羊布鲁氏菌病疫苗免疫后抗体消长规律研究及4种抗体检测方法的比较(可编辑)

羊布鲁氏菌病疫苗免疫后抗体消长规律研究及4种抗体检测方法的比较(可编辑) 羊布鲁氏菌病疫苗免疫后抗体消长规律研究及4种抗体 检测方法的比较 分类号 S855.1+2学校代码10129 U D C 591.2 学 号 2011216042羊布 鲁氏 菌病 疫苗 免疫 后抗 体消 长规 律研 究及 4 种 抗体 检测 方法 的比 较 Studies of the Regularity of Brucellosis Antibodies Change of Sheep after Vaccination and Comparison of Four Antibody Detection Methods 申 请 人 :高 越学科 专业 :兽 医硕 士 指 导教 师: 申之 义 教授 论文 提交 日期 :二 ?一 三年 六月 摘 要 布 鲁 菌 病是 由 布鲁 菌 引起 的 一种 人 畜共 患 的慢性 传 染 病。 本 病主 要 引起 羊 、 牛 和 猪 发病 ,出 现 流产 、 不育 和各 种 组织 的 局部 病 灶 。近 年来 本 病在 我 国流 行 十 分 严 重 ,给 畜牧 业 和人 类 健康 带来 严 重危 害 。我 国 采 取检 疫、 扑 杀和 疫 苗免 疫 为 主的对本病加以防控。 目 前 国 际国 内 还没 有 用于 鉴 别疫 苗 免疫 动 物和自 然 感 染 动 物 的良 好 的定 性 检 测方法, 我国主要依据疫苗免疫动物和感染强毒菌动物抗体的存续时间加以鉴别。 一 般 来 讲, 疫苗 免 疫动 物 的抗 体存 续 时间 较 短, 感 染 强毒 菌的 动 物的 抗 体存 续 时 间 较 长 。但 有关 羊 免疫 后 抗体 消长 规 律缺 乏 系统 全 面 的研 究, 为 此本 研 究拟 对 绵 羊 和 山 羊疫 苗免 疫 后的 抗 体进 行系 统 检测 , 准确 掌 握 免疫 羊的 抗 体消 长 规律 , 为 布鲁菌病防控工作中 采用血清学方 法鉴别疫 苗免疫羊和自然感染 羊提供理论依 据 。 与 此同 时, 对 四种 抗 体检 测方 法 进行 比 较, 为 检 疫工 作中 选 择正 确 的检 测 方 法提供参考。 本研究对鄂尔多斯市和阿拉善左旗的共计 500 只布鲁菌病疫苗免疫过的绵羊 和山羊进行了 150 天的连续监测。 于免疫 后 20 天,50 天,90 天,120 天,150 天, 采用虎红平板凝集试验RBT 、 试管凝集试验SAT 、 快速间接酶联免疫吸附试验 快 速 iELISA 、间接酶联免疫吸附试验iELISA4 种检测方法进行血清抗体检测。此 外,对 1424 份血清样本检测结果进行了数据 分类统计。 结果明,S2 株疫苗免疫山羊 150 天后,通 过 SAT 和 RBT 能够检测到的 凝 集抗体水平已经很低, 通过快速 iELISA 和 iELISA 能够检测到 的 iELISA 抗体阳性 率仍达到 40% 左右。S2 株疫苗免疫绵羊 150 天 后,SAT 和 RBT 基本无法 检测到凝 集抗体,快速 iELISA 和 iELISA 检测的抗体阳 性率仍有 10% 左右。在四 种抗体检 测方法中, 快速 iELISA 的敏感性最高, 而 SAT 的特异性最高。 建议在检 疫工作中 采用快速 iELISA 或 RBT 进行初筛,采用 SAT 进行复核。 关键词: 布鲁菌病;抗体消长规律;血清学方法 Studies of the Regularity of Brucellosis Antibodies Change of Sheep After Vaccination and Comparison of Four Antibody Detection Methods Abstract Brucellosis is a zoonoses and chronic infectious disease caused by Brucella. Sheep, cattle and pigs are the main animals that infected by Brucellosis.Abortion, infertility and localized disease of variety of organizations are the main clinical manifestations. In recent years, the disease spread very quickly in our country and have a serious harm to livestock and human health. Quarantine, culling and vaccination are taken as the main measures to prevent and control the diseaseNow, there were no excellent qualitative detection methods to identify immunized animals and naturally infected animals in international or domestic. The identification mainly based on the difference of the antibody survival time of vaccine immunized animals and naturally infected animals in China. Generally, the antibody survival time of the animals infected by virulent Brucella was longer than vaccine immunized animalsBut the systematic study about growth and decline law of the sheep after immunization was lack. To this end, in this research, the antibodies in sheep and goats after immunization were systematic detected, with the purpose to know well the accurate knowledge of antibody dynamics of the vaccinated sheep.The research would provide a theoretical basis for identification vaccinated sheep and naturally infected sheep in the work of prevention and control of brucellosisIn this study, 500 sheep and goats from Ordos and ALashan Left Banner were immuned by S2 vaccine and the serum antibody of vaccinated animals were monitored continually for 150 days. The blood had collected for serological tests at 20 days, 50 days, 90 days, 120 days, and 150 days after vaccination. RBT, SAT, rapid iELISA and iELISA were used to determinate the Antibody Dynamic. Besides, the classification statistics was used to analyse the 1424 serum samples resultThe results showed that, the agglutination antibody level of vaccinated goats detected by RBT and SAT were already very low after vaccination and the antibody positive rate through rapid iELISA still be at about 40% at 150 day after vaccinationThe agglutination antibody of vaccinated sheep through RBT and SAT could not be detected nearly and the antibody positive rate through rapid iELISA, iELISA were still at about 10% at 150 day after vaccination. Of the four brucellosis serological test , the rapid iELISA had the highest sensitivity and SAT had the best specificity. It was suggested that the rapid iELISA and RBT were used as screening test and SAT was used as review test in the quarantine of brucellosis Key Words: Brucellosis ; Antibody dynamic ; Serological tests Directed by: Prof. SHEN Zhiyi Applicant for master degree: GAO Yue (Veterinary Master College of Veterinary Medicine. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018. China目 录 1 引言 1 1.1 布鲁菌病概述 1 1.2 布鲁菌病的研究进展 1 1.2.1 布鲁菌 病病原. 1 1.2.2 布鲁菌病的分布与危害2 1.2.3 人布鲁菌病 3 1.2.4 动物布 鲁菌病. 4 1.2.5 布鲁菌病的防控5 1.2.6 布鲁菌病的诊断6 1.2.7 布鲁菌病 的疫苗7 1.2.8 布鲁菌病的治疗8 1.2.9 困难与展望 9 1.3 血清学方法在布 鲁菌病抗体检测中的应用及现状10 1.3.1 凝集试验在布鲁菌病抗体检测中的 应用10 1.3.2 酶联免疫吸附试验ELISA 在布鲁菌病抗体检测中的应用11 1.4 本论文的研究意义. 12 2 材料与方法12 2.1 试验材料 12 2.1.1 仪器设备. 12 2.1.2 试验材料. 13 2.1.3 常用试剂配备 13 2.2 试验方法 14 2.2.1 试验设计. 14 2.2.2 试验操作. 14 3 试验结果. 17 4 讨论39 5 结论41 致 谢. 42 参 考 文 献. 43 作 者 简 介. 47插图 和附 表清单 1. 表1 试验分 组. 14 2. 表2 阿拉善 左旗山 羊疫苗免 疫后抗体 检测结果 14 3. 表3 阿左旗 绵羊疫 苗免疫后 抗体检测 结果. 19 4. 表4 鄂尔多 斯市山 羊疫苗免 疫后抗体 检测结果 22 5. 表5 鄂尔多 斯市绵 羊疫苗免 疫后抗体 检测结果 25 6. 表6 阿拉善 左旗山 羊 SAT 及RBT 检测 阳性率27 7. 表7 阿拉善 左旗绵 羊 SAT 及RBT 检测 阳性率28 8. 表8 鄂尔多 斯市山 羊 SAT 及RBT 检测 阳性率29 9. 表9 鄂尔多 斯市绵 羊 SAT 及RBT 检测 阳性率30 10. 表10 阿拉 善左旗山 羊快速 iELISA 及iELISA 检 测阳 性率 31 11. 表11 阿拉 善左旗绵 羊快速 iELISA 及iELISA 检 测阳 性率 31 12. 表12 鄂尔 多斯市山 羊快速 iELISA 及iELISA 检 测阳 性率 32 13. 表13 鄂尔 多斯市绵 羊快速 iELISA 及iELISA 检 测阳 性率 33 14. 表14 四种 方法对 1424 份羊 血清样品 检测的总 阳性 率 38 15. 表15 四种 方法分类 统计阴、 阳符合性 率39 16. 图1 RBT 检 测免疫山 羊抗体消 长曲线 34 17. 图2 SAT 检 测免疫山 羊抗体消 长曲线 34 18. 图3 快速 iELISA 检 测免疫山 羊抗体消 长曲线. 35 19. 图4 iELISA 检测免 疫山羊抗 体消长曲 线 36 20. 图5 RBT 检 测免疫绵 羊抗体消 长曲线 36 21. 图6 SAT 检 测免疫绵 羊抗体消 长曲线 37 22. 图7 快速 iELISA 检 测免疫绵 羊抗体消 长曲线. 37 23. 图8 iELISA 检测免 疫绵羊抗 体消长曲 线 37 缩 略 语 表 ELISA (enzyme linking immunosorbent assay )酶 联 免 疫 吸 附 试 验 RBTthe rose bengal plate agglutination test 虎红平板凝集 试验 SATthe serum agglutination test 试管凝集试验 CFTthe complement fixation text 补体结合试验 MRTthe milk ring test全乳环状试验 Igimmunoglobulin免疫球 蛋白 IgMImmunoglobulin M免 疫 球 蛋 白 M LPSlipopolysaccharide 脂多 糖 PCRpolymerase chain reaction聚 合酶链式反应 内蒙古农业 大学硕士 学位论文1 1 引言 1.1 布鲁菌病概述 布鲁菌病(Brucellosis )又 称为布氏杆 菌病、 布鲁氏菌病,简称 布病, 是由 布鲁 菌(Brucella ) 入侵机体引起的的传染- 变态反应性的人畜共患传染病。 在我国被划归 为乙类传染病。 本病广泛流行于世界各地, 人 们从认识到不断深入研究布鲁菌病已有 100 余年历史。 本病在 1814 年由 Burnet 首先描述为地中海弛张热, 并与疟疾作了鉴别。1860 年 Marston 又对本病作了系统描述, 并且把伤寒与地中海弛张热区别开。 在 1886 年英国 军医 Bruce 历史上首次明确了该病的病原体 , 他是在马尔他岛从死于 “马尔他热” 的 士兵脾脏中分离出了“布鲁菌” 。1897 年 Hughes 根据本病的热型特征,建议称“波 浪热” 。后来,学者们建议将该菌取名为“布鲁菌” , 以此来纪念 Bruce 为该病作出 的特殊贡献, 并且将该病取名为 “布鲁菌病” 。1897 年 Wright 与其同事发现患病病人 的血清与布鲁菌的培养物可发生凝集反应,该反应随后被称为 Wright 凝集反应,从 [1] 而建立了迄今仍然在使用的血清学诊断方法 。 由布鲁菌引起的人类疾病还有以下几 种名称:马尔他热、地中海弛张热、波浪热或波状热。 1.2 布鲁菌病的研究进展 1.2.1 布鲁菌病病原 本病病原为布鲁菌,为细小,两端钝圆的球杆菌或短杆菌,革兰氏染色 呈阴性, 没有 鞭毛, 不 能运动, 不形成芽胞 和荚膜。 柯兹洛夫斯基氏染色法染色, 菌体呈红色, 其他菌呈微绿色或蓝色。 本菌为需氧兼性厌氧 菌, 胞内寄生, 在普通培养基上生长较 差, 在培养基中加入甘油、 葡萄糖、 胰蛋白? 、 肝汤及血清等, 有助于本菌生长。 初 次分离时,生长缓慢,在 10%CO 环境下才能生长,以后传代无 CO 也可生 长。 2 2 本菌有 9 个种: 羊 (马尔他) 布鲁菌 (B.abortus)、 牛 (流产) 布鲁菌 (B.melitensis)、 猪布鲁菌 (B.suis)、 沙 林 鼠 布 鲁 菌 (B.neotome)、 绵羊布鲁菌 (B.ovis)、 犬 布 鲁 菌 (B.canis)、 田鼠布鲁菌 (B.microti)、 鲸布鲁 菌 (B.ceti)、 鳍布鲁 (B.pinnipedialis)。 [2] 其中前三种被称为是经典的布鲁菌菌种, 羊种致病力最强 。 鲸布鲁菌 和鳍布鲁 菌则 [3] 是对海洋动物存在着致病性。 各型布氏杆菌在形态和染色上无明显区别 。 布鲁菌菌 株的命名主要依据其优先感染的 宿主动物而得名。 本菌的生长对营养有较高的要求, 目前在实验室的研究过程中我们多用牛、 羊新 [4] 鲜胎盘加 10% 的兔血清来制作培养基, 并且能够达到很好的效果 。 但即使在良好的 培养条件下本菌的生长仍然是较为缓慢的,在不良的环境下,如抗生素等的影响下, 本菌易发生变异。 当细菌壁的脂多糖 (LPS ) 受损时细菌菌落即由 S 型变为 R 型。 当 胞壁的肽聚糖受损时, 则细菌失去胞壁或形成 胞壁不完整的 L 型布鲁菌。 这种由于表 2 羊 布鲁 菌病疫苗 免疫后抗 体消长规 律研 究及 4 种抗 体检测方 法的比较 型的变异而形成的细菌可以在机体内长期存在, 在等到环境条件得到改善后它的特性 [5] 再恢复到原有状态 。[6] 本菌有 A 、M 和 G 三种抗原成份,G 为共同抗 原, 一般牛种菌以 A 抗原 为主 。 本菌致病力与各型菌新陈代谢过程中的酶系统, 如透明质酸酶、 尿素酶、 过氧化氢酶、 [7] 琥珀酸脱氢酶及细胞色素氧化酶等有关 。 细菌死亡或裂解后释放内毒素是致病的重 要物质基础。 布鲁 菌对外界环境因素 的抵抗力较强, 在土壤中可存活 20~120 天, 水中可存活 75~150 天, 在乳、 肉类食品中可存 活 2 个月 , 对干燥和寒冷抵抗力较强, 但对湿热 敏感,60 ?30 分钟、70 ?5 分钟即可杀死,煮沸立即死亡。常用消毒药,如 3% 石炭 [8] 酸、来苏水、3% 石灰乳均能在数分钟内将其杀 死 。 1.2.2 布鲁菌病的分布与危害 在我国,有关布鲁菌病的报道出现的较晚,在 1905 年的重庆报告有两例布鲁菌 病病人出现。在其后的报道中,人、畜布鲁菌病很快波及到 28 个省市、自治区和直 辖市。报告显示,在上世纪 50~60 年代我国 曾出现过布鲁菌病在人畜中的较重的流 行,直到 70 年代时本病的疫情开始逐年下降 ,至 90 年代初人间感染率仅为 0.3% , 发病率只有 0.02/10 万。 这个状况明显好于当时 的某些发达国家的布鲁菌病疫情指数。 但自 1993 年, 我国布鲁菌病疫情出现了反弹, 1991 年我国布鲁菌病暴发点为零, 1996 年上升为 76 个。1991-2001 年间 , 人间布鲁菌 病的阳性检出率在 0.35-3.57% 之间徘徊 [10.11.12] 。从 1993 年以后人布鲁菌病病例逐渐增长 , 年病例数由 500 例上升到 1500-3000 例。 1994 年新发病人数为 815 人, 到 2003 年新 发病人数已达 6000 多人。 卫生 部 2004 年上半年报告感染人数为 5735 例,2005 年, 全国新发布鲁菌病达到 19664 人, 发病 率为 1.5/10 万。2007 年,全国共报告发病 21195 例,远远超过历史上发病人数最多 [13.14] 的 1963 年12097 例 。2008 年, 根据中国 疾病预防控制中心数据, 布鲁菌病发病 人数为 27767 人,2009 年的发病人数 为 35816 人,发病率增加 28% 。2010 年 1-7 月 份的发病人数为 23728 人,由 2 月份的 988 人 逐渐递增到 7 月份的 5110 人,呈现一 [15.16] 个快速上升的趋势 。 发病数居前十位的省、 自治区依次为内蒙古、 黑龙江、 山西、 [17] 河北、 陕西、 吉林、 辽宁、 新疆、 河南、 山东, 共占全国报告病例总数的 98.15% 。 人间布鲁菌病疫情的爆发总是能够反映出当时动物布鲁菌病疫情的发展情况。 在 我 国 人 间 布 鲁 菌 病 疫 情 逐 年 上 升 的 六 、 七 十 年 代 , 动 物 布 鲁 菌 病 阳 性 检 出 率 高 达 [18] 41.27% , 而从 1982~1998 年, 动物布鲁菌病得 到了有效而显著地控制 。 1999 ~2000 年布鲁菌病疫点和发病数也趋于稳定。 但是, 随着畜牧业的不断发展以及牛羊饲养数 量的急剧增加, 动物布鲁菌病的趋势又开始呈现一个上升的态势。 布鲁菌病阳性检出 [19] 率从 2000 年的 0.11% 上升到 2004 年的 0.63% 。2006 年全国报告畜间布鲁菌病疫点 内蒙古农业 大学硕士 学位论文3 1178 个, 报告发病牲畜总数为 7 123 头。2009 年动物布鲁菌病发病数比 2008 年增加 [20.21] 了 49.12% , 2010 年 1~7 月份动物布鲁菌病发 病数比 2009 年同期增加了 22.79% 。 由此可见, 动物布鲁菌病也呈逐年上升的趋势 , 从 3 月份开始达到发病高峰期。 通过 比较人间布鲁菌病疫情的发展与动物布鲁菌病疫情的发展我们不难发现, 人间布鲁菌 病疫情的趋势跟随动物布鲁菌病疫情的变化而变化, 而动物布鲁菌病疫情的变化又受 到人们发展畜牧业经济的影响。 布鲁菌病不仅损害人类的健康, 还影响着各类动物源性产品包括乳、 肉及其制品、 皮、 毛等在内的民生需求, 甚至能够影响到畜 牧业经济的发展以及国内国际贸易和旅 游业。据统计资料表明,全世界每年因布鲁菌病造成的经济损失近 30 亿美元,就我 国新疆、 甘肃两地的概算, 每年因布鲁菌病造 成的各项直接经济损失达到约 1 亿元人 [22] 民币 。 而且它所引起的人类波状热、 慢性感 染以及反刍动物的流产和睾丸炎, 至今 仍然没有找到根治的方法。 布鲁菌主要感染巨噬细胞和胎盘滋养层细胞。 在急性感染期, 布鲁菌可侵袭胎盘 绒毛膜的滋养层细胞, 引起流产; 持续性感染时, 布鲁菌可在生殖器官、 乳腺和淋巴 结定居; 慢性感染时, 布鲁菌可随奶排出。 布鲁菌病的 危害是十分 严重的, 而且是 存 在于 多方面的。 家畜 如果感染了布鲁菌病 , 常 常会导致 怀孕母畜的 流产, 而公畜 则会 发生睾丸炎和附睾炎 从而 引起不育。 病畜 的 分泌物 如乳汁等 以及脏器带菌, 与之直 接接触的人或者动物会有很大可能感染此病, 病畜会发生关节炎、 淋巴结炎和滑液囊 炎等引起疼痛, 从而导致动物食欲不振, 越发消瘦。 因此, 布鲁菌病 严重影响家畜的 生产力和动物性产品的生物安全, 给畜牧业生产带来巨大损失, 中国每年牛、 羊、 猪 [23.24] 感染有百万头之多,所造成的经济损失可达十几亿元 。对人而言, 布鲁菌病 并不 同于一般的疾病, 布鲁菌侵入机体引起变态反 应性全身病变, 急性期可以治愈, 但不 易被认症, 常被拖延为慢性期。 慢性期 布鲁菌病 患者会发生 肝、 脾及睾丸肿大, 关节 和脊柱强直, 肌腱挛缩变硬 等症状 , 很难治愈, 如果患者同时 患有 脑炎和心肌炎,该 病可致命 。 布鲁菌病 严重影响人类健康, 因此 布鲁菌成为潜在的生物恐怖病原微生物 [25] 。 布鲁菌病对野生动物也产生极大的危害。 在野生动物中如野牛、 野鹿、 羚羊、 野 猪等对布鲁菌都易感。 熊、 狼、 狐狸等以及野 兔、 小家鼠、 黑线姬鼠、 蝉 、 鳕鱼、 海 [26] 豹、 海豚等也可以感染 。 野生动物感染后, 在 适当情况下又可感染家畜和人。 所以, 野生动物布鲁菌病的存在,对畜牧业的发展和人类健康也是一种潜在的威胁。 1.2.3 人布鲁菌病 随着畜牧业的不断发展, 参与到畜牧业生产中的人员也随之不 断增多, 因而布鲁 菌病感染人的数量也在进一步增多、 扩大。 当 这些动物患有布鲁菌病时, 由于养殖户 4 羊 布鲁 菌病疫苗 免疫后抗 体消长规 律研 究及 4 种抗 体检测方 法的比较 缺乏相关的防护知识和自我保护意识, 在进行 挤奶、 流产胎儿处理、 小羊出生等一系 列与动物接触的过程中, 没有习惯戴口罩、 手 套, 在直接接触病畜分泌液及乳房等器 官后,不能及时的进行消毒等,这都会导致相关人员感染布鲁菌。 布鲁菌的繁殖周期仅需要 1~3 周,但是需要 几个月的时间它才能表现出典型的 临床症状, 羊种布鲁菌感染人后一般表现为急性的症状, 而其他种的布鲁菌感染人后 表现的症状一般为亚急性和慢性。 布鲁菌病通常的临床表现有波浪热, 具体为体 温变 化大,一般在早上测量体温为 37 ?而到了中午就达到 40?,另外夜间盗汗,汗液带 有怪味, 寒战, 虚弱以及浑身不适, 失眠 , 食 欲减退, 头痛, 关节痛, 便秘 , 神经质 以及抑郁等症状也都是布鲁菌病的典型临床表现。 人布鲁菌病多数情况下以并发症的 形式出现, 主要表现为脑炎, 关节炎, 脊椎炎 , 脊髓炎, 心内膜炎, 睾丸 炎和前列腺 炎, 这主要是根据布鲁菌寄生部位而定, 由此 可见, 布鲁菌病在临床上的症状是非常 多变的。 如果孕妇感染了布鲁菌病, 一般多在 妊娠的头三个月内出现流产症状。 布鲁 菌病引起的最严重的并发症是心内膜炎, 它是由感染羊种布鲁菌而引起 的, 这种并发 症所造成的死亡率是极其严重的,80% 的布鲁 菌病患者会因伴发心内膜炎而死亡。 在 临床的诊断中, 我们发现病人多为慢性或者急慢性布鲁菌病患者, 这是由于布鲁菌病 在急性期的临床病症不易确诊并且现阶段还没有很合理的治疗措施, 而转变为慢性或 急慢性的布鲁菌病依旧很难治疗。 活的弱毒疫苗羊种 Rev.1 和牛种 S19 均可以感 染人,疫苗株感染人的过程很短, 在进行免疫的过程中由于粗放的免疫方式或者不当的操作使得疫苗很难在完全封闭 的情况下被动物吸收, 而弥散在空气中的疫苗株会形成气溶胶, 在工作人员呼吸的过 程中很容易造成感染,因 此,我们的畜牧工作者一定要在工作中做好自身防护工作。 在通常情况下, 人与人之间的布鲁菌病传播是 极其罕见的, 但是也曾有报道, 哺乳期 [28] 内的母亲可以感染婴儿,也可以通过性传播 。 1.2.4 动物布鲁菌病 流产是家畜 (牛, 绵羊, 山羊, 猪和骆驼) 在感 染布鲁菌后最常出现的临床症状。 从原则上来看能够感染牛的布鲁氏菌种应该且只能是牛种布鲁菌, 但是在实际的研究 工作中我们发现, 牛也可以被猪种和羊种布鲁菌所感染。 羊种和猪种布鲁菌可能会严 重威胁公共卫生安全, 因为二者可以通过牛奶进行传播。 妊娠母畜感染布鲁菌病所表 现出的主要症状 是流 产(死胎,早产 或是弱胎 ) ,通常情况下,怀 孕母畜在妊娠后的 2 个半月内出现胎儿死亡或是子宫炎。 母畜在感染布鲁菌病后, 其产奶量也会下降四 分之一。 布鲁菌在感染母畜后, 多半会寄生在 乳前淋巴结以及乳腺内, 因此病原体不 断地被分泌到乳中。内蒙古农业 大学硕士 学位论文5 羊种布鲁菌是山羊布鲁菌病的主要病原体, 但在巴西等一些国家, 羊种布鲁菌己 经基本不存在, 牛种布鲁菌也就成为了感染羊 的主要病原体。 和牛布鲁菌病一样, 感 染后的山羊也是以晚期流产, 死胎, 生育能力下降, 产奶量减低为主要症状。 绵羊布 鲁菌病主要分为传统布鲁菌病和公羊附睾炎型布鲁菌病两种类型, 公羊附睾 炎型是由 绵羊种布鲁菌引起, 而传统的布鲁菌病是由羊种布鲁菌引起, 并且构成了与山羊布鲁 菌病等同的公共健康危害。 除了流产之外, 羊在感染布鲁菌病之后还可以出现睾丸炎, 跋行,后肢麻痹或脊椎炎,偶尔也会出现子宫炎或脓肿等临床特征。 骆驼主要是与感染布鲁菌病的绵羊、山羊和牛一起放牧被牛种和羊种布鲁菌感 染,感染后的骆驼奶是主要的传播媒介,但是这一情况在中东地区却没有得到重视。 犬布鲁菌病的主要病原体是犬种布鲁菌, 但是散养犬的布鲁菌病主要是由牛种布 鲁菌、 猪种布鲁菌和羊种布鲁菌感染而引起。 被犬种布鲁菌感染的犬可以引起犬的繁 殖障 碍,如流产、死胎、不孕等症状,也可表现出非繁殖障碍的症状,如视力缺陷, 肌肉关节或皮肤受损等。 尽管犬种布鲁菌不如其他几个种更容易使人易感, 但是人类 却是犬种布鲁菌的易感者, 在美国, 墨西哥, 巴西以及阿根廷都有人被犬种布鲁菌感 [29] 染的报道 。 因为犬的特殊地位, 它与我们人 类有太多的接触空间, 所以犬种布鲁菌 的防控也应得到有关部门的足够重视。 1.2.5 布鲁菌病的防控 1.2.5.1 无病地区的预防措施 1 坚持自繁自养,必须引入时,从无病地区引入并进行严格的检疫。 2 对畜群进行定期布鲁菌病监测。 3 畜群发生原因不明的流产 时, 应立即隔离病畜, 对流产物污染的环境和用具进行 彻底消毒, 对流产胎儿和母畜进行血清学检验, 如为布鲁菌病阳性则按病畜处理。 1.2.5.2 污染地区的防控措施 1 定期检疫 对检出的病畜要严格隔离饲养,严禁与健畜接触,种公畜必须检疫, 健康公畜才能作为种用。 2 检疫净化 对病畜群, 进行反复多次检疫, 病畜淘汰, 阳性畜隔离饲养, 继续利 用,逐步淘汰,直至全畜群均为阴性。 3 检 出 的病 畜( 有症 状的 牲畜 ) , 应立 即淘 汰,而 血 检阳 性畜 ,应 隔离 饲养 ,专 人 饲养,避免与健康畜只接触,如阳性畜只数量少,也可淘汰处理。 4 培养健康犊牛 母 牛可用健康种公牛的精液人工授精, 母牛产前、 产后要对母牛 体躯和产房环境进行彻底消毒, 犊牛出生后, 立即与母牛隔离, 喂初乳 5~7 天, 6 羊 布鲁 菌病疫苗 免疫后抗 体消长规 律研 究及 4 种抗 体检测方 法的比较 以后喂健康牛乳或消毒乳,1 年内检疫2 ~3 次 , 如检疫均为阴性, 则可送入健康 牛群饲养,如为阳性,则应淘汰。 5 病畜的处理 有布氏杆菌病症状的畜应坚决淘汰, 对于数量不多、 经济价值不大 的检疫阳性畜,也应以淘汰为主。 6 免疫接种对布鲁菌 病常在的畜群,应进行免疫接种。 ? 猪布鲁菌 2 号疫苗 该苗使用安全, 免疫效果 好, 可用于猪、 羊、 牛的免疫接种, 可用注射、 饮水、 喂服和气雾等方法进行免疫。 免疫 持续期: 猪、 羊 4.5 年, 牛 2~3 年。 ? 羊布鲁菌 5 号疫苗 可用于绵羊、牛和鹿的免疫。免疫持续期:羊 2 年, 牛 1 年。可用注射、口服和气雾等方法进行免疫,但疫苗对孕牛、泌乳牛及体弱牛, 有一定接种反应, 并对人有一定的致病力, 使用时应注意防护。 在使用时, 用猪 2 号或羊 5 号疫苗对畜群进行全部免疫,每 年 1 次,连续 3 年,然后停止免疫 , 对牛群再进行检疫监测,可很好地控制布鲁菌病的流行。 ? 19 号疫苗(S19 或 A19) 免疫效果好,免疫 期长达 6 年以上,但毒力较强, 怀 孕牛使用会导致流产。 7 加强消毒和兽医卫生措施 对被污染的牛舍、 运 动场、 饲槽、 水槽、 奶具和管理 用具要及时消毒, 特别是对产房要注意消毒, 对流产胎儿、 羊水、 胎衣、 阴道分 泌物等要经消毒后妥善处理,粪便垫草烧毁。 8 发生布鲁菌病时 病畜隔离, 扑杀并无害化处理。 流产物、 胎儿无害化处理, 环 境彻底消毒,周围地区紧急免疫接种,做好人员的防护。 1.2.5.3 欧洲布鲁菌病防控经验 防治控制的法规和技术措施: 1 当 流 行病 学调 查的 发病 率达 到 10 ~15 %以 上, 采 取全 部牲 畜 进 行疫 苗免 疫的 措 施。 2 当流行病学调查的发病率介于10~0.2% 之间, 则采用免疫、 检疫与屠宰相结合的 策略。 3 当流行病学调查的发病 率低于0.2%,实施检测与屠宰方针。 1.2.6 布鲁菌病的诊断 目前, 布鲁菌病检疫和诊断方法主要采用的是 两类, 一类是血清学方法, 一类是 细菌学方法。内蒙古农业 大学硕士 学位论文7 虽然目前血清学方法检测布鲁菌病的种类很多,但是从总体上来说,在特异性、 敏感性以及操作性方面没有哪种方法能够让人十分满意。血清学方法主要有凝集试 验、 补体结合试验、 乳环试验、ELISA 等。 传 统的凝集试验方法在发达国家基本上已 经停止使用, 取而代之的是缓冲布鲁菌抗原试 验, 包括卡片试验、 虎红平板凝集试验 (RBT ) 和缓冲平板凝集试验 (BBAT ) 。 试管 凝集反应 (SAT)是 中国布鲁菌病诊断 的法定正式试验。 补体结合试验 (CFT ) 是国际贸易指定用于牛、 羊附睾布鲁菌病诊 断的确诊试验。 乳环试验 (MRT ) 是监测奶牛是否感染布鲁菌病的主要方法。 该方法 操作简便、 快速, 而且能够克服采血所造成的不便, 对动物机体几乎没有刺激, 不会 [30] 影响到大群奶牛的正常生产 。 国际中, 世界动物卫生组织 (OIE ) 规定的国 际贸易指定试验有 BBATs 、 ELISA (牛/ 猪布鲁菌病) 和 CFT , 而我国现行布鲁菌 病诊断的国标是 1998 年制订的, 在实 际检疫采取的是 RBT 筛选、SAT 确诊的检疫程序。 1.2.7 布鲁菌 病的疫苗 布鲁菌属于胞内寄生菌, 目前还没有理想的治疗手段和药物。 疫苗预防是防控该 病的唯一有效手段。 布鲁菌的免疫机制目前还没有完全清楚, 但是无论是体液免疫反 应还是细胞免疫反应对布鲁菌的清除都是起作用的, 但是细胞免疫反应是排除胞内寄 生菌最主要的免疫机制。 布鲁菌病疫苗作为防控布鲁菌病有效的手段, 它的研制一直是布鲁菌病防控的主 要研究热点, 而且现阶段国内国际所取得的成果是非常显著的。 在 20 世 纪 80 年代布 鲁菌病在我国得到了有效的控制,这一成果就得益于中国自主研发的布鲁菌弱毒苗 S2 和 M5。 目前在生产实践中, 我们常用于动 物布鲁菌病防控的减毒活菌苗主要有牛 布鲁菌苗 S19 、猪布鲁菌苗 S2、羊布鲁菌苗 M5 和 Rev-1、粗糙型牛布鲁菌苗 RB51 [31] 等。 灭活苗有牛布鲁菌 45/20 、 羊布鲁菌 53H38 等 。 对于人间布鲁菌病的预防有极 少数国家和地区采用的是活疫苗, 牛布鲁菌苗 BA-19 和 104M 作为一种安全性适用性 [32] 较高的活疫苗在中国及个别国家有使用到 。作 为 历 史 上 应 用 最 广 泛 的 布 鲁 菌 病 疫 苗,S19 是在 1923 年由 Buck 从牛奶中分离出 的有毒株, 后在实验室中进行了长时间 的培养使其成为减毒株。在菌体中含有的 O 链 LPS 能持续刺激机体产生抗 体,对牛 [33] 有一定的保护力 。Rev-1 是在欧洲广泛使用预防绵羊和山羊布鲁菌病的减毒苗。S2 和 M5 毒力介于 S19 和 104M 之间。目前中国广泛使用的 S2 株疫苗,它的保护率高 [34] 于 Rev-1 和 53H38 , 毒力相对稳定, 在我们国 家多将 S2 疫苗用于牲畜的口服免疫 , 在 1984 年该疫苗开始由我国出口至英国、法 国、德国等发达国家,这也彰显了我国 在布鲁菌病疫苗方面的研究取得的成果。 M5 疫 苗的免疫原性好, 因此它适用于皮下、 肌肉、 口服等多种免疫途径, 而且本疫苗制备 出了特异性单克隆抗体, 可鉴别出动物 8 羊 布鲁 菌病疫苗 免疫后抗 体消长规 律研 究及 4 种抗 体检测方 法的比较 是由 M5 疫苗接种感染的还 是自然感染的,但 它的缺点是能够导致怀孕动物的流产, 从而造成不必要的经济损失, 另外它还可引起接触气雾的人产生较严重的反应, 而且 由于该毒株连续的通过豚鼠传代, 其菌株毒力有所升高, 因此导致免疫感染后病原菌 牲畜的体内毒力过高, 使牲畜产生明显的临床病理表现, 甚至造成更严重的经济损失, 因此,在现今的畜牧业生产实践当中,M5 株 疫苗已经不作为预防布鲁菌病 的首选。 粗糙型牛布鲁菌苗 RB51 由于缺少 O 链 LPS , 其刺激机体产生的免疫可减少对布鲁菌 病诊断的干扰, 但由于该疫苗对羊感染布鲁菌病的保护力较差, 这也限制了该疫苗的 [35] 使用范围和适 用动物的群体 。 闫广谋等构建 敲除毒力因子的布鲁菌弱毒株作为疫苗 免疫动物, 通过检测机体是否产生被敲除毒力因子的抗体, 排除疫苗接种对诊断的影 响,但该疫苗保护力还没有看到有进一步被证实的报道。 布鲁菌病疫苗的研制是布鲁菌病预防的关键所在, 也是重中之重。 从这些年国内 外的研究经验来看, 在应用中产生显著效果的布鲁菌病疫苗大多是全菌苗, 但是随着 分子生物学的高速发展, 布鲁菌病的组分苗和基因工程苗这些新型的疫苗, 也成为了 布鲁菌病疫苗研制的新热点。 有研究发现利用布鲁菌蛋白或核酸组分免疫动物可产生 [36] 一定的保护作用 。组 分苗具有无菌体毒力增 强现象和致敏原性弱等优点, 但是由于 它的免疫期短, 这使得被免疫动物在一年内要进行多次免疫才能够达到免疫效果, 另 外该疫苗的生产工艺相对复杂且造价高, 这就使得组分苗很难在日常的畜牧业生产中 得到大规模的推广, 也就很难产生综合性免疫效果。 利用布鲁菌外膜表面蛋白 (OMP ) 及一些毒力因子 (LPS 、 过氧化氢酶、 超氧化 物歧化酶等) 开发基因工程苗也是布鲁 [37] 菌病疫苗研发的新的切入点 。 但是这些疫苗 的研制大多数还处于研究的阶段, 在不 久的将来我们希望能够看到这些新型的疫苗能够为布鲁菌病的预防做出贡献, 也希望 能够有更多更完善更安全的疫苗被研制出来。 1.2.8 布鲁菌病的治疗 在治疗人布鲁菌病的抗生素还没有被发现以前,人们形象的将布鲁菌病描述为 [27] “它是不死 人的病, 但是可 以折磨人 致死。 ” 由于布鲁菌为 细胞内寄 生,应 用抗菌 类药物是很难彻底将其治愈的, 所以在一般情况下均采用的是临诊治愈, 治愈后的患 者或病畜仍然为布鲁菌的带菌者, 仍可向外排菌, 在遭遇病痛或缺乏营养等状况导致 体质的下降, 抵抗力降低时, 还可能反复的出现发病的情况, 因此, 对本病病牛一般 不进行治疗。 如果要治疗时, 可采用土霉素、 磺胺类抗菌药物在严格隔离的条件下 进 行治疗。 由于布鲁菌胞内寄生的位置以及他对巨噬细胞的复制小体内环境的适应, 使得人 的布鲁菌病的治疗很困难并且复发率非常高, 布鲁菌病的治疗依靠多种药物的联合作 用以及病人对药物的适应性。 目前的研究发现, 布鲁菌病最佳的治疗是两种抗生 内蒙古农业 大学硕士 学位论文9 素的合并使用, 由于单一的抗生素治疗容易复发, 长效土霉素和链霉素的合并使用是 目前最佳的治疗方案, 这样可以减少副作用和复发率。 链霉素和长效土霉素单独使用 都不会有效的控制布鲁菌在胞内的复制, 尽管链霉素治疗被认为是治疗布鲁菌病最有 [38] 效的方案, 但是在实践中是很少使用的, 因为必须经注射给药三周 。 长效 土霉素和 庆大霉素合并交替治疗 7 天也是可行的治疗方 案。 尽管多年来链霉素合并疗法己经被 世界卫生组织 (WHO ) 认为是治疗布鲁菌病标 准方案, 但是 1986 年 FAO/WHO 布鲁 菌病专家委员会开始推荐利福平加长效土霉素用于治疗成人的急性布鲁菌病。 然而这 种治疗方案与有效的链霉素和传统的链霉素合并疗法相比较, 其效果对于急性布鲁菌 病患者还是不够理想。 布鲁菌病的治疗原则 ? 早治疗。 诊断结果一旦得到确认, 应立即给予治疗, 以防疾病向慢性疾病的发展; ? 联合用药,剂量足,疗程够。一般联合两种抗菌药,连续使用 2~3 个疗程; ? 中西医结合。中医包括蒙医、藏医和汉医; ? 综合治疗。 以药物治疗为主,佐以支持疗法,以提高患者的综合抵抗力。 1.2.9 困难与展望 国际通用的布鲁菌病检疫清除程序包括对存在危险的传播途径所进行的宣传教 育(有病畜的农场、 兽医、屠宰工人 、消费者 、猎人、公众) 、对 感染动物群体的检 疫、 对未感染的动物进行疫苗接种、 对已感染 的病畜进行清除和扑杀、 对 饲养场和动 物活动区域的清洁与 消毒(包括衣服 与设备) 、对肉品、饲料等进 行的各种调查追溯 手段、 乳及乳产品、 鱼及肉的灭菌或消毒。 在我国, 对布鲁菌病的检疫清除程序是采 用检疫、免疫、扑杀 病畜的综合防制措施。 目前, 我国牛羊饲养地区布鲁菌病防控的形势不是很乐观, 造成这种情况的主要 原因是因为牛羊等动物的经济价值在逐步的升高, 补贴资金无法到位, 这样扑杀等政 策就难以实施; 家畜的流通性大, 特别是种畜的异地使用, 异地贩卖, 这就使得布鲁 菌病极易进行散播; 农民们出于收支盈利等方面的考量, 不愿意自己出钱实施免 疫, 这样动物的免疫就难以实施; 发现病人或 患畜农牧民可以配合当地的疾病控制中 心进行检测和治疗, 但是患病的动物却难以实施安全的处置; 疫苗在使用过程中易出 现各种问题, 由于使用的大多为活菌苗, 不能 完全在封闭 情况下进行的免疫活动都可 能导致动物和人感染到布鲁菌病,有人由于免疫活动感染此病便会产生畏惧的心理, 因此这都会使得防控工作不能顺利进行; 防疫经费严重不足, 布鲁菌病流行较为严重 的省区都是畜牧业较为发达的省区, 同时也多 为经济不发达的地区, 因此, 用于该病 的防疫经费就十分有限; 由于我国现阶段的基本国情, 规模化养殖还没又得到大规模 的实现, 而对于个体养殖户难以实施强制性的免疫接种, 一个地区只要有为免疫的动 10 羊 布鲁 菌病疫苗 免疫后抗 体消长 规律 研究及 4 种 抗体检测 方法的比 较 物, 哪怕是零散的情况都可能导致该地区防控工作的功亏一篑; 没有准确的方法来区 别免疫与非免疫动物的布鲁菌病抗体阳性问题, 这 便导致了动物的病健分群无法得到 实施,只能进行全群,全地区的免疫,计划免疫无法实现。 由于现阶段我国对于病畜的扑杀政策难以完全实施, 国内外又没有准确的方法来 区分病畜究竟是疫源感染动物还是健康接种动物, 这样就造成传染源长期存在, 从而 导致疫病的持续传播。 因此准确诊断布鲁菌病感染动物, 正确区分健康接种动物和自 然感染动物, 研究布鲁菌病致病的分子机制, 对控制布鲁菌病的暴发与流 行、 特别是 传染源的控制显得尤其重要。 1.3 血清学方法在布鲁菌病抗体检测中的应用及现状 1.3.1 凝集试验在布鲁菌病抗体检测中的应用 传统的凝集试验在发达国家已基本上停止使用, 取而代之的是缓冲布鲁氏 菌抗原 试验(BBATs ) , 包 括 卡 片 试 验 、 虎 红 平 板 凝 集 试 验 (