI1B d?hIn.e0s(Aconm,lgmupl0hla.kt?uttililltmml?TI~.w,lup.c~p,!nn,enlalgmup:×4(m) group.(:experimenialgroup:x400)