金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布的研究（可编辑）

金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布的研究（可编辑） 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布的研究 河北农业大学 硕士学位论文 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 姓名:魏志恒 申请学位级别:硕士 专业:农产品加工及贮藏 指导教师:贾英民 2009-06-12 摘 要 近年来，世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生，无论发达国家还是 发展中 国家，食源性疾病的发生率居高不下。食源性疾病与食品污染构成了一个巨大并不 断扩大的世界性公共卫生问题。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)广泛存在于自然环 境中，对各种理化因素都有较高的抵抗力，不仅是引起细菌性食物中毒的重要病原 菌，同时也是医院临床感染的主要病原菌。因此从公共卫生学角度，金葡菌倍受人 们的关注，国内外许多专家学者针对金葡菌的生物学特性、检测技术、致病基因及 其毒力因子、流行病学进行了研究。 本文对采自石家庄地区速冻食品，生鲜肉，肉制品，水产品，生肉加工车间棉 拭子等 114 份样品进行金黄色葡萄球菌的分离与鉴定，金葡菌总检出率为20.2%; 本实验室前人对保定地区人化脓组织样品，理发用具，生牛奶，速冻食品，生鲜肉， 肉制品，水产品，果蔬，豆制品，空气，动物粪便及水等685 份样品进行金葡菌筛 选，金葡菌阳性检出率为22.6%。综合两个地区试验数据，证实保定和石家庄两地 金黄色葡萄球菌的污染程度较高，人化脓组织，理发用具，生牛奶，速冻食品，生 鲜肉受其污染严重，应引起相关人员高度重视。 溶血素是造成金黄色葡萄球菌感染的一种重要致病因子，对人和哺乳动物有细 胞毒作用，通过作用于红血球、血小板及溶解中性球，使其中的溶菌酵素释出，而 破坏附近组织。目前，金葡菌溶血素根据其抗原不同分 α、β、γ、δ 四种，对组织 造成伤害的通常是α-溶血素和β-溶血素。本试验合成hla、hlb、hlg、hld 四对 金黄色葡萄球菌溶血素基因引物，进行 PCR 鉴定，并对溶血素基因在金葡 菌分离 株中的分布状况进行研究。在分离得到的 324 株金黄色葡萄球菌中，91.98%含 α- 溶血素基因，65.12%含 β-溶血素基因，93.83%含 γ-溶血素基因，95.68%含 δ-溶血 素基因。在金黄色葡萄球菌分离株中，四种溶血素同时存在的情况最为常见 (60.19%)，其次是hla、hlg 和hld 三种溶血素基因的组合情况(29.01%)，而溶血 素基因的其他组合情况也广泛存在，但所占比例不高。本研究明，所分离的金黄 色葡萄球菌的带毒率较高。 鉴于目前状况，有待于进一步调查我国人群、家畜及食品中金葡菌的污染状况 及该病原菌的流行情况，为金黄色葡萄球菌引起疾病的监控、暴发流行的检测以及 污染源的追踪提供依据。 关键词:金黄色葡萄球菌;溶血素;PCR;分布 The Distribution of Staphylococcus aureus and Hemolysin Genes Author:Wei Zhiheng Tutor: Jia Yingmin Major: Primary Product Processing and Storage Engineering Abstract Recently, the food security has occurred frequently vicious in the world, whether developed or developing countries, food-borne disease incidence remains high. Foodborne diseases and food contamination and pose a huge growing public health problem worldwide. Staphylococcus aureus abbreviated S. aureus is widely present in the natural environment in a variety of physical and chemical factors on the higher resistance, not only of food poisoning caused by important bacterial pathogens, but also the hospital's main pathogens of clinical infection. From public health point of view, S. aureus has been attracted much attention. Many experts and scholars carried out studies on the biological characteristics of Staphylococcus aureus, detection technology, disease genes and their virulence factors, epidemiological investigation. In this paper, the overall detection rate of S. aureus-positive is 20.2% in 114 samples of Shijiazhuang, including frozen food, raw meat, meat products, aquatic products, cotton swab samples from meat processing plant. Predecessors of the laboratory had got the detection rate of 22.6% in 685 samples of Baoding including suppurative tissue of people, cut hair tools, raw milk, frozen food, raw meat, meat products, aquatic products, fruits and vegetables, soybean products, air, animal wastes and water. Comprehensive testing data of the two regions confirmed a high degree of pollution by Staphylococcus aureus in Baoding and Shijiazhuang. The serious pollution in human suppurative organizations, cut hair tools, raw milk, frozen food, raw meat should be paid much close attention. Hemolysin of Staphylococcus aureus is an important infections agents, which effects on mammalian cells by acting on the red blood cell, platelet and neutrophil so that the bacteriolytic enzyme release, and damage the nearby organizations. At present, the hemolysin of Staphylococcus aureus classfied four different tapings of sub-α, β, γ, δ in accordance with its antigen, and the harm to the organization is usually caused by α-and β-hemolysin hemolysin. We designed four pairs gene primers of hla, hlb, hlg, hld for PCR identification and studied the distribution the hemolysin genes in Staphylococcus aureus isolates. In the isolation of 324 Staphylococcus aureus, the 91.98% with α-hemolysin genes, 65.12% with β-hemolysin genes, 93.83% with γ-hemolysin genes, 95.68% with δ-hemolysin gene. In Staphylococcus aureus isolates, four hemolysins exist at the same time was the most common 60.19% , followed by the cases of combination of hla, hlg, and hld three hemolysin genes 29.01% , and hemolysin genes of other combinations also exist in a wide range, but the percentage is not high. This study shows that the poisoned rate of staphylococcus aureus we separated is relatively high. In view of the current situation, we should carry out further investigations on the contamination and the prevalence of Staphylococcus aureus in crowd of Chinese, livestock and food, as a foundation of the study on disease surveillance, outbreak detection of Staphylococcus aureus, as well as provide the basis for tracking sources. Key words: Staphylococcus aureus; hemolysins; PCR; distribution 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 也不包含为获得 河北农业大学 或其他教育已经发表或撰写过的研究成果， 机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 河北农业大学 有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编: 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 1 引言 1.1 目的意义 近年来，随着消费者对食品安全的关注及国际贸易环境的要求，食品安全问题得 到了前所未有的重视。而由致病性微生物和其他有毒、有害因素引起的食物中毒和食 源性疾病的发病率是衡量食品安全状况的直接指标，是食品安全问题最直接的体现。 确定食源性病原菌在食物链中相关的食品、寻找预防食品污染的关键环节、增强对突 发事件的反应能力、为制定行之有效的公共卫生政策提供科学依据、对公共卫生干预 行为的效果进行追踪和评价都依赖于检测的能力和水平。因此各国政府及食品卫生监 督机构都把发展和运用高新技术，建立和完善各自的食源性致病菌及食源性疾病的监 测、预警系统作为首要任务。我国亦将食源性疾病尤其是微生物污染引起的 食源性疾 病列为当前我国食品安全面临的八大难题的首要问题。于2002 年建立起全国食源性 [1] 疾病监测网 。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称金葡菌)在自然界中分布广泛， 空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，并且在人体主要存在于皮肤、粘膜， [2] 特别是鼻咽部，30%,80%的人群为该病原菌的携带者 ，因而，食品受其污染的机 据美国疾病控制中心，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中会很多。 毒居第一 位，占整个细菌性食物中毒的33%。由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件，近年来 首推2000 年日本“雪印奶粉”事件，造成 14000 多人受感染;印度每年由于金黄色葡 萄球菌食物中毒的爆发使得印度人民和政府承受着极为沉重的经济负担;美国多食用 禽畜肉、乳制品和糕点类，金黄色葡萄球菌食物中毒最多，其中美国食品药品管理局 (FDA)的“Bad Bug Book”中报道的典型事件是在美国德克萨斯州发生的由于金黄色 葡萄球菌污染鸡块色拉引起的食物中毒，该起食物中毒导致 16 所小学的5824 名学生 [3-10] 中有 1364 名患病。我国每年由金葡菌引起的食物中毒事件也很多 。 金黄色葡萄球菌在食品污染病例中占据着十分重要的位置，同时也是医院临床感 染的主要病原菌。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占居第二位， [11] 仅次于大肠杆菌 。被金葡菌感染可引起化脓性炎症、脑炎、心内膜炎等，严重者可 [12-16] 导致菌血症、败血症，继发死亡 。溶血素是造成金黄色葡萄球菌感染的一种重要 致病因子，对人和哺乳动物有细胞毒作用，通过作用于红血球、血小板及溶解中性球， 使其中的溶菌酵素释出，而破坏附近组织。 金黄色葡萄球菌作为医院临床感染的一种主要病原菌，及其在食品污染病例中占 [17] 。 因此，对于金 据的重要位置，成为与艾滋病、乙型肝炎并列的世界三大感染顽疾 黄色葡萄球菌潜在危害的研究已成为食品安全领域和医学领域的重点研究课题。 对于病原菌的分离鉴定、污染监测和对食物中毒等突发事件的追踪干预，其最终 预防食源性疾病的发生和蔓延。而快速追本目的是找出感染源及传播途径， 溯源的有 [18-27] 效手段是分子亚分型的方法 。我国金黄色葡萄球菌研究领域内，该研究仍为空白， 1 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 [27,28] 鉴定手段仍停留在血清，生化反应等表型水平上，从而限制其溯源及鉴定能力 。 本研究通过对采集自石家庄地区的生鲜肉(猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉)、水产品 和生肉加工车间环境取样等样品进行筛选鉴定，将之与本实验室在保定地区的金葡菌 筛选结果进行综合分析，研究金黄色葡萄球菌的来源分布，为食品安全标准的制定， 食品安全检测提供依据;在此基础上，根据四种溶血素基因(hla、hlb、hlg、hld)在 金黄色葡萄球菌分离株中的分布状况，将其分成不同的溶血素基因型，搞清我省自然 分布的金黄色葡萄球菌的溶血素基因类型。分析这些不同溶血素基因型菌株在各来源 中的分布情况，探明不同溶血素基因型的金黄色葡萄球菌与其来源之间的关 系和规律 性。为金黄色葡萄球菌病的监控、爆发流行的检测及追踪污染源提供依据。 1.2 研究现状 葡萄菌属系微球菌科，现有 19 个种，从人体上检出的有 12 个种，如金黄色葡萄 球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等。致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败 血症或脓毒败血症等。当污染食品时，可引起食物中毒。致病性葡萄球菌多为金黄色 葡萄球菌。许多学者普遍认为金黄色葡萄球菌的毒力因子与致病力和免疫原性密切相 [29,30] 关，其中溶血素和凝固酶常被作为特征性指标 。 金黄色葡萄球菌在 1884 年被正式发现，并用Staphylococcus sureus 来命名。在希 腊语中，staphyle 表示成串之葡萄，coccus 表示谷粒或浆果。1894 年，Denys 首次记 录了它引发的食物中毒事件。1930 年，研究人员指出它引发食物中毒与其肠毒素有 [31] 关 。 1.2.1 金黄色葡萄球菌生物学特征 形态与染色:典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 μm 左右，显微镜下排列 成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。 培养特性:金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好， 需氧或兼 性厌氧，最适生长温度37?C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起， 直径 1,2 mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性， [30] 可在 10%,15% NaCl 肉汤中生长 。 生化特性:金黄色葡萄球菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。 甲基红反应阳性，V-P 反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐， 液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、 红霉素等高度敏感。 1.2.2 金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都 2 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。 [32] Tsokos 等 报道有人在接受常规注射时感染了金黄色葡萄球菌，引起败血症而 致死。通过观察病人的临床症状，再结合尸体剖检和病理组织学检查，发现金黄色葡 萄球菌是由穿破皮肤的静脉导管或注射针头进入血流而引起败血症使人死亡。 [33] Cisneros 等 调查了印度尼西亚和西班牙的405 例肝移植患者，其中有 119 例患 者因肝移植时感染了金黄色葡萄球菌而发生了菌血症，调查结果发现金黄色 葡萄球菌 是由腹部和血管内置管进入血流后而引起菌血症使人致死。 兔对金黄色葡萄球菌极易感染发病。通过皮肤损伤或经毛囊、汗腺感染时，可引 起转移性脓毒血症。出生仔兔经脐带感染时，也可发生脓毒血症。经呼吸道感染时， 哺乳母兔感染可引起乳房炎，仔兔可因吸吮含有金黄可引起上呼吸道炎症。 色葡萄球 菌的乳汁而引起仔兔肠炎。 猴感染金黄色葡萄球菌可引起急性出血性肠炎，常突然发病，主要经消化道感染， 猴病发生高热，精神不振，不爱活动，目光呆滞，废食。病初排出带有粘液的粪便; 中期转为血便，并带有肠粘膜碎片;后期失禁甚至脱肛、脱水、中毒。病程,10d， 4 多数转为死亡。病理变化主要在肠道，可见肠粘膜严重充血、出血、坏死、 脱落，肠 管内有大量血便。 环境因素也是发病的一个重要环节，它直接影响金黄色葡萄球菌的增殖，也间接 [34] 影响动物体质。据李本宏 报道，阴雨多湿时节，某狗场因摄取不新鲜肉骨，小狗抵 抗力弱，受金黄色葡萄球菌感染的狗达20,以上，其中大部分死亡。 [35] 甘孟侯 对某鸡场金黄色葡萄球菌病的爆发进行了调查，结果发现与孵化车间有 3 关。经检测，孵化后 12d，孵化箱的空气中金黄色葡萄球菌的量达4800cfu/ m ，甚至 在5,未出壳的雏鸡体表，也检出了金黄色葡萄球菌，而育雏器更是金黄色葡萄球菌 增殖的场所，随雏鸡带至各饲养间，说明金黄色葡萄球菌对鸡场的污染是循序渐进增 加的。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点: ? 季节分布，多见于春夏季。 ? 中毒食品种类多，主要以各类肉及肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品，其次 为含有乳制品的冷冻食品，个别的淀粉类食品引起的中毒事件也有报道。 ?在人畜化脓性感染部位聚集，常成为污染源，有报道指出上呼吸道感染患者鼻 。 腔带菌率高达83% 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品:食品加工人员、炊 事员或销 售人员带菌，造成食品污染;食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染， 产生了肠毒素，引起食物中毒;熟食制品包装不严，运输过程受到污染;奶牛患化脓 对肉体其他部位的污染。 性乳腺炎或禽畜局部化脓时， 金黄色葡萄球菌对奶牛等哺乳动物的感染可经呼吸道、消化道、创伤、交配、昆 虫 虻、蜱、蚊、蝇类等 叮咬、挤奶工的手或挤奶机械等途径,在宿主的乳腺、鼻咽黏 膜部、皮肤、会阴部、胃肠道、生殖道等各种组织器官生长繁殖,引起最急性、急性、 3 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 [3 6 ] 慢性及亚临床等各种化脓性及创伤性感染 。 1.2.3 致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可 [24] 引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染 。 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶: (1)溶血毒素:外毒素，根据其抗原不同分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板， 破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死。 α-溶血素又称α毒素，是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一， 具有良好的抗原性，经甲醛处理可制成类毒素。金葡菌α-溶血素对多种哺乳动物红细 胞有溶血作用，其原理是溶血素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏了 细胞膜的完整性，从而造成细胞裂解。对人起作用的主要是α-溶血素，α-溶血素与牛 羊的坏疽性乳腺炎有关，还可导致白细胞等崩解，并作用于平滑肌细胞的细胞壁，引 [37] 起平滑肌收缩、麻痹，最终坏死 。 β-溶血素最早由Glenny 和Stevens[38]于 1935 年发现，该基因核苷酸序列由Projan [39] 等在 1989 年发表 ，并被命名为 hlb。金葡菌的 β-溶血素是金黄色葡萄球菌的主要 致病因子之一，具有神经磷脂酶活性，能特异性地裂解细胞膜上的鞘磷脂， 使细胞膜 [40-42] 渗漏而导致细胞溶解 。 γ-溶血素是一个双组份蛋白，Hlg1 和Hlg2 共同作用，可以破坏嗜中性白血球和 [43] 巨噬细胞。另外，它还可以破坏哺乳动物的红血球 。δ-溶血素能破坏很多哺乳类动 [44] 物的细胞膜，对许多细胞都有作用。一般认为它在细胞膜上有表面活性剂的作用 ， 通过溶解目标细胞的膜来裂解细胞。 (2)杀白细胞素:由Van de Velde 最早发现，1932 年由Panton 等将其从溶血素 中分离出。可破坏人的白细胞和巨噬细胞。杀白细胞素与γ溶血素及其他杀白细胞毒 素 如牛杀白细胞毒素 R 均属于 synergohymenotropic 毒素家族。杀白细胞素是由 luks-pv 和lukf-pv 这2 个基因编码共同转录，由前噬菌体片段携带，并整合到金黄色 葡萄球菌的染色体上。杀白细胞素以八聚体形式在宿主细胞膜上形成孔道，损伤细胞 膜，导致细胞溶解。近年来有关产杀白细胞素的金黄色葡萄球菌所致的感染死亡增多。 (3)肠毒素:金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcus enterotoxin，简称SE)主 要是由血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性的菌株产生的一类结构相似、毒力相似、抗原性 不同的胞外蛋白质。因其引起人和哺乳动物胃肠道毒性反应而得名，对热稳定， [45] 60?60min，100?30min 尚不能破坏 。研究表明，所有的肠毒素都有以下共同特性: ?具有引起急性肠胃炎的能力(催吐);?刺激非特异性T 细胞增殖的超抗原特性; ?对热和蛋白酶消化作用的抵抗能力(即肠毒素对热和水解酶的变化都有很高的耐 ;?分子内都存在二硫键。肠毒素导致葡萄球菌胃肠炎性食物中毒和刺性) 激非特异 性T 细胞增殖的超抗原特性分属毒素蛋白质的不同结构区域所控制，但他们之间存在 [31] 。 很大的相关性，多数情况下，超抗原活性的损失往往会伴随肠毒素活性的减少 4 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 肠毒素刺激肠上皮细胞，通过环磷腺苷和环磷鸟苷分泌途径，及两个独立于环式 核苷酸的途径钠、水分泌，产生腹泻。同时有研究表明，金黄色葡萄球菌对小肠粘膜 而以完整的分子经消化道吸收入血，到达中枢神经细胞无直接的破坏作用， 系统后刺 激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。 (4)血浆凝固酶:当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维 蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。致病性金黄色葡萄球菌多数 能产生血浆凝固酶，而非致病性葡球菌一般不产生此酶。因此，血浆凝固酶是鉴别金 [46] 黄色葡萄球有无致病性的重要标志之一 。 (5)脱氧核糖核酸酶:金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可 用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌。 (6)耐热核酸酶:为金黄色葡萄球菌所特有,而且在不同菌株之间具有较高的保 [47] [48-50] 守性 ，其编码基因nuc 常被用于设计PCR 检测用引物 。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。 1.2.4 鉴定和分型方法 防治金葡菌感染，必须采取有效、快速的检测手段进行病原体鉴定和分型，以寻 找感染源，切断传播途径。金黄色葡萄球菌的检测方法主要有传统的分离鉴 定法、免 疫学检测法和核酸检测法。目前，由于 PCR 技术具有特异性、敏感性、快速性等特 [51-56] 点被广泛应用于金黄色葡萄球菌的检测 。其特异的引物主要依据金黄色葡萄球菌 的特异毒性基因序列或其基因组中的特异序列而设计。而金黄色葡萄球菌的分型方法 主要有表型分型和基因分型两大类。表型分型有噬菌体分型、血清学分型、耐药谱分 型、凝固酶分型等方法。目前，除了噬菌体分型被国际葡萄球菌噬菌体分型专业委员 会确立为国际标准外，尚无其它分型方法获得标准化。噬菌体是细菌的病毒， 其感染 具有株间特异性，噬菌体分型就是利用此性质，据不同的裂解模式鉴别菌株。 用噬菌 体可将金葡萄菌分为4 群23 个型。然而，研究人员已经发现金葡菌采用此分型方法 的一些缺点，如许多金黄色葡萄球菌缺乏噬菌体接受器，无法被分型噬菌体所感染; 左右，可分辨率低，如无其他流行病学证噬菌体分型方法的分辨率仅为80% 据，噬菌 [57-59] 体分型本身不能作为判断菌株相关性的绝对鉴定指标 。基因技术的兴起为金黄色 葡萄球菌分型带来了革命，包括质粒分型、染色体DNA 脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)、 特异性DNA 片段多态性分型、核糖体分型和全细胞蛋白图谱分型等。目前分子分型 方法已被广泛应用，其中质粒分型、染色体DNA 脉冲场凝胶电泳分型和核糖分型都 是很好的选择。虽然在理论上DNA 于某些条件下是可变的，如DNA 点突变、DNA 插入或删去、质粒丢失或获得等，但实际上发生的可能性极小，在一定时间和空间内， 这些基因分型是很可靠的。脉冲电泳分型和核糖分型的分型率均为 100%，且辨别力 强，局限性在于成本高、技术复杂、需特殊设备、费时费力，不易普及。而质粒分型 简便快速、辨别力强、重复性好，适用于各级实验室。其不足在于有些菌株不含质粒。 总之，对于金葡菌相关性的判断尚无特异性分型方法作为其绝对指标，必须根据现实 5 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 情况的需要，结合其他流行病学资料，同时使用多种分型方法，增强其分型能力。 1.3 研究目的和内容 金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒和医院临床感染的重要病原菌之一。广泛 存在于自然环境中，对各种理化因素都有较高的抵抗力。近年来，世界范围内的食品 安全恶性事件屡屡发生，无论发达国家还是发展中国家，食源性疾病的发生率居高不 下。食源性疾病与食品污染构成了一个巨大并不断扩大的世界性公共卫生问题。目前， 我国对人群、家畜、食品等进行大规模的流行病学调查研究还比较少。 本研究通过对采集自石家庄地区的生鲜肉(猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉)和肉制品 等样品进行筛选鉴定，将之与本实验室在保定地区的金葡菌筛选结果进行综合分析， 研究金黄色葡萄球菌的来源分布，为食品安全标准的制定，食品安全检测提供依据; 在此基础上，利用PCR 技术检测hla、hlb、hlg、hld 四种溶血素基因在金黄色葡萄球 菌分离株中的分布状况，将其分成不同的溶血素基因型，搞清我省自然分布的金黄色 葡萄球菌的溶血素基因类型。分析这些不同溶血素基因型菌株在各来源中的分布情 葡萄球菌与其来源之间的关系和规律况，探明不同溶血素基因型的金黄色 性。一旦食 品中检测出金葡菌或发生食物中毒，根据检出菌的基因型和环境溶血素基因型分布， 为追溯感染源提供依据。 6 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 2 材料和方法 2.1 试验材料 2.1.1 菌株 实验室保存菌株 2.1.2 样品的采集 生肉加工车间棉拭子样采自石家庄某畜产品加工厂，生鲜肉、肉制品、 水产品和 速冻食品均采自石家庄超市、农贸市场和家庭厨房。 2.1.3 培养基[60] 和有关溶液的配制 ? 营养琼脂 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1000 mL 将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH7.2，加入琼脂，加热煮 沸，使琼 脂溶化。分装三角瓶，121?高压灭菌 15 min。 ? 营养肉汤 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.4 按上述成分混合，溶解后校正pH，分装三角瓶，121?高压灭菌 15 min。 ? Baird-Parker 氏培养基 胰蛋白胨 10 g 牛肉膏 5 g 酵母膏 1 g 丙酮酸钠 10 g 7 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 甘氨酸 12 g 氯化锂 5 g 琼脂 20 g 蒸馏水 950 mL pH 7.5 增菌剂的配法 30,卵黄盐水50 ml，与除菌过滤的 1,亚碲酸钾溶液 10 ml 混合，保存于冰箱内。 将各种成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25?，校正pH。 分装每 瓶95 mL，121?高压灭菌 15 min。临用时加热溶化琼脂，冷至50?，每 95 mL 加入 预热至50?的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 mL，摇匀后倾注平板。 ? 7.5,氯化钠肉汤 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 75 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.4 将上述成分加热溶解，校正pH，分装试管，121?高压灭菌 15 min。 ? 血琼脂平板 pH7.4-7.6 豆粉琼脂 100 mL 脱纤维兔血 5,10 mL 加热溶化琼脂，冷至50?，以灭菌手续加入脱纤维兔血，倾注平板。 ? 过氧化氢酶试验:GB4789.28 中3.4。 ? 糖发酵试验:GB4789.28 中3.2。 ? 硝酸盐培养基:GB4789.28 中3.17。 ?5×TAE 缓冲液 Tris 54 g 冰醋酸 5.7 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL 去离子水 定容至 1000 mL 8 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 2.1.4 主要试剂 ? 溶菌酶:购于Whatman 公司 ? 乙二胺四乙酸二钠:分析纯，天津市医药公司 ? 琼脂糖:电泳纯，上海亿通生物仪器有限责任公司分装 ? dNTPs:购于上海生工生物技术有限公司 ? Taq 酶:购于上海生工生物技术有限公司 ? 丙酮:购于北京化学试剂公司 ? DNA Marker DL2000:购于上海生工生物技术有限公司 ? 50 bp DNA Ladder Marker:购于中科瑞泰生物科技有限公司 2.1.5 主要仪器设备 ? 高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂 ? FA1004 电子天平:上海天平仪器厂 ? 电子恒温水浴锅:北京市光明医疗仪器厂 ? TGradient Thermocycler 96 型PCR 仪:德国Biometra 公司 ? DYCp-32 型电泳槽:北京市六一仪器厂 ? WD-9403C 紫外分析仪:北京市六一仪器厂 ? DYY-8B 型稳压稳流电泳仪:北京市六一仪器厂 ? BTS-20M 型凝胶成像系统:德国UVITEC 公司 ?ZSD-1270 生化培养箱:上海智城分析仪器制造有限公司 2.2 试验方法 2.2.1 样品的采集 2007 年 12 月份到2008 年4 月份共无菌采集样品 114 份，除生肉加工车间棉拭 子 石家庄某食品车间 19 份外，其余 95 份样品均采自石家庄各超市、农贸市场及家 庭厨房，包括生猪肉36 份、生牛肉 10 份、生羊肉9 份、生鸡肉8 份、肉制品8 份、 水产品 17 份及速冻食品5 份。 2.2.2 金黄色葡萄球菌的分离[60] ? 检样处理 检样25 g 固体样品;吸取25 mL 液体样品，加入225 mL 灭菌生理盐水，固体样 品研磨或均质其中制成混悬液。 9 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 ? 增菌及分离培养 吸取5 mL 上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤50 mL 培养基内，置 36?1 ?培 养24 h，转种Baird-Parker 琼脂平板， 36?1 ?培养24 h。其平板上长出的圆形、光 滑凸起、湿润、直径为2,3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一混浊带， 在外层有一透明圈的菌落为可疑菌落。 2.2.3 金黄色葡萄球菌的鉴定 ? 革兰氏染色 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列是葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄 球菌均体较小，直径为0.5,1 μm。 ? 溶血试验 将 10,的兔血琼脂平板底面，根据所挑菌株数的不同，划分为几个区，每个区 划一株菌，从Baird-Parker 琼脂平板挑取可疑菌落，划线接种于血平板，并做阳性和 36?1 ?培养24 h。于明亮处观察，阳性结果是，菌落周围有阴性对照， 较宽的溶血 带。 ? 血浆凝固酶试验 吸取 1:4 新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入培养24 h 的金黄色葡萄球 菌肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，放 36?1 ?温箱内，每半小时观察一次。观 h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝固者，被认为阳性结察6 果。同时 以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株和肉汤做对照。 ? PCR 方法验证 由于一些非金葡菌菌株可能产生大量的活性很大的蛋白酶(假凝固酶)，导致假 [61] 阳性 。所以本试验补充了利用PCR 扩增耐热核酸酶(nuc)基因的方法对所获菌株 [62] 进行验证，nuc 基因为金黄色葡萄球菌DNA 片断高度保守序 ，该基因编码 金黄色 [63] [64] 葡萄球菌耐热核酸酶 ，是金黄色葡萄球菌所特有的 。 nuc 的引物由上海生工生物技术有限公司合成 见表 1 。PCR 扩增程 序:94?预 变性4 min，再按94? 1 min?58? 0.5 min?72? 1.5 min 进行30 个 循环，最后72? 延伸3.5 min。 10 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 表 1 引物序列与目的扩增产物 大小 Table1 The primer sequence and expected size of the nuc PCR product 扩增片段 引物序列(5’?3’) PCR 产物大小 Gene designated Primer sequence 5’ ?3’) Size of amplified product +gcgattgatggtgatacggtt nuc 片段 279bp -agccaagccttgacgaactaaagc 2.2.4 金黄色葡萄球菌致病因子――溶血素基因的鉴定 (1)DNA 的制备 自斜面上挑取一环金黄色葡萄球菌培养物接种于营养肉汤中，37? (200 rpm) 培养 12 h。 取 1 mL 菌液以3000 rpm 离心 10 min，取沉淀加500 μL 丙酮后， 再次混匀，冰 浴5 min，3000 rpm 离心 10 min;取沉淀加浓度为20 g/L 溶菌酶250 μL，37?作用2 h;再加入SDS 使终浓度为10 g/L，置5 min;煮沸5 min 加入TE 150 μL、5 mol/L NaCL、 饱和酚200 μL、氯仿200 μL，充分振荡混匀(约20 s)，15 000 rpm 离心 15 min;小 心吸取上清(约350 μL)，加 1 mL 冰无水乙醇，置-20? 30 min;再次以 15000 rpm 离心 15 min，弃上清，沉淀以75,乙醇400 μL 洗涤 1 次，10 000 rpm 离心5 min; 小心吸干上清，沉淀干燥后，以40 μL 的TE 缓冲液溶解备用。 (2)引物设计 根据已公布的溶血素基因序列利用DNAMAN 和Primer 5.0 引物设计软件设计引 物序列并合成PCR 引物，引物序列见表2。 表2 溶血素基因引物序列 Table2 Primers for amplification of the genes encoding various S.aureus hemolysins 扩增片段 引物序列 5’?3’) 扩增产物长度 Gene designated Primer sequence 5’ ?3’) Size of amplified products + agt tta tag cga aga agg hla 447 bp - ttg tta ggg tca agg aag + gcc aaa gcc gaa tct aag hlb 834 bp - gcg ata tac atc cca tgg c + tggctcattcaactactc hlg 371 bp - ttctatcaacggctaaac + cagtttactaagtcaccgat hld 52 bp - tgatttcaatggcacaag 11 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 (3)PCR 反应条件 利用冷启动PCR 技术，扩增溶血素基因。 PCR 反应体系(总体积25 μL): 水 18.25 μL 10×PCR buffer 2.5 μL 2 + Mg 25 mM 1.5 μL dNTP 1.0 mM 0.5 μL 上游引物(20 μM) 0.5 μL 下游引物(20 μM) 0.5 μL Taq 酶 5 U/μL 0.25 μL DNA 1 μL 总体积 25 μL PCR 反应程序: hla 基因:预变性 94? 5 min;94? 40 s，49? 40 s，72? 1 min 30 个循环 ;72? 10 min。 hlb 基因:预变性 94? 5 min;94? 40 s，54? 40 s，72? 1 min 30 个循环 ;72? 10 min。 hlg 基因:预变性 94? 5 min;94? 40 s，53? 40 s，72? 40 s 30 72? 个循环 ; 10 min。 hld 基因:预变性 94? 5 min;94? 40 s，50? 40 s，72? 30 s 30 个循环 ;72? 10 min。 (4)凝胶成像 将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。hla、hlb 和hlg 片段所用凝胶浓度为 1%，hld 片段凝胶浓度为2%，110V 电压下 1 小时。电泳完成后在凝胶成像系统中 成像，观察 PCR 扩增的结果。 (5)PCR 产物测序 为了进一步验证PCR 结果的准确性，对hla、hlb、hlg、hld 的PCR 产物进行回 收，与 PMD-18T 载体连接后转化并筛选阳性转化子，送往上海生工生物科技有限公 司进行测序，将测序结果在NCBI 上进行比对，将比对结果最终证实为目的基因的菌 株在后期基因分布状况的研究中作为阳性对照菌株。 (6)金黄色葡萄球菌溶血素基因的分布 根据引物对的产物片段长度，鉴定分离菌株，研究四种溶血素基因在野生型金黄 并探明四种不同溶血素基因与菌株来源之间的关系及色葡萄球菌中的分布， 其规律 性。 12 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 3 结果与分析 3.1 金黄色葡萄球菌自然分布的研究 114 份样品经过增菌、分离培养、革兰氏染色镜检后得到可疑金黄色葡萄球菌的 菌株，经血浆凝固酶试验和PCR 扩增耐热核酸酶鉴定后，有23 份样品检出了金黄色 葡萄球菌，共分离出金黄色葡萄球菌46 株。其中生肉加工车间4 株、生猪肉 16 株、 生牛肉4 株、生羊肉6 株、生鸡肉4 株、肉制品2 株、水产品6 株、速冻食品4 株。 所有菌株的凝固酶试验均是阳性，并且 PCR 验证结果也均为阳性。因此，所分离出 的菌株全部为金黄色葡萄球菌，其鉴定结果见表3，八类样品金葡菌检出率 见表4。 表3 八类样品中金黄色葡萄球菌的分离鉴 定结果 Table3 The identifying results of staphylococcus aureus in 8 samples 检出金葡菌菌株 溶血试验 卵黄反 应阳性菌 血浆凝固酶 nuc 基因PCR 扩 样品 数 阳性菌株数 株数 阳性菌株数 增阳性菌株数 生肉加工车间 4 4 4 4 4 生猪肉 16 16 16 16 16 生牛肉 4 4 4 4 4 生羊肉 6 6 6 6 6 生鸡肉 4 4 4 4 4 肉制品 2 2 2 2 2 水产品 6 6 6 6 6 速冻食品 4 4 4 4 4 表4 八类样品中金黄色葡萄球菌的分 布 Table4 The distribution of staphylococcus aureus in 8 samples 采样份数 阳性检样 数 检出率 样品 (份) (份) (%) 生肉加工车间 19 2 10.5 生猪肉 36 8 22.2 生牛肉 10 2 20.0 生羊肉 9 3 33.3 生鸡肉 8 2 25.0 肉制品 8 1 12.5 水产品 17 3 17.6 速冻食品 7 2 28.6 总计 114 23 20.2 13 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 从表4分析认为，金黄色葡萄球菌对八类样品均有污染，但是其污染程度存在着 明显的差异。114份样品中金葡菌平均检出率为20.2%，其中以生羊肉为最高(33.3%)， 其次为速冻食品(28.6%)和生鸡肉(25%)，生肉加工车间和肉制品的检出率较低， 分别为10.5%和12.5%。综合本实验室保定地区部分数据分析如下: (1)本研究采集生肉样品数量较多，是因为据全国食源性疾病监测网显示，我 [1] 国食物中主要致病菌的检出率以畜禽肉类最高，达20%以上 ，同时来自河北省疾控 中心2005,2007 连续三年的监测数据也指出，在河北省各类食品中金葡菌和沙门菌 [65] 等5 种致病菌的污染以水产品的阳性率最高，其次是生肉 。 本研究中生鲜肉金葡菌平均检出率为23.8%，不同种类的生肉其检出率存在差异， 以羊肉检出率最高(33.3%)，其次为鸡肉(25%)、猪肉(22.2%)、牛肉(20%)。而 本实验室在保定地区检测结果显示，生肉中以鸡肉检出率最高，为48%，而羊肉的检 ，猪肉和牛肉的检出率与石家庄地区相差不大。分析认为，本出率仅为16% 试验中某 一批次的涮羊肉中金葡菌的检出导致羊肉总体检出率偏高，这可能是后续加工污染所 致，要求食品加工、销售人员加强卫生意识。鸡肉中金葡菌的检出率低于保定地区， 两个城市间金葡菌污染情况存在差异。 另外，周丽萍等对484份生肉样品进行检测，金葡菌检出率为19.01%[66] ;许晓玲 等对北京东城区160份食品样品进行金葡菌的检测，其生肉中污染率为27.5%[67];刘 国蓉等对北京昌平区472份食品样品进行检测，猪肉金葡菌污染率为20.2%，鸡肉金葡 菌检出率达26.4%[68];但同时期郑德生等对北京市密云县的220份食品样品进行检测， [69] 其生猪肉中金葡菌的检出率仅为8%，生牛肉和生羊肉中均未检出 。这表明金葡菌 对食品的污染情况地区间存在差异，也说明通过严格的卫生管理，金葡菌的污染是可 以人为控制的。而本研究中生鲜肉金黄色葡萄球菌在石家庄和保定地区金葡菌的检出 率分别达到了23.8%和25%，说明这两个地区生肉中存在着一定程度的金黄色葡萄球 菌污染，并有导致食物中毒和金黄色葡萄球菌病发生的潜在危险。 (2)本研究中石家庄地区速冻食品金葡菌的检出率为28.6%，保定地区为36%， 两个地区的速冻食品中检出率都很高，说明虽然速冻食品的加工贮藏温度较低，但受 金葡菌污染仍然很严重，对此类食品进行金黄色葡萄球菌的监控非常必要。分析认为， 速冻食品受金葡菌污染的重要来源是加工所用馅料，其原因可能是馅料加工过程中诸 [70] 多环节影响造成的，加上馅料不加热处理等因素而导致污染 。在“绍兴市售速冻食 品中金黄色葡萄球菌污染状况调查”一文中，陈嫣对43 份速冻食品样品进行金葡菌检 测，其检出率达到 32.56%，其中含肉馅样品检出率 44.83%，不含肉馅样品检出率 [71] 7.14%，其研究结果也得出了检出率含肉馅产品多于不含肉馅产品的结论 。 (3)河北省食源性致病菌监测网三年连续主动监测结果显示水产品污染最为严 [65]，应引起高度重视。本研究水产品中金葡菌在石家庄地区污染率为17.6%，保定 重 [67] [68] 地区为10%。虽然与许晓玲 16%的研究结果相比在正常范围内，但相比刘国蓉 [69] [72] (未检出)、郑德生 (未检出)、刘秀峰 (未检出)等的研究结果，这两个地区 水产品受金葡菌污染严重。因此为了提高水产品的卫生质量，在养殖过程中注意水体 质量，加强卫生管理科学饲养，在流通和消费环节等防止金葡菌的污染都非常重要。 14 金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究 (4)本研究对某生肉加工车间的19份棉拭子进行检测，10.5%的样品检出金黄色 葡萄球菌，虽然低于本研究的平均检出率，也远低于自然环境的带菌率，但 是由于棉 拭子来自食品生产加工环境，所以对其严格的卫生控制，防止对食品造成二次污染非 常重要。 3.2 溶血素基因的鉴定及其分布研究 对324 株金黄色葡萄球菌(石家庄地区46 株、保定地区278 株)的四种溶血素 基因进行检测。为进一步验证PCR 结果的准确性，挑取典型菌株对其hla、hlb、hlg、 hld 的PCR 产物进行了回收，与 PMD-18T 载体连接后转化并筛选阳性转化子，送往 上海生工生物科技有限公司进行测序，并在NCBI 上与相应的菌株进行比对，测序结 果见附件 1,4，同源性比较如下: ?hla 测序结果与在GeneBank 中注册号为X01645 的Staphylococcus aureus Wood 46 gene for alpha-toxin 的同源性为 99%，可作为阳性对照菌株。 ?hlb 测序结果与在GeneBank 中注册号为X13404 的Staphylococcus aureus hlb gene for beta-hemolysin 的同源性达99%，可作为阳性对照菌株。 ?hlg 测序结果与在 GeneBank 中注册号为 L01055.1 的 Staphylococcus aureus gamma-hemolysin components A, B and C hlgA, hlgB, hglC genes, complete cds 的同源 性达99%，可作为阳性对照菌株。 ?hld 测序结果与在GeneBank 中注册号为AF230358.1 的 Staphylococcus aureus delta-haemolysin precurser hld , accessory gene regulator protein B agrB , and accessory gene regulator protein D agrD genes, complete cds 的同源性达 100%，可作为阳性对照 菌株。 3.2.1 hla 的PCR 鉴定 α-溶血素是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的抗 [73] 原性，，经甲醛处理可制成类毒素。编码该蛋白的基因位于染色体上，单拷贝 5’ 端有前导序列，成熟多肽由293 个氨基酸组成，该蛋白分子量为33kD，pI 为8.5，在 [74] 水中溶解度高，在pH5,9 范围内稳定 。一般认为α-溶血素破坏膜的机制是结合到 靶细胞膜上，在细胞膜上形成稳定的穿膜的小孔，使膜的渗透性增强，离子和小分子 可以自由穿过脂质双分子层而使细胞裂解。α-溶血素基因的特异片段经 PCR 扩增后， 电泳检测阳性结果条带位置