双色茉莉愈伤组织诱导

双色茉莉愈伤组织诱导 双色茉莉愈伤组织诱导 【摘 要】以双色茉莉花的叶片、叶柄、茎段为外植体,ms 为基本培养基,探索最适外植体取材部位;分析植物生长调节剂的种类、浓度对不同外植体诱导愈伤组织的影响和最适组合。结果表明:通过叶柄能成功诱导出健康的愈伤组织,但诱导率较低,3 种外植体中以嫩叶诱导愈伤组织的效果最好,平均出愈时间最短;茎段愈伤组织诱导率其次; 6-ba、naa、iba 对叶片和茎段等外植体诱导愈伤组织的影响显著。叶片诱导愈伤组织的最适培养基为1/2ms + 6-ba 2.0mg/ l + naa 0.01mg/ l + iba 0.2mg/ l ;茎段诱导愈伤组织的最适培养基为1/2ms + 6-ba 1.0mg/ l + naa 0.1mg/ l + iba 0.1mg/ l;叶柄诱导愈伤组织的最适培养基为ms + 6-ba 2.0 mg/ l + naa 0.1mg/ l + iba 0.1mg/l。 【关键词】双色茉莉;愈伤组织;诱导率 双色茉莉为茄科、鸳鸯茉莉属，常绿灌木，株高30,100厘米[1]。其原产地在热带美洲，花朵从破蕾到盛开之初，颜色为深蓝色，但两三天之后，在光照、温度等多种因素的影响下，花冠原来的深紫色色素便逐步消失了，最后变得纯白。由于在同一植株上开花先后不一，先开者已变白，后开者仍为深紫，双色花像鸳鸯一样齐放枝头，同时放出茉莉样浓郁的芳香，故又名“鸳鸯茉莉”。双色茉莉性喜阳光充足、温暖湿润的气候环境，需排水良好的微酸性土壤， 适宜的生长温度为20,30?之间。12?条件下进入休眠期状态，冬季室温不能低于13?。叶片长卵形，暗绿色。花单生或几朵密生，花被具5浅裂，好似5瓣梅花，花冠直径3,4厘米，花初开时呈淡紫色，逐渐变成青色，最后变成白色[2-4]。 1 材料和方法 1.1实验材料 选用室内栽培双色茉莉为母株，从植株中选取叶片、叶柄、茎段作为接种材料。取材来自于内蒙古师范大学生物楼遗传实验室的盆栽花卉，取材时间2011年8月份。 1.2实验方法 1.2.1母液的配置 依据下表按顺序称取药品并依次溶解在蒸馏水中，分别配制10×大量元素母液1000ml、100×微量元素母液1000ml、200×铁盐100ml、100×维生素500ml。 1.2.2 植物生长调节剂 本次实验用到的所有植物生长调节剂的母液浓度均为0.25 mg/ml，双色茉莉的培养过程中需要用到6-ba(6-苄基氨基嘌呤)、naa(萘乙酸)和iba(吲哚丁酸)。6-ba用1n hcl溶解，naa和iba用95%乙醇或1n naoh溶解。 1.2.3 培养基的配制 愈伤组织诱导培养基配方为ms或1/2ms培养基中加入不同浓度的 6-ba、naa和iba溶液配制而成。 (1)ms和1/2ms培养基的配制: 配制ms基本培养基1000ml:分别称取10×大量元素母液100ml，100×微量元素母液10ml，200×铁盐5ml，100×维生素10ml，于1000ml的烧杯中，再称取肌醇100mg，蔗糖30000mg，加ddw至800ml。 (3)用1n hcl和1n naoh调节ph至5.8。 (4)分别向上述培养基中加入8%的琼脂。 (5)加热使琼脂完全溶解，分装到培养瓶内,每个梯度各做3个重复;121?高温灭菌20min。 1.2.4 材料的消毒处理 将取得的双色茉莉的叶片、叶柄和茎段放在烧杯中用流水冲洗干净，除去其表面的尘土及其他附着物。在超净工作台中(提前紫外灭菌20 min)用70%的酒精表面消毒20s，在用无菌水冲洗3次。接着，用0.1%的hgcl2溶液消毒8分钟，最后用无菌水冲洗3次。 1.2.5 接种 在酒精灯旁，将消毒好的材料切成1.0×1.0cm的小块，分别接种到8个梯度的培养基中，每个梯度有3个重复，因此各接不同植株部位。注意每个培养基接种时不要将组织贴靠培养基壁或底部。 1.2.6 愈伤组织的诱导 按照不同植物激素的浓度设计8个梯度，每个梯度三个重复，每组实验设置8个培养基，第一组接叶片，第二组接叶柄，第三组接 茎段，共24个培养基。将接种好的培养基放在相对湿度为70 %,80 % , 温度为22.5,25?，光照12 h/d ,光照度为1500 lx的培养室中进行培养。 2 结果与分析 2.1实验结果 在实验过程中，我们共配制了8个梯度，并且每个梯度配制了3瓶, 每瓶中接入6个切好的组织。在组织培养实验室培养10天左右，叶片明显增厚，呈卷曲状，叶柄和茎段两端也膨大;继续培养10天后，部分组织的切口处开始形成白色或浅绿色的愈伤组织。之后愈伤组织逐渐长大，白色的渐变成绿色，有的发生褐变而停止生长，但也有些染菌死亡。40天后统计其总的生长情况，并由此计算出诱导率。数据统计按照下列方式:愈伤组织诱导率(%)=(形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)×100%。 2.2结果分析 通过比较分析，培养基1/2ms + 6-ba 1.0mg/ l + naa 0.1mg/ l + iba 0.1mg/ l中的愈伤组织诱导效果最佳，诱导率可达83.3%，并且外植体长势较好，愈伤组织生成较早、较快。因为生长素与细胞分裂素共同控制着多种植物愈伤组织的生长与器官分化，这种作用取决于生长素与细胞分裂素的各自浓度和适当比利。而naa，iba属于生长素类调节剂，能促进细胞的体积增大;6-ba属于细胞分裂素类调节剂，能促进细胞分裂，因此，?号梯度的愈伤组织长得最 大、最快。 由表5和6可以看出， 1/2ms培养基对双色茉莉愈伤组织的生长较为适合。在6-ba的浓度为1.0mg/l或2.0mg/l时，只要naa和iba的浓度合适均可长出愈伤组织。而naa和iba的浓度均为0.1mg/l或0.01mg/l和0.2mg/l时对愈伤组织的形成较为有利。 愈伤组织的诱导时间、和诱导率，首先我认为可能与外植体的选择有关，不同种类的外植体对离体培养的反应不同，培养效果也就不同。主要是与植物种类及其发育阶段、年龄、生理状态、外植体大小、外植体的采集时间、外植体在植株上的位置、季节等有关[5]。而本实验选取的叶片、叶柄和茎段相对成熟，可以尝试选取一些幼嫩叶片、茎段进行培养比较。其次我认为与培养基各激素的浓度有密切的关系，本实验以不同激素配比所设置的浓度梯度不多，因在此实验的基础上，围绕愈伤组织形成较好的浓度梯度再次调整浓度，进行观察比较。 实验过程中出现了褐化现象，一般是由两种情况产生的，第一种是由于细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞死亡，另一种是由于材料伤口处分泌的酚类化合物引起的。褐变是因为多酚氧化酶(ppo) 作用于天然底物酚类物质,使其被氧化成醌类物质,呈红褐色,并抑制许多酶的活性,从而影响植物材料的正常生长,严重时可导致培养物的死亡[6]。在双色茉莉的愈伤组织诱导过程中,都出现了不同程度的褐化。这主要是因为活性碳的吸附作用没有选 择性,在吸附有害物质的同时也吸附了培养基中的生长调节物质,使其失去功能,而影响愈伤组织的正常生长[7]。因此,通过加快转瓶的速度、及时更换培养基的方法可以减轻愈伤组织培养中的褐变现象。在接种时也可迅速或者在水中切取叶片，避免伤口与空气的接触，也可以在弱光中或黑暗下培养，抑制酚类的氧化[8-9]。 个别培养基有染菌的现象，染菌原因是材料带菌、接种污染、培养过程污染。由于本实验灭菌时间较长，材料带菌的可能性较小，有可能是在接种过程中染菌，也有可能是周围环境中有某些病菌而导致菌类污染[10-11]。 3讨论与结论 在双色茉莉愈伤组织培养过程中，对不同外植体取材部位，如叶片、叶柄和茎段，最适诱导愈伤组织的培养基是1/2ms + 6-ba 2.0mg/ l + naa 0.01mg/ l + iba 0.2mg/ l;但对于叶柄来说ms + 6-ba 2.0mg/ l + naa 0.1mg/ l + iba 0.1mg/ l是其最适培养基;对于茎段则1/2ms + 6-ba 1.0mg/ l + naa 0.1mg/ l + iba 0.1mg/ l是最佳的培养基。 参考文献 [1]房兆军.茉莉栽培浅谈[j].农业知识，2004(2):33. [2]董永义，宋旭，郭圆. 非洲茉莉组织培养研究[s].北方园艺，2008(9) :164,165. [3]庄哲煌，蔡汉权，陈丹生.茉莉花愈伤组织诱导及悬浮细胞培 养[j].长江蔬菜,201(08): 21-24. [4]袁媛, 连芳青.鸳鸯茉莉不同外植体诱导愈伤组织研究初探[s].北方园艺,2010(1) :168,171. [5]周淘,江启翔.观赏花卉组织培养中外植体材料的选取[j].山东林业科技,2003(1):43-44. [6]叶梅.植物组织褐变的研究进展[j ]. 重庆工商大学学报(自然科学版)，2005，22(4):326032. [7]陈凯. 植物组织培养中褐变的产生机理及抑制措施[j]. 安徽农业科学,2004 ,32(5) :1034—1036. [8]张妙霞,孔祥生,郭秀璞,等.柿树组织培养防止外植体褐变的研究[j].河南农业大学学报,1999,33(1):87-91. [9]王东霞,李长杰.如何对抗组织培养中的组织褐变[j].中国花卉盆景,2002(12):29-30. [10]赵佐敏,艾勇. 植物组织培养过程中的污染原因及控制措施[j]. 贵州农业科学,2004 ,32(1): 61o62. [11]郝云凤,李可伟,张培宏. 植物组织培养操作过程中常见的污染问及解决办法[j].内蒙古农业科技,2004(s2) :156—158.