食管癌与P53突变和人乳头状肉瘤病毒感染

食管癌与P53突变和人乳头状肉瘤病毒感染 食管癌与p53突变和人乳头状肉瘤病毒感染 【摘要】目的探讨p53基因突变与人乳头状肉瘤病毒16(HPV16)感染在食管癌发病中的作用 及相互关系。应用病例-病例研究方法进行分析，采用聚合酶链反应(PCR)、单链构像多 态性(SSCP)、测序等分子生物学技术对110例食管癌组织标本中p53基因的突变与HPV16 感染进行了。结果110例食管癌组织标本p53基因突变率为49.1%，其中外显exon5-6， exon7，exon8-9的突变率分别为19.1%，27.3%，17.2%。食管癌组织HPV16的检出率为49.1%。 吸烟患者p53基因突变率(61.4%)明显高于非吸烟患者p53基因突变率(48.2%)，差异有统计 学意义;淋巴结转移患者p53基因突变率(65.2%)明显高于无淋巴结转移患者p53基因突变 率(37.5%);HPV16阳性者中，p53突变率是40.7%，HPV16阴性者仅为57.1%，两者差异 无统计学意义。 结论HPV16感染可能是食管癌高发区的危险因素;p53基因突变与吸烟、 淋巴结转移有明显相关性;HPV16感染和p53基因突变可能是2个独立的事件。 【关键词】 食管癌;人乳头瘤病毒;病例-病例研究;p53抑癌基因;单链构像多态性(SSCP) 基金项目: 福建医科大学"环境与健康"重点学科发展基金项目(GW08) Association between P53 mutation in human papillomavirus-associated and esophageal cancer HE Baochang，DUAN Guangcai，CAI Lin，et al. Department of Epidemiology and Statistic，College of Public Health，Fujian Medical University(Fuzhou 350004，China) Abstract: Objective To investigate the relationship between p53 mutations and human papillomavirus 16(HPV16) infections in esophageal cancer.Methods p53 mutations and infections were examined by polymerase chain reaction(PCR) and single strand conformation polymorphism(SSCP) and DNA direct sequencing analysis in the 110 exophageal cancers.The case-case study was used for factor anlysis.Results The rate of mutations in exon5-6，exon7， exon8-9 were 19.1%，27.3% and 17.2% respectively.The rate of p53 gene mutation was 61.4% in smoke groups and 48.2% in nosmoker groups.There was a significant difference between them.The rate of p53 gene mutation was 65.2% in lymph node metastasis groups and 37.5% in nolymph node metastasis groups.There was significant difference between them.The rate of p53 gene mutation was 40.7% in HPV16 negative groups and 57.1% in HPV16 positive groups，There was no association between HPV16 status and p53 mutations.Conclusion High-risk HPV plays an important role in the development of esophageal cancer.There is a significant difference between p53 mutations and lymph node metastasis.This result may predict that the cases could be deteriorated after the operation.p53 gene mutations may play an important role in the mechanism of esophageal cancer and support the relationship between p53 mutations and HPV infection not to be mutually exclusive. Key words: esophageal cancer，human papillomavirus;case-case study;p53 tumor suppressor gene;single strand conformation polymorphism 食管癌是发展中国家发病率很高的恶性肿瘤之一，人乳头瘤病毒(HPV)感染作为食管癌重要 因素一直受到关注，但其致癌机制仍不十分清楚。p53是普遍公认的抑癌基因，它的突变可 导致多种肿瘤的发生〔1〕。p53突变是引起p53基因功能丧失的一条重要途径，而高危型 HPV E6癌蛋白与p53蛋白结合，可引起p53失去功能〔2〕。为了解HPV感染与p53突变 的关系，本研究采用病例-病例对照方法，分析食管癌HPV16感染与p53突变的相互作用， 进一步探讨食管癌的发病机制。结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象 收集安阳肿瘤医院胸外科食管癌病人标本110例，其中男性65例，女性45例。年龄42, Http://Www.Yaokuo.Com 78岁，平均年龄59岁。病例均经组织病理学诊断，其中高分化鳞癌22例，中分化鳞癌58例，低分化鳞癌25例，腺癌5例。术前未经放疗化疗，并在原居地居住20年以上。 1.2 方法 1.2.1 病例资料收集 采用自行的调查问卷和病例，收集人口统计学资料、吸烟饮酒资料、家族史及个人膳食习惯。 1.2.2 HPV PCR检测 参照文献〔3〕设计引物序列，上游引物为5′-GCAAGCAACAGTTACTGCGA-3′ 下游引物5′-CAACAAGACATACATCGACC-3′。引物由上海生工公司合成，产物为321bp。25μl PCR反应体系为:Taq DNA聚合酶2.5u(日本TaKaRa公司)，1.5 mmol/L MgCl2及其10×缓冲液(日本TaKaRa公司)，dNTP 0.2 μmol/L，0.4 μmol/L每种引物，加入2 μl模板DNA，加双蒸水至25 μl。PCR在Biometra Tgradient PCR扩增仪上进行，反应条件为94?预变性120 s，循环参数为94? 45 s，56?，45 s，72? 60 s，累计循环39个周期，最后72?延伸600 s。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果在凝胶成像系统中观察，分子量为100 bp DNA Ladder，阳性对照为HPV16阳性质粒(北京肿瘤防治研究所柯杨教授实验室惠赠);阴性对照不加模板。阳性结果在凝胶成像系统中可看到321 bp的HPV片段。 1.2.3 p53基因突变分析 参照文献〔,〕设计引物序列，针对exons5-9设计3对引物用于3个不同的PCR反应中，产生3个片段:exon5-6(467 bp)，exon7(237 bp)和exon8-9(445 bp)。引物由上海生工公司合成。先通过单链构像多态性(SSCP)技术筛选出阳性或可疑的标本，每次电泳均设有正常对照，正常对照均经测序判为正常，标本电泳条带和正常对照相比出现位移、条带增多或缺失等为阳性，对可疑的直接测序。 1.4 统计分析 应用Excel 2003软件输入数据，采用SPSS 11.0软件进行统计分析。将研究对象按生物标志物的暴露与否进行分类，用χ2检验及非条件Logistic回归进行分析，并计算OR值及95%CI;若n,40或理论数,1，选用Fisher确切概度法处理。 2 结 果 2.1 HPV16感染与食管癌的关系(图1) 结果表明，110例食管癌病例中，HPV16阳性者54例，总阳性率为49.1%。HPV16检出率与患者年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤分级、肿瘤大体类型及肿瘤位置无明显相关性。吸烟(χ2=2.3，P=0.1)、饮酒(χ2=1.3，P=0.3)、食管癌家族史(P=1.0)与HPV相关食管癌无相关性。 2.3 p53突变与食管癌主要相关因素关系(表1) 在食管癌患者中，p53基因突变与饮酒及家族史无关;而与淋巴结转移(χ2=8.23，P=0.004)和吸烟(χ2=4.42，P=0.004)明显相关，调整性别和年龄，差异仍有统计学意义。表1 p53突变与食管癌患者主要临床特征的关系(略)注:*为调整性别及年龄;**P,0.05。 2.4 p53基因突变与HPV16感染的关系 在HPV16阳性患者54例，有22例p53基因突变，p53基因突变率为40.7%，在HPV16阴性患者56例，有32例p53基因突变，p53基因突变率为57.1%，差异无统计学意义(χ2=2.96，P=0.085)。 2.5 p53突变及HPV16感染与不同类型肿瘤关系 鳞癌中p53基因突变率为47.%，腺癌中p53基因突变率为80.0%，但差异无统计学意义(P=0.14);鳞癌中HPV16检出率为49.5%，腺癌中HPV16检出率为40.0%，差异亦无统计 Http://Www.Yaokuo.Com 学意义(P=0.32)。 3 讨 论 本文采取的病例-病例研究方法的特点是简单高效，所需样本量小，且不需另设对照组〔5〕。本研究发现，食管癌患者HPV DNA检出率为49.1%;肿瘤分级及淋巴结转移与HPV相关食管癌无明显相关性。提示该地区食管癌组织中确实存在HPV DNA，但其与食管癌的发生是否确实存在因果关系，尚需作进一步的病因学研究。 本研究发现，110例食管癌p53基因的exon5-6，exon7，exon8-9的突变率分别为19.1%，27.3%和17.2%，以exon7突变频率最高，exon8-9突变频率最低;吸烟者中p53突变率较高。结果表明，p53基因的突变与食管癌的淋巴转移密切相关，与有关报告一致〔6-10〕，提示p53突变与食管癌的预后密切相关，将对本研究人群作进一步随访调查，以验证p53突变与食管癌患者预后的关系。 HPV E6癌蛋白可以通过E6相关蛋白(E6-AP)同p53结合，不但能抑制p53蛋白与DNA上特异性位点的结合，而且能使已结合的p53蛋白从DNA上解离并使p53蛋白经泛素介导途径而降解，使细胞增殖失控，细胞调亡机械存在缺陷，促使细胞永生化〔11〕。E6癌蛋白引起p53的失活在HPV的失活在HPV引起的肿瘤发生过程中起到重要作用。本研究结果表明，在HPV16阳性患者中，p53基因突变率为40.5%，在HPV16阴性患者中，p53基因突变率57.1%，p53基因突变在HPV16阴性组和HPV16阳性组比较差异无统计学意义，与有关研究结果一致〔3，12〕。本研究结果表明，在HPV16阴性和HPV16阳性的食管癌组织中存在着频繁的p53基因突变，提示p53失活很可能是食管癌发生过程中的一种重要的分子途径，HPV感染和p53基因exons5-9突变可能是2个独立的事件。HPV的参与和p53基因的突变可能在食管癌的发生、发展中起重要作用，进一步研究它们之间的关系及其作用机制，将对食管癌的发病原因及预防和治疗产生重要意义。 【参考文献】 〔1〕Greenblatt MS，Bennett WP，Hollstein M，et al.Mutations in the p53 tumor suppressor gene:clues to cancer etiology and molecular pathogenesis,J,.Cancer Res，1994，54(18):4855-4878. 〔2〕Coper B，Schneider S，Bohl J，et al.Requirement of E6AP and the features of human papillomavirus E6 necessary to support degradation of p53,J,.Virology，2003，6(1):87-99. 〔3〕陆哲明，陈克能，郭梅，等.食管癌高发区HPV检测及与p53的关系,J,.中华肿瘤杂志，2001，23(3):220-223. 〔4〕Dai M，Clifford GM，le Calvez F，et al.Human papillomavirus type 16 and tP53 mutation in oral cancer:matched analysis of the IARC muticenter study,J,.Cancer Research，2004，64(2):468-471. 〔5〕徐德忠，李良寿.分子流行病学,M,//徐德忠.北京:人民军医出版社，1998:14-15. 〔6〕Zhou XB，Guo M，Quan LP，et al.Detection of human papillomavirus in Chinese esophageal squamous cell carcinoma and its adjacent normal epithelium,J,.World J Gastroenterol，2003，9(6):1170-1173. 〔7〕穆雅琴，赵富玺，郭俊成，等.宫颈癌凋亡抑制因子表达与HPV16/18感染相关性,J,.中国公共卫生，2006，22(12):1416-1418. 〔8〕王波，张艳，张磊，等.食管癌p53基因第5外基因第5外显子突变分析,J,.中国公共卫生，2006，22(3):288-289. 〔9〕Sanjay Katiyar，Suresh Hedau，Neeraj Jain，et al.p53 gene mutation and human papillomavirus(HPV) infection in esophageal carcinoma from three different endemic geographic Http://Www.Yaokuo.Com regions of India,J,.Cancer Hetters，2006，218(1):69-79. 〔10〕Hattori K，Kajiyama Y，Tsurumaru M.Mutation of the p53 gene predicts lymph node metastases in Japanese patients with esophageal carcinoma:DNA and immunohistochemical analyses,J,.Dis Esophagus，2003，16(4):301-306. 〔11〕Cooper B，Schneider S，Bohl J，et al.Requirement of E6AP and the features of human papillomavirus E6 necessary to support degradation of p53,J,.Virology，2003，6(1):87-99. 〔12〕潘华雄，吴翠环，王智国，等.肺鳞状细胞癌中人类乳头瘤病毒16/18感染和p53蛋白 表达的关系,J,.华中科技大学学报:医学版，2006，35(4):440-443. 作者:何保昌，段广才，蔡琳，代敏作者单位:1.福建医科大学公共卫生学院流行病与卫生 统计学系，福州350004; 2.郑州大学流行病学教研室 申明:本论文版权归原刊发杂志社所有,我们转载的目的是用于学术交流与讨论,论述仅供参 考不构成任何学术建议。 Http://Www.Yaokuo.Com