低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜腺苷A2b受体表达影响研究（可编辑）

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜腺苷A2b受体达影响研究（可编辑） 学 号:低氧对大鼠肺动脉平滑肌细 胞膜腺苷受体表达影响 的研究 学科门类 医学 学科、专业 儿科学 研究方向 心血管与危重症 级 年 二八级 研究生姓名 王方方 导师姓名 谭建新教授肖红教授 起止日期 .~ . 广东医学院附属医院儿科学研究室 二。一一年六月学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果,也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或 证书所使用过的材料。 作者签名: 至壹查 日期:至业兰型 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果,知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师,离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时,署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文,可以公布包括刊登论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注:保密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签名: 堑查 日期:删 如\,,? 导师签名: 斗嗍目 录 中文摘要?. 英文摘要。 前言 .研究背景?. .研究目的? .研究内容?. .研究的技术路线? 的原代培养和鉴定??. .材料与. .结果. .讨论. 低氧对膜上 表达的影响 .材料与方法 .结果. .讨论. 小结??。 参考文献. 文献综述 综述参考文献 ?..?........ 致谢??. 附录一缩写词中英文对照 附录二在读硕士期间的科研论文情况 ..?.?’’? . 莎? . .? .一..?? . .? .?””?“ ?..?..??.??.?...?.??...?’?‘?’???????川??? 低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜腺苷受体 表达影响的研究 中文摘要 【目的】 本研究拟通过体外培养肺动脉平滑肌细胞、设计并建立低氧培 ‘ 养细胞模型和不同低氧时间不同药物处理,研究低氧对增殖、 腺苷受体表达变化及其激动剂对细胞增殖的影响,从而为腺苷类 药物治疗提供理论依据和指导。 【方法】 .采用组织块贴壁法原代培养,免疫组化法鉴定细胞。 .用真空压缩袋制作低氧培养细胞的模拟模型装置,测定细胞增殖来验证该 设计的可行性。 .实验分组:首先设空白组、实验组和对照组,然后随机分为低氧组, 组和常氧组,组,将组和组分别进行非特异性激动剂 矛特异性拮抗剂处理后在不同环境培养,时间点设 为、、、、。 , .采用免疫荧光的方法,在激光共聚焦显微镜下观察低氧不同时间下 在上的分布情况和表达量的变化,及的形态变化。 .用 试剂盒.法检测低氧不同时间经不同药物处理 的的增殖变化情况。 【结果】 .原代培养的传代后稳定性好,纯度高可达%以上,免疫组化鉴 定仅一呈强阳性表达。 .激光共聚焦显微镜下观察到,低氧下有从长梭过度到短梭形的趋 势,未出现典型生长方式,不出现或迟于常氧培养细胞出现凋亡。 .免疫荧光法检贝至在胞膜、胞浆均有表达,胞膜表达稍多。 低氧下表达增加,具有时间依赖性,但是持续时间较短。.法结果 显示,低氧下细胞增殖明显高于常氧尸.,低氧下 处理组可显著抑制细胞增殖畎.。 【结论】 .低氧下形态和生长方式改变,提示是血管收缩和血管重构 的重要基础。 .低氧诱导增殖,呈时间依赖性。 .低氧致膜上表达增加,低氧下激动剂显著抑制 增殖,提示的表达变化在低氧致增殖中起重要作用。 【关键词】 肺动脉平滑肌细胞;低氧;细胞增殖;: , . . . 【】, ? . . , . . : , ., , ,、、、、. , ..,. . 【. , % ?.. , ’ .... . , . . . 胙. . 【】 . . . . . . . . . 【;; ;; 前言 .研究背景 ..低氧性肺动脉高压 ,是高 低氧性肺动脉高压 原适应生理的重要环节,与低氧性肺血管收缩和结构重建密切相关【。临床上, 可见于多种慢性心肺疾病,以及儿科的多种疾病如哮喘、儿童的先天 性心脏病、新生儿窒息、持续胎儿循环等。的病理生理特征是由低氧引 起血管内皮细胞损伤、血管内皮合成和分泌的各种血管舒缩因子失衡,启动肺 ,的始动环节,并逐渐 血管收缩 出现肺血管平滑肌细胞肥大、增殖、非肌性动脉肌化及新生肺动脉形成,即血管 重塑 ,,其中也有血管细胞的胞 外基质增多,最后导致肺动脉管壁增厚、管腔狭小、血管顺应性增加、血管痉挛、 结构重塑,可造成心肺功能的严重障碍,是一种发病机制复杂、预后较差的疾 病。大多数人认为,早期反应是低氧引起的肺毛细血管强烈收缩,后期 则是肺小动脉管壁增厚引起的肺血管重构,但是也有研究显示早期即有 肺高压和肺血管重构的现象【。研究证实,心血管结构重构过程 涉及多种因素 和作用因子【,一旦确诊,临床上仅有少量方法进行控制和缓解,缺乏具 有显著作用的治疗措施,仍需继续寻找可以用于临床的特异性药物和措施。近些年研究发现,肺动脉平滑肌细胞.上存在一些非特异性通道结构【】,有可能成为机制研究的 新领域。低氧诱导肺动脉结构改变主要包括肌型小动脉中膜增生肥厚,无肌型细 动脉肌化等【,其中,增殖肥大及细胞外基质沉积是血管收缩和血管 重塑的基础,低氧情况下的增殖性改变和细胞凋亡水平的下降与 有直接联系【】。年,等【提出腺苷是具备选择性扩张肺血管特性 的药物,与肺动脉高压有一定的联系,而且也能够在一定程度上避免多种药物 治疗肺动脉高压所面临的体、肺循环失衡问题。本课题也在前期研究通过动物 模型证明外源性腺苷可以有效降低压力,并且发现低氧不同时间后肺动 脉的血管壁上腺苷受体的表达明显增多。由于肺动脉平滑肌细胞 既是肺血管收缩的效应细胞也是引起血管重建的基础,所以很可能的腺苷受体表达与的发生发展有着一定的联系。 ..腺苷和腺苷受体 腺苷是一种嘌呤核苷,由糖苷键连接腺嘌呤和核糖组成,是体内重要的生 物活性物质。腺苷主要通过其受体发挥作用,包括腺苷受体、 腺苷受体、腺苷受体、腺苷受体,其中 和是根据亲和力的不同被分为高亲和力的和低亲和力的 ,肺血管上的分布最多。目前,肺血管的研究报道较少。 年和.首次提出腺苷和腺苷酸对平滑肌的舒张作用【】,腺 苷在机体发挥的重要作用受到重视。大量实验证实心血管系统的组织细胞将被 损伤时,腺苷可以逐渐产生并释放嘌呤核苷腺苷,新增加的腺苷可以影响刺激 物、血管、成纤维细胞及炎症细胞表面的受体,调整细胞的功能和表达,还可 以快速并入’.来补充腺苷酸库,通过这些受体的依赖和非依赖途径,腺 苷可以很大程度的改变急性缺血损伤效应,并同时产生强大持久的缺血耐受效 应,从而影响机体的病理生理过程【‘‘?。等【以及我们前期的动物 实验【】均表明慢性低氧致大鼠右心室心肌内源性腺苷含量增加,这提示内源 性腺苷在低氧所致肺动脉高压和右心室肥厚的发生发展中有重 要作用。近年 来,越来越多人认为内源性核苷腺苷是一种有活性的生物外源性信号分子。 近年来,随着分子生物学方法的敏感性提高,在机体的多种细胞 上被辨认出来,尤其是发现了脉管系统的分布让人们对的功能有了最 初的认识。以低亲和力受体被发现的早期一直未受到重视,主要因为 与高亲和力的很相似,且缺乏明确的药理学靶向,被认为与生 理学功能无实质关联。后来,研究发现在炎症性缺氧的病理过程可以 被相关因素高度调节并转录表达,显著减轻组织缺氧时的炎症情况,从此, 在不同细胞和组织发挥的特异性作用才开始出现新的研究进展,像心 等【】 肌缺血、急性肺损伤等许多急性病理过程的组织保护作用‘。 等在研究中发现低氧下培养的血管内皮细胞和支气管平滑肌细胞表达 下降,而表达则增高,这提示在低氧诱导的血管重构中可能 发挥重要的作用。因此,腺苷受体的数目、分布及受体对激动剂的敏感程度决 定着它们的作用效果如何,但目前的相关研究尚不能阐述其具体过程和机理。 最新研究发现低氧诱导因子在低氧性疾病中发挥重要作用,可参 与在低氧条件下的转录调控,通过构建人基因启动子,证明将 氧反应元件嵌合至的启动子上,能够增的和蛋白 表达。随着的生物学作用的不断认识和研究的深入,它在治疗学上 的潜力是非常值得期待的。 综上所述,目的机制研究较为广泛,但是尚未见到统一而完整的阐述, 实验室研究转化到临床仍有较远距离,结合前期体内实验和本次体外实验的研究 进一步探讨在发生发展过程的作用,为的临床治疗提供新的治疗 靶点。 .研究目的 通过原代培养、自制培养细胞的低氧模拟模型,检测低氧下 的增殖、的表达分布和的形态变化,研究低氧下增殖 与表达的关系及激动剂对细胞增殖的影响,从而探讨在 发生发展过程的可能机制及为腺苷类药物治疗的提供理论依据。 .研究内容 原代培养,鉴定成功。 激光共聚焦显微镜下观察的表达分布和的形态变化。 采用.法在酶标仪上检测的增殖情况。 .研究的技术路线 原代培养 设计模拟低氧模型装置 对照组 拮抗剂 激动剂和拮抗 激动 竟 常氧培养 低氧培养术为% ,, ,,, ,, ,,, 激光共聚焦显微镜 试剂盒 增殖 表达形态 ,低氧组:%%%的混合气体。 的原代培养和鉴定 .材料和方法 ..实验动物 清洁级健康雄性大鼠,周龄,由广 东医学院实验动物中心提供。 ..实验仪器 .倒置荧光显微镜系统 同本公司 倒置相差显微镜 日本公司 微量加样器 德国公司 二氧化碳孵箱 德国电子天平 梅特勒.托利公司 .医用超净工作台 苏州净化设备公司 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 高压锅 中国广州 数码照相机 日本公司 电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂 微波炉 广东格兰仕企业集团公司 冰箱 中国苏州超低温冰箱 手术器械 附院供应室提供 四川蜀玻集团有限责任公司 玻璃烧杯、培养皿 去离子水系统 美国公司 细胞培养瓶 美国公司 环球胶袋封口机 广州市环球包装机械厂 公司 恒温温箱 德国 激光共聚焦显微镜 ..主要试剂 美国公司,进口分装 .%胰蛋白酶 高糖培养基 美国公司 胎牛血清特级 美国公司 .缓冲液 美国公司,进口分装 北京博奥森生物技术公司 山羊抗兔 兔抗鼠仅.多克隆抗体 北京博奥森生物技术公司 标记山羊抗兔北京博奥森生物技术公司 青霉素.链霉素溶液× 碧云天生物技术研究所产品 显色试剂盒 碧云天生物技术研究所产品 %过氧化氢溶液 广东南国药业公司 美国公司 多聚甲醛 国药集团化学试剂公司 . 美国公司,进口分装美国公司 粉 武汉博士德生物工程有限公司 二甲基亚砜 广州威佳生物公司 医用生理盐水 浙江济民制药有限公司 青霉素钠 山东鲁抗医药股份有限公司 硫酸链霉素 大连美罗大药厂 碧云天生物技术研究所产品 .试剂盒 ..试剂的配制 解剖大鼠的溶液配制 ?青.链霉素溶液:取生理盐水 瓶,青霉素万支,链霉素 万支,青霉素每支加入 生理盐水,链霉素加入 生理盐水,分别 室温溶解,从新的一瓶生理盐水抽出 弃去,分别抽取 青霉素溶 液和 链霉素溶液加入新的一瓶生理盐水中并摇匀,即为万/青霉素和 /链霉素的双抗溶液,用直径.岬滤膜过滤后分装,.?保存,备用。 ?含青.链霉素溶液的生理盐水:取. 青链霉素溶液,加入生理盐 水定容 至 ,即为含有 /青霉素和./链霉素的生理盐水以下称: 含双抗的生理盐水,?保存,备用。 , ?溶液:粉一包,加入三蒸水完全溶解后,用三蒸水定容至 高压锅消毒,冷却后?保存,备用。 培养细胞的溶液配制 ?%的细胞培养液配制:取胎牛血清 ,青链霉素 ,加高糖 培养基至 ,摇匀,即为含 /青霉素和 /链霉素的血清细胞 培养液以下称:细胞培养液,?保存,备用。 ?%的细胞培养液配制:取胎牛血清 ,青链霉素 ,加高糖 培养基至 ,摇匀,即为含 /青霉素和 /链霉素的血清细胞 培养液以下称:细胞培养液,?保存,备用。 鉴定细胞的试剂配 .%.溶液:取. .加入到溶液,完全溶解后, 定容至 ,?保存,备用。 ?含.%.的溶液:取.%.溶液 ,加入 溶液,定容至,?保存,备用。 ?%脱脂奶粉溶液:称取. 脱脂奶粉,加入.%.的溶液 ,搅拌溶解,现配现用。 ?%多聚甲醛溶液:称取多聚甲醛 液中,放入?水 ,加到 浴箱中,过夜,冷却后?保存,备用。.溶液:取. .,加入溶液定容 至 , ?.% ?加热 ,冷却后?保存,备用。 ..实验方法 原代培养参考司徒镇强版《细胞培养》【刀 大鼠,断颈处死,完全浸入%酒精 ,超净台内 选取 打开胸腹腔,暴露心肺组织,更换消毒器械,将心肺组织取出,于个。预冷 后含双抗的生理盐水烧杯中,分别漂洗~次,放入?预冷的含双抗的生理 盐水培养皿中,寻找到肺内动脉位置及走向。先仔细分离出肺内动脉血管段,放 于预冷的缓冲液中,依次再逐步分离血管中膜,同时轻刮内膜面~次,用预冷的’一缓冲液漂洗一次,置于另一培养皿并滴加两滴%的细 , 胞培养液。然后将所有分离的血管中膜集中一起,用眼科剪快速剪碎 最后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶的瓶底并以适当距离均匀排布,直立细胞培 养瓶并加入 细胞培养液,倒置放入培养箱内, 后从一侧轻轻翻转瓶 底让培养液没过组织块,然后不始在二氧化碳孵箱静止培养直到原代细胞长出。 长出细胞后,开始间隔 更换培养液一次,待瓶底细胞覆盖达%左右, 可用.%胰蛋白酶消化传代一次,尽量保持原瓶组织块不脱落。传 代后的细胞 第二次换液更换为%的培养液,以后传代需细胞长满瓶底的%以上,分为 瓶一瓶,用%的培养液继续培养。实验选用代细胞。 鉴定及纯度 ?采用法免疫组化技术,用.%胰蛋白酶消化后,以//密 度的细胞悬液接种到盖玻片,待细胞铺满盖玻片的%左右,取出盖玻片进行免 疫组化。依次进行漂洗溶液, 次、固定%多聚甲醛溶液,室 温 ,或?过夜、漂洗溶液, 次、透化.% . 溶液,室温 、漂洗溶液, 次、内源性酶活性封闭%过 氧化氢溶液,室温 、漂洗溶液, 次、外源性封闭%脱 脂奶粉溶液,室温 ,或?过夜、一抗反应兔抗伐.多克隆抗体:, 室温 ,或?过夜、漂洗溶液, 次、二抗反应山羊抗兔 、 、漂洗溶液, 次、显色室温 :,室温 漂洗溶液, 次,镜下观察。 ?免疫荧光鉴定,一抗反应之前操作同法免疫组化的操作方法,二抗反应 为 ,避光,漂洗溶 标记山羊抗兔:,室温 液, 次后于暗室荧光显微镜下观察。在同一视野下分别计数普通显微 镜和荧光显微镜下细胞数目。 ?纯度%荧光显微镜下细胞数目/普通显微镜下细胞数目 %。 .结果 ..原代培养 本实验选择周龄体重 /只~ /只的大鼠为实验对象,组 织块贴壁后在二氧化碳孵箱孵育, 以后组织块周边逐渐长出“纤维细 胞”样的长梭形细胞图.,细胞长满后可在倒置相差显微镜下看到 折光性强,聚集叠加生长,呈典型的“峰一谷样生长状态图.。原代培养 的传代培养后生长稳定、状态良好,高倍镜下见梭形细胞中间段凸出, 细胞核为较小,呈圆形或椭圆形。图.原代培养..: : :“ ’..鉴定结果和纯度 经免疫组化和免疫荧光实验鉴定.均为强阳性表达,免疫组化显色后 可见细胞被染为棕黄色,免疫荧光在 波长激光下可看到明亮的 绿色荧光 图.。结果显示,传至代以后的纯度可达%以上。本实验选 用第代为实验对象,组织块贴壁法的原代培养是能够准确获得 的实验方法之一。 图.免疫组化和免疫荧光鉴定上伍.强阳性表达 .. 仃:: ::: :?????? .讨论 的原代培养始于世纪九十年代后期,原代培养细胞的基本实验 方法主要是组织块壁法和酶消化法。目前已大血管平滑肌细胞的培养已基本成 熟,但是肺内动脉的原代培养仍存在一定的技术难度,尤其是组织块 贴壁法的取材,且操作步骤较复杂,组织块的取材需要细致耐心的分离和精细的 操作,才能成功培养出生长稳定、纯度高的。然而酶消化法费用高、消 化时间难控制、酶对细胞有一定的毒性,故认为组织块贴壁法获取原代细胞的培 养方法更适于普通实验室的应用。肺内动脉的的体外培养是许多肺血 管疾病研究的关键技术。 本实验选用组织块贴壁法,能够在短时间掌握培养方法,而且细胞培养和纯 化可以同时进行【】。由于原代培养要求组织来源活力强和保持新鲜性,且本实验 以获取肺动脉~级分支血管为佳,标本的取材难度较大,所以在培养过程中发 现选用 的大鼠为实验对象获取的生长状态、形态特征 良好,能够为后续实验提供稳定、可靠的体外实验对象。 培养过程还发现,组织块静置贴壁至少 后才可以取出观察,而且对培养 瓶的取放一定注意动作要轻和慢,保证组织块贴壁时间长,长出细胞的机会大, 如果组织块不脱落,甚至一月后仍可长出原代细胞。原代培养时血清 要求较高,目前市场上少见原代培养的专用血清和培养基,实验发现 使用和国产四季青血清%的浓度培养原代的,细胞不能长出 或长出时间较久且极少,传代细胞的培养生长也较慢,仅发现进口的胎 牛血清特级才能满足生长条件,使原代细胞培养周期明显缩短,且传代细胞 培养分裂增殖速度较快,所以培养过程采用原代至第代细胞给予%的血清培 养液,以后传代细胞均给予%的血清培养液,细胞形态和生长状态保持稳定。 对血清的要求很可能是进口胎牛血清含有刺激生长的 因子及更适合原代细胞的培养基配制成分。 原代培养的形态与纤维细胞非常相似,原代培养过程也有个别组 织块在长出的同时表面覆以一层内皮细胞,但长出范围扩大 和增多后内皮细胞很快死亡消失,这可能与体外培养细胞的接触抑制、密度依赖 及生物生存的优势劣汰特点有关系【。根据不同细胞对胰酶的敏感性差异, 对胰蛋白酶的敏感性相对较弱,用消化传代的方法很容易将纤维细胞和 少量内皮细胞随胰蛋白酶被倒掉,从而做到细胞筛选。由大量肌动蛋白 组成,生长过程很容易出现聚集重叠即“峰一谷”样生长状态的原因,实验过 程中需要考虑细胞体较大和聚集生长的特点,合理接种细胞数目。 总之,本实验通过原代培养,建立了肺内动脉原代的培养 方法,为研究增殖及在发生机制的探讨奠定了基础。 低氧对膜上表达的影响 .材料和方法 ..材料 家庭用真空压缩袋带封口划片 广东中山太力家庭制品制造公司 抽气泵 广东中山太力家庭制品制造公司 北京伏尔特技术有限公司 精密过滤输液器 输氧管 南通三利医疗器械有限公司 塑料胶水 超市购买 塑料板 超市购买 混合气体 广东佛山科的气体有限公司 ..实验仪器 同第二部分.. ..实验试剂激动剂 英国 抑制剂 英国 美国公司,进口分装 .%胰蛋白酶 高糖培养基 美国公司 胎牛血清特级 美国公司 北京博奥森生物技术公司 兔抗鼠.多克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 山羊抗兔 青霉素.链霉素溶液 碧云天生物技术研究所产品 广东南国药业公司 %过氧化氢溶液 美国公司 国药集团化学试剂公司 多聚甲醛美国公司,进口分装美国公司 武汉博士德生物工程有限公司 粉 二甲基亚砜 广州威佳生物公司 医用生理盐水 浙江济民制药有限公司 青霉素钠 山东鲁抗医药股份有限公司 硫酸链霉素 大连美罗大药厂 碧云天生物技术研究所产品 一试剂盒 ?美国公司北京博奥森生物技术有限公司染色液细胞核染色液 北京博奥森生物技术有限公司 ..溶液配制 含的细胞培养液液: 按照试剂说明书,用以 的浓度溶解为. ,室温过夜, 加入%培养液定容 滤膜过滤,取含的溶液. 至 ,即为含的细胞培养液终浓度为.%的,? 保存,备用。 含的细胞培养液液: 按照试剂说明书,用以 的浓度溶解为. ,室温过 加入%培养液 夜,?滤膜过滤,取含的溶液. 定容至 的, ,即为含的细胞培养液终浓度为 ?保存,备用。 含和混合的细胞培养液液: 将已配制好的液和液分别取 ,同比例混合后,?保存,备用。 含.%的培养液液: 取溶液. 加入%培养液培养液定容至 ,即为含的细 胞培养液,?保存,备用。 青.链霉素溶液: 取生理盐水瓶,青霉素钠万支,硫酸链霉素万支, 青霉素钠每支加入 生理盐水,硫酸链霉素加入 生理盐水,分别 室温 溶解,从新的一瓶生理盐水抽出 弃去,分别抽取硼青霉素钠溶液 和 硫酸链霉素溶液加入新的一瓶生理盐水中并摇匀,即为万/青霉 素 钠和 /硫酸链霉素的青链霉素溶液,用直径. 滤膜过滤后分装,.?保存,备用。 %的细胞培养液配 取胎牛血清 ,青链霉素溶液 ,加高糖培养基至 ,摇匀, 即为含 /青霉素和 /链霉素的血清细胞培养液以下称:细胞 培养液,?保存,备用。 .%的细胞培养液配. 取胎牛血清. ,加高糖培养基至 ,青链霉素溶液 ,摇匀, 即为含 /青霉素和 /链霉素的.%的细胞培养液,?保存, 备用。 溶液: 粉一包,加入三蒸水完全溶解后,用三蒸水定容至 ,高压锅灭菌 消 毒,冷却后?保存,备用。 ..实验方法 技术路线 代 专用培养皿每组个培养皿? 孔板每组块孔板? 分别常氧/低氧培养,,,,, 匡围堕叵垂玉回叵亘巫圃 木实验组:分别溶有和的培养液; 空白对照组:溶有的培养液; 对照组: 同比例混合含和混合的培养液 低氧模拟模型的制作 根据相关文献【,自制培养细胞的低氧模拟模型装置图.。图. 低 氧模拟模型装置孔板 .. ? :的培养、传代及接种 的培养、传代方法见第二部分..。 细胞接种的密度分别为:专用培养皿为/,孔板为/,接 种后贴壁生长 ,再以含.%血清的培养液同步化培养“。 激光共聚焦显微镜检测的表达情况 实验前各专用培养皿均换更换培养液,分别加入含、、 、和混合的细胞培养液,同时设一对阴性对照组时 间点为 。随机分为常氧组,组和低氧组,组, 、 、 、 、 。 分别培养 、 以内时间点不换培养液和气 体, 以后的细胞每 换培养液和换气一次,打开或者换气换液用时约 一次后延长 培养时间,依次类推。到达设定时间后取出,按照免 疫组化试剂盒说明书,以 为一抗:,山羊抗兔为二抗:,具体方法见.., 最后加入染色液室温, ,避光,漂洗溶液, 次。 打开 激光共聚焦系统和激光共聚焦显微镜,分别选定分别选定 激发波长 和染色液激发光波长 ,观察上 的表达分布。 激光共聚焦显微镜观察形态变化 实验前各专用培养皿均换更换培养液,分别加入含、、 、和混合的细胞培养液,同时设一对阴性对照组时 间点为 。随机分为常氧组,组和低氧组,组, 、 。 分别培养 、 、 以内时间点不换培养液和气体, 以 一 后的细胞每 换培养液和换气一次,打开或者换气换液用时约 次后延长 培养时间,依次类推。到达设定时间后取出,按照免疫 组化试剂盒 说明书,以兔抗鼠.多克隆抗体为一抗:,山羊抗兔为二 ,避光,漂沈 抗:,方法同..,最后加入染色液室温, 溶液, 次。打开 激光共聚焦系统和激光共聚焦显微 , 镜开关,分别选定激发波长 和染色液激发光波长 观察的形态变化。 法检测细胞增殖情况 实验前将各培养板更换培养液,孔板中每孔分别加入 含、 、、和混合的细胞培养液,设无细胞但加 入含培养液的孔为空白对照,每组个复孔。随机分为组和组,分 、 、 、 、 别培养 。为保持细胞生长的营养、气袋内气体的比例 和酸碱度,细胞培养每过 更换一次培养液和气袋内气体,打开或 者换气换 液用时约一次后延长 培养时间,依次类推,内的不予处理。 到达设定时间后取出,每孔加入 溶液,继续置于原来的环境继 续培 养 ,然后在酶标仪上测定各组细胞的光密度值,波长姗。 细胞增殖率%组平均值一组平均值/组平均值% 统计分析 实验数据均用均数标准差?表示,药物处理组组内用检验, 组间用重复测量方差分析。采用 .分析软件进行统计描述,以. 表 示差异具有统计学意义。 .结果 ..低氧对膜上表达的影响 由图.可知,胞膜、胞浆均有表达,胞膜表达较多。常 氧下有稳定而少量的表达,低氧下表达明显高于常氧, 内表达增多具有时间依赖性。但是,低氧 后在细胞上的表达开 始减弱,至 大部分细胞恢复至常氧表达,提示低氧下膜上 的表达并不是持续增加,一定时间后开始减弱,可能会逐渐恢复至常氧水平。为 看清表达情况,尽量选择单个分布的细胞,但培养至 细胞基本全部 融合,较强荧光的表达在低倍镜下仅看到个/视野。 常氧培养 低氧培养 常氧培养 低氧培养 图.间接免疫荧光染色检测不同环境不同时间在的表达 .. ..低氧对形态的影响 激光共聚焦显微镜下观察发现,常氧培养的长梭形细胞,逐渐融合出现典型 “峰.谷”样生长方式, 随后细胞凋亡,细胞数目减少;而低氧下有 从长梭过度到短梭形的趋势,未出现典型生长方式,也未出现或 迟于常氧培养细 胞出现凋亡图.。 图. 激光共聚焦显微镜下培养不同时间后的形态变化 .. : : ??: ??‘ :. : ? ‘ :. ::.. .. 法检测细胞增殖情况 低氧培养较常氧培养均明显提高细胞增殖,低氧下细胞增殖率与 常氧下 比较,.,差异性具有统计学意义表.: 较低氧下组对细胞增殖的抑制作用表.和图.,经统计 学分析,差异性有统计学意义.。 一定时间内,处理组细胞增殖率明显低于处理组, 处理组细胞增殖率明显高于其他药物处理组表.和图.,且都具 有时间依赖性。比较低氧下外源性药物对细胞增殖率的影响,差 异性均有统计学 意义.。.处理组可能是内源性腺苷对细胞增殖影响 的作用。 表. 法检测不同低氧时间和不用药物处理后的值 ?,寻:宰: ; 比较低氧下不同药物,?.,各药物对细胞增殖影响的差异性有统 计学意义; 比较低氧不同时间,?氏.,细胞的增殖的差异性有统计学意义。 一”?瘸 静 : 低氧下不同药物对细胞增殖的影响 呕。 ., 坞 三矗?《 州 。。,、。。?.蔷 ,;;;乱;;。骜,,簖~图. 法检测低氧下不同药物对细胞增殖的影 响.. 表.不同药物对增殖率的影响?, . :.;比较不同时间药物对细胞增殖率的影响,.,差异性 均有统计学意义。 鸳 爹 不同药物对细胞增殖率的影响 ? ? ?卜. ? ??一 ? 喂 一 ?羞卜 ? ?掌?.目。霉矗宣号. ?,.& 。 图.不同药物处理对增殖率的影响 . .. : , , , . ; , ; , ; ,, . .讨论 .. 与作用机制的关系 是一个发生机制非常复杂的病理生理过程,临床病死率较高。肺血管 收缩和血管重构是肺动脉高压发生的重要基础,近几十年来,关于 肺动脉高压机制的相关研究和假说很多,如活性氧很早就被发现与肺动 脉高压有紧密联系,它的发现和研究已达年,但目前尚未发现靶向的干 预措施,肺动脉高压的治疗需要在原有领域进行深入研究和不展新的研究领域, 并且积极向临床应用靠拢。 目前已有大量研究发现内钙离子、钾离子浓度改变、活性氧自由 基的激活和低氧环境等等能够改变的增殖和凋亡【。,认为 增殖的不平衡和凋亡的减少可以促进肺血管重构和慢性肺心病病人的肺动脉压 力,并提出低氧是增殖加快和凋亡减少的主要因素,增殖是 肺动脉高压发生的一个重要机制。本研究通过低氧下观察增殖和 膜上的表达情况,发现低氧下增殖和表达变 化具有时间依赖性,且细胞增殖达到一定程度后生长行为发生较大变化,等 【】研究提出的特发性高血压大鼠的血管平滑肌细胞的特殊生长行为的结果一 致,提示低氧下形态变化是发生时肺血管生理改变重要基础,同 时机体内低氧致增殖很可能是通过其膜上表达进行适应性调 节,该调节失控后增殖和凋亡失去平衡,从而影响血管紧张度和肺动 脉压力的调节。 ..腺苷及其受体对的影响 对的影响 腺苷是机体能量代谢产生的一种嘌呤核苷,被认为是内源性生理激素,主要 通过腺苷受体包括、、 受体发挥生物作用,腺苷受体在机体 分布较为广泛,平滑肌主要以为主。目前,腺苷具有舒张血管、降低肺 动脉高压的作用已被广泛证实,我们的前期研究也证实了这一结论,并发现低氧 下肺血管上分布的明显增多,尤其在内皮层和肺动脉平滑肌层,提示腺 苷对血管的舒张作用主要通过这些部位相应的受体来实现,而是 发生的重要生理基础,那么膜上的表达变化很可能是影响低氧致 肺动脉高压的重要因素。 本研究通过体外培养,然后在低氧下培养用腺苷受体激动剂 .和特异性拮抗剂处理的,研究发现低氧诱 导增殖的同时膜上表达也在增加,并且都具有时间 依赖性。与等】提出和共同作用具有抑制细胞增殖和保护心 脏再灌注损伤作用的研究结论一致。但是,低氧下增殖在实验观察时 间内是持续增加,而的表达增多在观察后期逐渐恢复到常氧水平,低氧 下.处理组对细胞增殖的影响是从短时期的显著抑制作用后很快出现增 殖和增殖率的升高,最终可能达到低氧培养细胞的增殖程度。这些结果提示,外 源性腺苷通过膜的表达变化调节增殖,继而影响肺 动脉的收缩和结构重构效应。另外,还发现.处理组产生了与 促进细胞增殖作用相似的效应,但是弱于的作用,认为低氧 下对细胞增殖的影响和对细胞增殖率的影响均高于.处理组,提 示可能具有促进细胞增殖的作用。对外源性药物的敏感性和外 源性药物的分解代谢对药物效应的持续时间有一定的影响,这些对临床应用外源 性腺苷治疗肺动脉高压有一定的指导意义,但是,外源性腺苷减缓和治疗肺血管 收缩和结构重构的作用尚存在较多未知问题,对治疗的作用和临床意义仍 有待进一步研究。 我们前期的在体研究【】发现慢性低氧可引起大鼠心肌内源性腺苷含量显著 增加,但是心肌保护作用并不显著,认为腺苷的慢性累积和或腺苷受体持续 激活后敏感性下调,可能阻断了腺苷及其受体的作用途径。本次研究显示,离体 培养的在低氧条件下用.处理组显著地抑制了细胞增殖,且具 有时间依赖性,但是细胞的增殖率却是在实验后期改变了作用趋势,提示可能低 氧后期内源性腺苷的作用逐渐占主导地位。然而,离体培养细胞的过程包括了低 氧环境、细胞膜表达增多和药物刺激后敏感性的下调这些因素,但是低 氧致细胞增殖作用的途径比较复杂,目前相关途径的研究仍不十分清楚,所以尚 不能认为内源性腺苷对低氧致细胞增殖作用的影响。 低氧对内皮细胞和平滑肌细胞上表达影响的比较 低氧在许多病理生理条件下都发挥重要作用,如再灌注损伤、炎症、肿瘤生长,它是介导细胞腺苷释放的潜在刺激因素。有研究【加】 发现低氧孵育后平滑肌细 胞上表达显著增加,其他三种受体则无变化,而内皮细胞在常氧下以 的表达和功能为主导,短时间低氧孵育后内皮细胞表达增多 表达下降,虽然转为占主导作用,但表达量仍不高,而腺苷、 受体表达无变化,提示虽然内皮细胞具有强大的分泌合成功能,介导和参与 了许多病理生理过程,但是内皮细胞的低氧致表达变化作用低于平滑肌 细胞,并且也发现上调血管生长因子促进血管生成的过程不 依赖.参与,因此,对低氧致细胞增殖作用的调节主要发生在血管 平滑肌细胞。 ..腺苷及其受体在过程的可能机制 研究发现,肺动脉高压过程中细胞生长方式的改变是该病理过程的重要基 础,所以有人认为肺动脉高压是心血管疾病中“癌症。本研究发现,常氧下, 体外培养的生长融合后出现典型的“峰.谷样生长方式,随后出现显著 的细胞凋亡,然后继续融合生长,形成周期性循环,而低氧下培养的细胞融合后 未见典型的“峰.谷样生长方式,实验观察时间内均未出现明显凋 亡,说明低 氧诱导细胞增殖的同时降低了细胞凋亡,这一过程可能有多个信号转导通路参 与,比如钾钙例子通道、?磷酸化、致使生存能力增强,细胞凋亡受到抑 制,最终调控血管收缩和血管重构,从而发展至肺动脉压力升高,成为临床上难 治疗的。另外,也解释了正常机体的肺血管紧张度和结构能够维持一个平衡 的状态,不表现肺动脉高压。发生发展过程的凋亡很可能是重要机 制,低氧下致的表达变化是不是细胞凋亡介导的途径,尚需进一步研究。 目前已有大量研究提出一些信号通路和因子参与,如./.是与、 .等因子相关或者共同参与组成的发病机理【】。 目前,作用机制的研究比较广泛,包括一些参与途径的机制和假说等。 有研究发现【】肺部低氧预处理模型上腺苷发挥组织保护的过程中?.调节基 因组功能减弱,并证实低氧预处理过程.功能被抑制,并启动腺苷的保护作 用,这很可能是作用机制研究的一个新途径。也有研究提出基 因的缺失与低水平血管炎症、致炎细胞因子增多如、的相应下调 及血管粘附分子的上调都有一定联系。低氧诱导因子.是重要的氧平衡调节转录因子,分布和作用都很广 泛,在低氧性疾病过程居于核心地位。.是低氧引起的一系列病理生理过程 中必不可少的重要因子【,低氧诱导表达增加,其机制可能与其有着直 接或间接的联系。等【】研究证实,.绑定区域存在于启动子上, .在低氧下致转录诱导功能上发挥了重要作用。.和作为 发生发展过程的重要因素,很有可能存在共同的激活通路或者是 .介导低氧产生一系列病理生理过程的途径之一。本课题研究发现,无论在 体实验还是离体实验低氧下肺动脉的表达较常氧明显增多,可以认为腺苷 的活性增强,低氧也激活了.的生物活性,在肺血管上.与腺苷及其受体 共同调节细胞增殖,调控和的发生,从而影响的发生发展,成为 发生机制的一个重要途径。但是本研究尚未对.的表达进行研究,我们 将把.和缺氧诱导丝裂原因子对的影响作用作为继续研究的内 容之一,结合.、和对增殖的影响,进一步探讨发 生发展的机制。 ..本研究的实验意义和临床意义 心脑血管疾病在当今社会的发病率一直居于首位,也一直是科研研究的热 点。目前,肺动脉高压是慢性肺心病最常伴发的一个病理过程,也是儿科医生面 临的一类棘手病症,比如新生儿持续肺动脉高压、先天性心脏病、儿童哮喘及肺 炎等,临床治疗尚无有效治疗方法和药物。外源性腺苷能够降低肺动脉高压的作 用已经被广泛证实,其中具有血管缺血再灌注损伤及低氧致组织细胞损伤 的保护作用】,对肺血管的影响作用较为重要。结合我们前期的在体实验和本 次离体实验通过应用腺苷受体激动剂和拮抗剂培养,提高外源性腺苷能 够显著抑制低氧致血管平滑肌细胞增殖并降低肺动脉高压,本研究结果很大程度 的推进了腺苷类药物用于治疗低氧致肺动脉高压的研究进展,为腺苷及其受体的 机制研究和腺苷类药物治疗提供了实验依据和理论指导,腺苷将成为药理学 研究治疗的一个新领域。小结 低氧致膜表达增多,具有时间依赖性。 外源性腺苷能够显著抑制增殖,提示外源性腺苷将有可能是治疗 的重要药物。 参考文献 】 : . . ,, : 【】何立英,刘静,刘亚敏.在低氧性肺动脉高压大鼠肺血管重构 中的作用. 武警医学院学报,,:. . , 【】 :? , , . 】, . .曲: ,,:一 .. ?, , 】. ,,: . .’ , , . ,,:? . 】 , , ,, . ,:? . 】 , , :. ,, :? 【】 . . ,: . 【】:. ,,: .】 , , , 【】. ,,: . , : .&,【:,】 , , . . ,, :】 ,?.谢 ,: ., . .【 】 , , , ,, . :? ., 【 】.,,: . .【 】 , , .,: .’ , 】 , ,,:.】 , , . : : .,, 【】 , , , . : / . : ,, 。【 , , . . , ,: , , 】 . .,, : 【】谭建新,陈新民,方兴,等.持续应用腺苷对大鼠低氧肺动脉高 压的作用.南 . 方医科大学学报,,: . , , 【】 ,.,, : , . 】 凡 . ,,: . , , , 】 : .,, 【】司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.第一版.北京:世界图书出版社,: