阴道液中唾液酸酶活性、阴道加德纳菌及其IgA水平的相关性研究

阴道液中唾液酸酶活性、阴道加德纳菌及其IgA水平的相关性研究 阴道液中唾液酸酶活性、阴道加德纳菌及其 IgA水平的相关性研究 176ChineseJournalofMicroecology,June2006,Vo1.18No.3 文章编号:1005-376x(2006)03-Ol76-o3【论着】 阴道液中唾液酸酶活性,阴道加德纳菌及其IgA水平的相关性研究 楼永良,刘佳明 (1.温州医学院检验医学院,浙江温州325035;2.温州医学院公共卫生学院,浙江温州325035) 【摘要】目的探讨阴道液中唾液酸酶活性,阴道加德纳菌及抗阴道加德纳菌的溶血素(anti—Gvh)IgA水平 在细菌性阴道病(BV)的相关性.方法对15例健康人和6O例临床诊断为BV的患者,取阴道分泌物分别进行唾 液酸酶活性和anti—GvhIgA水平测定及阴道加德纳菌(Gv)分离培养.唾液酸酶活性利用从底物-5溴4氯-3吲哚 基…otDN乙酰基神经氨酸(X—Neu5Ac)转化而得到的甲氧基苯酚的纳摩尔数来表示;anti—GvhIgA通过ELISA法测 定.结果BV组Gv活菌数(6.96logCFU/g)显着高于健康对照组(2.58logCFU/g)(P<0.O1).BV组anti-Gvh IGA(238.0?220.6)显着高于健康对照组(175.0~40.16)(P<O.01).BV组Gv分离率(86.7%)显着高于健康对 照组(33.3%)(P<O.O1).45例临床诊断为BV的患者中,其中26例GvhIgA(+),19GvhIgA(一);GvhIgA 例 (一)组阴道液中唾液酸酶活性(5.00?1.29)显着高于GvhigA(十)组(1.58?1.22)(P<O.O1),2组的Gv的分离 率和活菌数差异却没有显着性(P>0.05).结论BV患者阴道内高活性的唾液酸酶与低水平anti-Gvhlea和黏 膜IgA破坏程度具有关联性. 【关键词】细菌性阴道病;唾液酸酶;阴道加德纳菌;免疫球蛋白A 【中图分类号】R7I1.73【文献标识码】A Acorrelationstudyamongsialidaseactivity,Gardnerellavaginalisandimmunoglobu- linAagainstGardnerellavaginalishemolysininvaginalfluidsfrompatientswithbac- terialvaginosis LOUYong-liang,LIUJia.ming (1.DepartmentofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China;2.ThePublicHealthSchoolof WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China) 【Abstract】 0bJectlveToexplorethecorrelationamongsialidaseactivity,Gardnerellavaginalisandtheanti— Gardnerellavaginallshemolysin(Gvh)ImmunoglobulinA(IgA)invaginalfluidsfrompatientswithbacterialvaginosis. MethodsThestudypopulationcomprisedof15healthyvolunteers,60womenwithbacterialvaginosis.Bacterialvaginosis waBdiagnosedbyclinicalcriteria.Thevaginalfluidsfrompatientswithbacterialwiginosiswereevaluatedforsialidaselev— elsandanti— GvhIgAandculturedisolationofGardnerellavaginalis(Gv).Sialidaseactivityusing5-bromo-4-chloroindol-3? D—N—acetylneuraminicacid(X— Neu5Ac)asthesubstrate,specificactivitywasexpressed聃nanomolesofmethoxyphenol produced.ELISAforanti— GvhIgA.ResultsThemeancountofGvwassignificantlyhigherinBVgroupthaninthehealth— Ycounterpart(6.96logCFU/gvs2.58logCFU/g)(P<0.O1).ThepositiverateofGvinBVpatientswerehigherthan thatinhealthycontrolgroupcounterpart(86.7%vs33.3%)(P<0.01).Theanti— GvhIgAwassignificantlyhigherinBV groupthaninthehealthycounterpart(238.0?220.6vs175.0? 40.16)(P<0.O1).TheBVpatientscomprised26 womenwithbacterialVanosisthatwaspositiveforanti— GvhIgAand19womenwithbacterialvaginosisthatwasnegative foranti— GvhIgA.Womenhavingbacterialvaginosisoflackinganti-GvhIgAhadasignificantlyhighe rlevelofsialidaseac- tivitythanBVpatientswhohadananti—GvhIgA(P<0.O1)counterpart(5.00? 1.29vs1.58?1.22);However,BVpa— tientswhohadananti--GvhIgAgroupandBVpatientsoflackinganti--GvhIgAwerenosignif icantdifferencenotonlythe positiveratebutalsothecountofGv(P>0.05).ConclusionThepresenceofhighlevelsofVa ginalsialidaseactivitywas associatedwithlowanti—GvhIgAandwithmucosalIgAdegradationinwomenwithBV. 【Keywords】Bacterialvaginosis;Sialidase;Gardenerellavaginalls;ImmunoglobulinA 细菌性阴道病(bacterialvaginosis,BV)是育龄妇 女最常见的感染性疾病之一,发病率呈明显上升趋 势.BV患者虽然临床症状较轻,但由于治疗后易于 复发,未经及时的诊断治疗,其不良妊娠,盆腔炎和泌 尿系感染的发生率可明显升高,对妇女的身心影响更 大.随着人们对BV发病机制探讨进一步深入,在 BV患者的阴道分泌物中常常能够检测到阴道加德纳 菌(C.ardenerellavaginalis,Gv)存在,但在健康妇女阴 道中也能榆测到,是否将其列为敛病菌仍彳F论中…. 【收稿日期】2005.12.13 【基金项目】温州『ff科技汁划项目(Y2004al17) 【作者简介】楼永良(1965),男,剐教授,从事学徵物研究 过去,人们对阴道加德纳菌及其IgA对应关系没有深 入研究,近年研究发现,症状严重BV的患者中,抗阴 道加德纳菌溶血素(anti-Gardnerellavaginalishemoly sin,rh)lgA反而降低.最近的研究证实,阴道分泌 物中唾液酸酶活性与BV之间存在一定的量的关系, 无BV的妇女则不显示异常的唾液酸酶活性,唾液酸 酶活性町以反映BV的严重程度,因此,该研究通过 测定BV患者及正常妇女的阴道分泌物唾液酸酶活 性,anti—GvhlgA水卜及对Gv进行分离培养,探讨了 阴道液中唾液酸酶活性,阴道加德纳菌及抗阴道加德 纳菌的溶fn1素anti—GvhlgA水平在细菌性阴道病的相 关性及其在BV诊断中的应用价值. 中国微生态学杂志2006年6月第l8卷第3期l77 1对象与方法 1.1研究对象患者来自温州医学院附属二院妇科 门诊.包括健康者15例,年龄2O一35岁,妇科体检 正常;BV患者6O例,年龄24—45岁.人选标准:(1) 2周内无全身应用抗生素及阴道局部用药史;(2)3 天内无性生活史.按Amsel法确诊BV患者,判断标 准如下:(1)阴道分泌物稀薄奶样;(2)阴道pH> 4.5;(3)胺试验阳性;(4)线索细胞阳性;以上4项有 3项阳性即为BV阳性. 1.2研究方法 1.2.1样本收集外阴消毒后将无菌生理盐水浸湿 的棉拭子2根于阴道后穹隆或阴道深部取材,避免官 颈处,停留3Os,并尽可能多地收集阴道分泌物,1根棉 拭子置于1OmlPBS中,充分混合后,4?离心3000 r/rain,10min,取上清液1rnl,一7O?冰箱保藏;另一根 棉拭子进行细菌学分析. 1.2.2Gv分离培养棉拭子取材后,接种到加德纳 菌培养基(阴道加德纳菌选择培养基购自OXOID公 司),然后置于5%二氧化碳孵箱内,35?培养48h 后进行活菌计数(CFU/m1)及分离百分率的计算;并 对检出的微生物进行生化鉴定. 1.2.3唾液酸酶活性测定(Sialidase,SD)根据 CAUCI等J,取阴道分泌物离心上清液5Ol,加入 5Ol酶反应底物(5溴4氯_3吲哚基一—D-N乙酰基 神经氨酸,Sigma公司,134666),pH5.O下,充分混 合,37?温浴9Orain.在加入显影液(4mmoVL4一氨 基安替比林和6mmoVL铁氰化钾)之后,观察反应瓶 颜色变化,具有唾液酸酶活性的样品显现出红色,为 阳性,无色为阴性.唾液酸酶的活性利用从底物转化 来的甲氧基苯酚的nmol表示,检测A值,并通过将 其与纯甲氧基苯酚的标准曲线进行比较而进行计算. 高唾液酸酶活性定义为?5.0nmol甲氧基苯酚. 1.2.4anti-GvhIgAELISA方法,Gv(标准菌株 购自中国医学科学院)为包被抗原,受试对象阴道分 泌物为一抗(1:200稀释),Ap标记抗人IgA(1:5000 稀释,Sigma)为二抗,对硝基苯磷酸酯(p-Npp)为底 物,显色后检测A柏处的吸光度值.小于380mA定 义为anti-GvhIgA(一),大于760mA定义为anti-Gvh IgA(++). 1.3统计学分析计量资料数据结果以?s表示, 采用t检验;计数资料数据结果采用;数据间比较采 用SPSS12.0软件进行,P<0.05为有统计学意义. 2结果 人选研究对象75例,其中BV患者6O例,健康妇 女l5例.健康对照组与BV组阴道分泌物测定结果 详见表1.健康对照组唾液酸酶活性为零,其pH,an. tii-GvhIgA水平明显低于BV组,两组之间差异有非 常显着性(P<0.O1),Gv活菌数和分离率明显低于 BV组,两组之间差异有非常显着性(P<0.O1). 6O例临床诊断为BV的患者中,其中26例anti- GvhIgA(+),34例anti-GvhIgA(一).Anti-GvhIgA (一)BV组阴道液中唾液酸酶活性与anti.GvhIgA (+)BV组,两组之间差异无显着性(P=0.061).两 组的Gv的分离率和活菌数差异无显着性(P> 0.05),详见表2. 在6O例临床诊断为BV的患者中,其中16例an— ti.GvhIgA(++),27例Anti-GvhIgA(一)+高唾液 酸酶活性BV.Anti.GvhIgA(一)+高唾液酸酶活性 BV组阴道液中唾液酸酶活性明显高于anti—GvhIgA (++)BV组,两组之间差异有非常显着性(P< 0.O1).两组的Gv的分离率和活菌数差异无显着性 (P>0.05),详见表3. 表1BV患者与健康妇女阴道液比较 注:值为与正常对照组比较,P<0.05 表2GvhIgA(+)BV患者和GvhIgA(一)BV患者的阴道液比较 注:1.表中CvhIgA(+)即Anti-GvIgA?38OmA;GvhJgA(一)即Anti?GvIgA<380mA; 2.t值为与Anti?GvhIgA(一)BV身l比较,'P<0.05 表3Anti.GvhIgA(++)BV患者和GvhIgA(一)+高唾液酸酶活性BV患者的阴道液比较 洼:1.表中GvhIgA(++)即Anti.CvIgA?76OmA;CvhIgA(一)即Anti—CvIgA<380mA;高唾液酸酶活性定义为?5.0nmol【}J氧皋苯酚; 2.t俩为与Anti-CvhIgA(++)BV纠比较,'P<0.05 178ChineseJoumalofMicroecology,June2006,Vo1.18No.3 3讨论 BV是指一类在细菌学上表现为阴道内正常菌群 (主要为产H0乳酸杆菌)数量减少,代之阴道加德 纳菌,厌氧菌(类杆菌,Mobiluncusspp,PrevoteUaspp和 支原体等)数量增加的临床症候群j.有关BV患者 的发病机制的研究较多,最初的研究主要集中在Gv 上,将其认为致病菌,但大多数研究结果显示:Gv与 BV没有必然的联系,同时临床上发现的Gv并不能确 定为BV患者.在健康妇女阴道中也能发现Gv.BV 患者与健康妇女中Gv的检出率差异存在显着性.研 究结果提示BV患者中Gv检出率为86.7%,健康对 照组为33.3%,差异有非常显着性(P<0.001),与国 外报道相一致.….最近的研究证实,阴道液中唾液 酸酶活性与BV有高度的相关性,而酶则是由阴道菌 群中的厌氧菌产生,无BV的妇女则不显示异常的唾 液酸酶涪I生,唾液酸酶活性高可以反映阴道内厌氧菌 过度生长,符合BV厌氧菌过度生长的特点,PrevoteUa spp和类杆菌能产生唾液酸酶,20%Gv菌株能产生唾 液酸酶,而另外几种与细菌阴道病相关的Mobiluncus spp,消化性链球菌,支原体等不产生唾液酸酶. 阴道正常菌群代谢中产生一种蛋白水解酶,可以 裂解绞链区的二硫键,在正常阴道内长期维持在一个 恒定的较低水平.当阴道正常菌群发生比例失调时, 细菌的代谢产物也相应地发生较大的改变,患者阴道 ,阴道anti— 局部anti—GvhIgA浓度将会明显变化,因此 GvhIgA浓度可反映阴道菌群失调程度和整体免疫机 能状态.该研究结果显示,健康妇女阴道anti—Gvh IgA浓度为(175.0?40.16)吕/ml,BV组与正常对照 组比较水平明显升高(P<0.01),表明蛋白水解酶分 泌下降,同时,厌氧菌群数量增加激发机体整体免疫 应答,合成和分泌增多促使浓度升高.Anti—GvhIgA 水平的高低与BV严重程度相关.该研究显示,anti. GvhIgA(一)+高唾液酸酶活性BV组阴道液中唾液 酸酶活性明显高于anti—GvhlgA(++)BV组,两组之 间差异有非常显着性(P<0.01),而两组的Gv的分 离率和活菌数差异没有显着性(P>0.05),说明Gv 与anti—GvhIgA非同向性,阴道唾液酸酶活性增强可 能参与水解anti—GvhIgA的作用,这时anti—GvhIgA 可能已经大量被破坏了J,局部IgA浓度过低,造成 对局部病原体及其毒力因子的中和能力下降,同时代 表阴道内大量的厌氧菌繁殖的唾液酸酶活性较高,阴 道内微生态失凋已经非常严重,使感染顽固难治,预 示此时BV的严重性.我们测定的参数较少,未能全 面反应阴道黏膜局部的细胞免疫学情况,但目前结果 也提示了阴道液中唾液酸酶活性与Anti—GvhIgA水 平呈反相关系,anti—GvhIgA水平与BV的严重程度之 间有关系. 【参考文献】 [1JAROUTCHEVAAA,SIMOESJA.BEHBAKHTK.eta1.Gardnerella vaginalisisolatedfrompatientswithbacterialraginosisandfrompa— tientswithhealthyvaginalecosystems[J].ClinInfectDis,2001.33 (7):1022—1027. [2]HILLGB,DUKESCD.BUCKSHENK,eta1.Themicrobiologyof bacterinalvaginosis[J]_AmJObsterGynecol,2003,169:450458. [3]BRUSEKDEBAM,MONCIABJ,STEVENSCE.eta1.Sialidases (neumminidases)inbacterialvaginosisandbacterialvaginosis-?$oci— atexlmicmflora[J].ClinMicrobial,1992,30(3):633-666. 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[4]POIREI】,NAAST,NICOIASD,eta1.CharacterizationofVIM-2, acctrbapenem—bydn~lyzingmetallo—BLactamaseanditsplasmidandin— tcgrotl—1)omcgonefloraaP.~eiMorrwmzsaerugirwsaclinicalisolatein France[J].AntimicrobAgelttsChemother,2000,44(4):891-897. 【5J[AUIIEVI'II,RICCIOMI,MAZZARIOI.A.eta1.Cloningand characterizationIIfblaVIM,anewintcb~mbornemetallo—B.1actamase genefYmnaPseudoInOl~l$aeruginosaclinicalisolate『J].Antimicmb A1fChcnmlhcr,1999,43(7):1584-1590.