β巨噬细胞系RAW2647作用的研究

β巨噬细胞系RAW2647作用的研究 江苏大学 硕士学位论文β-葡聚糖对小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7作用的研究 姓名:郭兰芳 申请学位级别:硕士 专业:临床检验诊断学 指导教师:闻平 20080610 江苏大学硕士学位论文 摘 要 背景与目的 近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂及放射治疗的长期应 用，尤其是艾滋病患者的增加，使真菌感染的发病率逐年上升。与此同时，临床 上抗真菌药物的大量使用，使真菌的耐药性迅速增加，成为真菌感染治疗的一大 难。,,一葡聚糖广泛存在于各类真菌的细胞壁中，阐明,,一葡聚糖的致病机制， 从而消除炎性细胞因子的产生成为目前治疗真菌感染的新思路。本研究的目的是 探讨,,一葡聚糖对小鼠单核一巨噬细胞系,,,,,,(,的增殖作用以及对,师一,表 达的影响。旨在探讨,，?,,,信号转导通路在真菌致病过程中的可能作用，从而 为真菌感染治疗新药的研究提供实验依据。方法 ,,一葡聚糖配制成,,,,,,,的溶液，,”,冰箱保存。使用时用培养液按一定 比例稀释。,,,,,;小鼠来源的巨噬细胞株,,,,,,(,在,,。,、,,,,,及饱和 湿度条件下，体外培养于含,,,胎牛血清的,,,,,,,,培养液中。随时用倒置相 差显微镜观察细胞形态，期间换液、传代，取对数生长期,,,,,,(,细胞，胰 酶消化后计数，用培养液调整至合适的细胞密度，进行,,,实验观察,,一葡聚糖 对,认,,,,(,细胞增殖的影响;采用,,，,,、,,,,,,方法,,,(,蛋白以 及,,,,的表达情况;,,,,,,, ,,,,法检测,,,,,及,,,,,蛋白的表达;测定 ,,一葡聚糖刺激作用前后细胞内【,,,，】,及;,,,浓度变化，观察,,一葡聚糖对细胞 内第二信使传递系统的影响。 结果 ,,,结果显示，,一葡聚糖对细胞增殖的影响与其作用的时间和剂量有关; ,,卜。分泌量与,,一葡聚糖刺激终浓度以及作用时间选择性相关; ,,,,,,, ,,,,检测结果显示，在终浓度为,,,,,,,,,的,一葡聚糖刺激作用下 ,,,,,,(,细胞内,,,,,,蛋白表达; ,一葡聚糖刺激作用前后细胞内,;,,，】,及;,,,浓度发生改变 结论 江苏大学硕士学位论文 适当浓度的,,一葡聚糖可以刺激,,,,,,(,细胞系的增殖，并且能够剂量依赖性地诱导,,,(,的表达: ,,一葡聚糖可以明显活化,,,,,,,,,,,信号转导途径; ,,一葡聚糖刺激,,,,,,(,细胞内第二信使传递系统【;,,,及;,,,浓度的 改变，浓度改变幅度与,,一葡聚糖的刺激浓度相关。关键词,一葡聚糖; ,,,,,,(,细胞系; 增殖;胞内游离钙: 环磷酸腺苷; ,, 江苏大学硕士学位论文 ,, ,,,,,,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,;,,, ,,,,,，、,，，,, ,,,,,—,,,;,,,, ,,,,,,,,,;,，,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,，,, ,,;,,,,,,，,,, ,,;,,,,;, ,, ,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,;,,,,,, ,,,, ,, ,,,,(,, ,,,,,,, ,,,,，;,,,,;,, ,,, ,, ,,,,, ？,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,，, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,, ,,;,,, ,,,,,,,(,,一,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,,,(,,,,,,, ;,,,, ,,,,,,,,,; ,,;,,,,,,,, ,,,;,,，,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,,,, ,,;,,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,;,,,,,(,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,;, ,,,,;,,,,,,,;,,,,,,, ;,,, ,,,, ,,,,,,(, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,;,,，,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,?, ,, ,,, ;,,, ,,,, ,,,,,,(,(,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, 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,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,(, ;,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,;,, ,, ,,,,, ;,,;,,,,,,,,, ,, , ,, ，, ,, ,,;【;神, ,,, ;,,, ;,,;,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,;,, ,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,(,;,,,,;,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,。,;,,,,,;,, ,,, ,;,,,,,,, ,,,,,,?,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,;,, ,,,,,,,,, ,,, ;,,;,,,,,,,,, ;,,,,, ,,〔,,,，〕, ,,, ;脚,, ,,,,,,(, ;,,,,，,,, ,,,, ,, ;,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,;,, ;,,;,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,(, ;,,, ,,,,;,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,;,,;，,,,,;,,,,,,, ;,,;,,,; ;,,,; ,, 江苏大学硕士学位论文 英文缩写索引 ，、，?一，,??，?英文缩写 英文全称 中文全称,值 ,,,,,,,, ,,,,, 吸收值,, ,,,, ,,,, 碱基对,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, 二甲基亚砜,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,, 胎牛血清，,,, ,,,,,,,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,, ,,,,抑制浓度，, ，,,,,,,,,, ,,,,, 抑制率,,, ,一(,，,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,),,，,, 四甲基偶氮唑盐 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,啥,, ,,,,,,, ,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, 丝裂原激活蛋白激酶 (,,,),,,,,,—,,,;,,, ,,,,，,一,(葡聚糖,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 细胞外信号调节激酶,(,,,,，, ,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, 酸化细胞外信号调节激酶,场 ,,,,,,, ,,,, 蛋白质转移印迹法,,,, ,,,,,;,,, ,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 聚丙烯酰胺凝胶电泳,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 磷酸盐缓冲液,,, ,,,,,, ,,,,;,,—,,,,,,, 十二烷基硫酸钠,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 缓冲盐溶液,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,，,，,，,一四甲基乙胺,,,, 确,,(,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,, 三羟甲基氨基甲烷,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,??,,,(,??,,,,,,,,,, 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 ,,,,,,,，,，,?，,?,,,,,,,;,,,; ,;,, ,, 学术诚信声明 本人郑重声明:所提交的学位论文，是本人在导师的指导下独立完成的。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到违反本声明的 一后果由本人负担。 学位论文作者签名:事严了事 日 期:?,(,，,,( 学位论文版权授予书 本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送 交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段?,婧突惚啾狙宦畚摹?保密口，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密,。学位论文作者签名:专,笋芎 导师签名: 间平签字日期:‰》？，,(， ,( 签字日期:埘口,;。,，， , 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论,(,真菌感染趋势 近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂及放射治疗的长期应用，酵母样真菌引起的全身性感染呈上升趋势。在美国医院获得性血液感染中，念珠茵感染排在第四位。,,,,,等?,报道,,,,年,月至,,,,年,,月间全球抗真菌监测研究组从临床收集了,,,,,个酵母样真菌，监测数据表明真菌血症病原菌中第,位为白念珠菌(,,,)，第,位为光滑念珠菌(,,,)，其它念珠菌只占,,,，只有少数几个国家平滑念珠菌的比例超过光滑念珠菌。在我国，深部真菌感染的发生率也呈逐渐增高的趋势。吴绍熙等报道,?,,,,年,月,日一,,月,,日和,,,,年,月,日,,,月,,日在全国,,个省、市、自治区,,多个有代表性的单位对临床或现场确定的致病真菌进行了动态研究，就病原菌变迁、各地区动态状况和具体疾病等作了较详细。发现在,,,,年占第,位的白念珠菌到,,,,年已升至第,位，所占比率亦从,,,,年的,,上升至,,(,,，其他非白念珠菌所占比率均有不同程度上升。与此同时，临床上抗真菌药的大量使用，使真菌的耐药性也迅速发展。成为真菌病治疗的一大难题。因此阐明真菌相关疾病的发病机理，从而推动抗感染药物的治疗研究，无疑具有重要意义。,(,抗真菌药研究现状 目前常用的抗真菌药物按结构类型大致可分为抗生素类、嘧啶类、烯丙胺类、吗啉类等。按其作用机制大致可分为干扰真菌细胞质膜合成，影响细胞,,,或,,,合成、影响真菌细胞壁合成和抑制真菌蛋白质合成等几种类型。其中以真菌细胞壁作为靶点开发新药是近年来研究的热点。细胞壁是真菌细胞生物学过程和致病力各个方面所必需的特殊动力学结构。作为真菌最外层部分，细胞壁调节着宿主与真菌之间的相互作用，包括对宿主器官的粘附以及宿主抗念珠菌免疫反应的调解。通过抑制或阻断被公认的致病因子来改变宿主,真菌间的相互作用，破坏真菌在宿主体内的定植以及削弱真菌感染的过程，或者开发细胞壁抗原的特殊抗体，保护宿主免受真菌感染。另外还可以抑制细胞壁的生物合成，削弱细胞壁的完整性，破坏细胞活性。 , 江苏大学硕士学位论文,(,单核一巨噬细胞功能研究迸展 单核细胞系统细胞在成人主要来源于骨髓造血干细胞，骨髓中的髓样干细胞受细胞因子的作用发育成前单核细胞，然后发育成单核细胞，并不断进入血流。单核细胞在血流中存留仅数小时至数日，即移行至全身各组织器官内，发育成熟为巨噬细胞，寿命可长达数月以上。单核一巨噬细胞的功能复杂，有抗感染和抗肿瘤的作用，参与特异性免疫应答和分泌各种物质。单核一巨噬细胞在环境因素刺激下，可发生形态膜分子表达以及细胞代谢与功能的短暂可逆性变化，这一过程称为单核一巨噬细胞的激活。单核一巨噬细胞的激活是一个复杂的多步骤过程，在不同的活化阶段，涉及不同刺激因子的作用，细胞形态及功能也发生相应的改变。以巨噬细胞 (,?)为例，体内的,?一般处于静止状态，病原体等异物通过直接接触激发,?内的生理生化反应。环核苷酸第二信使;,,,,;,,,水平升高，使静止态,?转变为应答性,?。后者在，,,,丫等刺激因子启动下转变为致敏的,?，然后在脂多糖或某些细胞因子作用下转变为活化的,?。 在上述变化过程中，,,表现出形态改变(浆膜呈不规则波浪形，细胞器增加，膜分子表达改变)，代谢增强(胞内蛋白质合成与,,,生成增加，磷酸戊糖代谢增强)以及功能增强(吞噬率及吞噬速度增高，杀菌及杀瘤能力增强，分泌活性及抗原呈递能力增强)等。许多因素可以激活单核一巨噬细胞，例如革兰氏阴性细胞壁的脂多糖，通过刺激单核细胞而激活防御反应，其可增加单核细胞的粘附，触发单核细胞的表达;许多细胞因子在免疫反应启动期间同样能激活单核细胞;补体成分及免疫复合物，,,,、，,,、,,,和补体(,,,)、免疫复合物和前列腺素都能激活单核细胞。,,,(,是主要由激活的巨噬细胞产生的一种多向性细胞因子，是炎症反应的主要介质。,,,(,以,, ,,分泌型(,(,,,(,)和,, ,,跨膜型(,,(,,,(,)二种形式存在啪。目前研究表明，,,(,,,主要是通过细胞(细胞间直接接触发挥局部生物学效应，其毒副作用较小，且可介导对,(耵虾耐受细胞株的细胞毒作用,一,，,,,(,能引起组织固有巨噬细胞的激活和巨噬细胞的进一步聚集。病原微生物侵入机体后，在激发免疫应答以前即可被单核一巨噬细胞吞噬并清除，这是机体非特异免疫防御机制的重要环节。由于其吞噬能力较强，故有人将单核一巨噬细胞称为机体的清道夫。在致病微生物激发机体产生特异性抗体后，覆盖于病原体表面的,,,及补体激活片段,,,可与单 , 江苏大学硕士学位论文核一巨噬细胞表面的,;,及,,,结合，发挥调理作用，使病原体更易被吞噬。被吞入的细菌可被细胞内的某些酶类或活性氧所杀灭;另一方面，在对异物颗粒的吞噬、杀灭过程中，可能出现酶体外漏现象，从而造成对邻近正常组织的损伤。机体生长、代谢过程中不断产生衰老与死亡的细胞以及某些衰变的物质，它们均可被单核一巨噬细胞吞噬、消化和清除，从而维持内环境稳定。单核一巨噬细胞还广泛参与炎症、止血、组织修复、再生等过程。,,,,,,(,细胞系是来源于小鼠单核细胞一巨噬细胞的肿瘤细胞，保留了正常单核细胞一巨噬细胞的大部分性质，所以我们用其作为实验研究对象。,(, ,,,，,一,,葡聚糖 ,,,，,一,,葡聚糖广泛存在于各类真菌的细胞壁中，占真菌胞壁成分,,,以上。近年来研究表明,一葡聚糖可以产生多种不同的效应，其中包括抑制肿瘤发生“,，,,的产生,?,,以及刺激射线防护效应下巨噬细胞的释放睁,,,。正是由于,一葡聚糖在免疫反应中表现出的诸多有利效应导致其成为目前研究的热点,,。最近发现它是一种强大的免疫调节剂,,,。有许多因素可激活单核一巨噬细胞系统的活性，其中,一葡聚糖可通过与巨噬细胞、嗜中性粒细胞和,,细胞上的受体相互作用，诱导生物活性，提高宿主免疫功能。具有免疫活性的,一,，,一,卜葡聚糖是葡萄糖通过,,,，,一伊糖苷键连接而成的,类高分子化合物，广泛分布在细菌、酵母、蘑菇、真菌、谷物、海藻中。且一葡聚糖具有抗肿瘤和辐射保护作用，是哺乳动物、无脊椎动物的免疫促进物，还可增加巨噬细胞分泌细胞因子，用于治疗细菌、病毒、真菌和寄生虫引发的疾病。不同来源的,一葡聚糖，在化学组成和结构上都存在一定差异,,。蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递外界各种信息的重要传导机制，在细胞的生物学活动中起着重要的作用。一系列的蛋白激酶及其磷酸化活化构成了信号传导级联反应。,,,,信号通路是近年来研究引人注目的蛋白激酶级联通路。,,,,,,丝裂原活化蛋白激酶是,,,,家族成员之一，为一高度保守的苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，它参与介导由细胞因子、细菌病原体及产物、应激等多种刺激引起的细胞反应，在炎症反应中起 着重要的作用。„,”细胞在外界各种因素的刺激下，通过一系列细胞内信号传导途径使,,,,,,一,,,,的,,,,,,,?樱澹颍常叮潮涣姿峄せ睿罨蟮模牛遥耍欤采酢玻剩穑牛遥耍欤步胂赴四谕姿峄饔眉せ畎危疲保ǎ略谀诘?, 江苏大学硕士学位论文多种转录因子，从而导致相应炎性细胞因子基因表达的增加，最终导致各种炎性细胞因子的大量产生，引起炎症产生。因此,,,,,,,,,,,在细胞因子的产生过程中起着“分子开关”的作用(见图,(,)，阻断这条信号传导通路可从上游减少多种炎性细胞因子的产生，从而减轻炎症达到治疗目的。雾鬻,,。吐。?;::弩,陇腻洒洲?耐,施,训乱咖 ,绷,。鞠,,,二?抽。醣蹿…“。(:,硌，?,霉啡菇瓤,珥(;嚣、 ,,,,,,,，,,，,, 图,,(, ,,,,,,,,信号转导示意图(摘自;,,, ,,,,,,,,,) 江苏大学硕士学位论文 第二章研究目的、方法、实验设计和意义,(,研究目的、方法 我们以小鼠单核巨噬细胞系,,,,,,(,为研究对象，探讨,一葡聚糖刺激小 鼠单核巨噬细胞系,,,,,,(,中,,,(,表达情况，细胞内游离钙离子浓度变化情况 以及,，?,,,信号通路在这一过程中的作用。本研究总体的技术路线为初步运用,,,,,,及,,，,,等技术证实细胞因子基因及蛋白表达的基础上，进一步运用 ,,,,,,, ,,,,等技术，观察,,一葡聚糖刺激作用前后,，?,,,蛋白激酶在巨噬细胞株,,,,,,(,中的表达情况，为真菌病治疗的新药研究提供实验依据。所有数据采用 ,,,,,,(,统计软件处理，对所有计量资料进行正态性检验，数据以均数?差 (,士,)表示，组间比较采用,检验，不同组间的比较采用方差分析及？检验。,, ,(,,认为有显著性差异。,(,实验设计方案 根据国内外的文献报道设计了本研究的实验方案，操作线路如下: 弋 了绷，,收集 ，按葡聚糖的不同浓度进行分组 , 江苏大学硕士学位论文,(,研究意义: ，已经有研究表明,一葡聚糖可以对吞噬细胞的活性产生影响，可以调节炎性因子的产生，这些细胞因子在真菌感染的发生发展过程中起着十分重要的作用。因此阐明,一葡聚糖致病的机制，从而消除这些炎性细胞因子的产生具有重要意义。蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递外界各种信息的重要传导机制，在细胞的生物学活动中起重要作用。,，?,,,丝裂原活化蛋白激酶是,,,,家族成员之一，为一高度保守的苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，它参与介导由细胞因子、细菌病原体及其产物、应激等多种刺激引起的细胞反应，在调节炎性因子的释放中起着“分子开关打的作用。因此阻断这一信号通路可减少炎性细胞因子的释放。预示,,,,,,一,,,,信号转导途径可以为治疗真菌病提供一个新的靶标，,,,,,,的特异性抑制剂,,,,,,,、,,,,,有可能成为真菌病治疗的新药物。 , 江苏大学硕士学位论文 第三章实验材料,(,细胞系 ,,,,,小鼠来源的巨噬细胞株,,,,,,(,购自中国科学院上海细胞库。该细胞 在,,”(,、,,,,,及饱和湿度条件下，培养于含,,,胎牛血清的,,,,,,,,培养液 中。,(,主要试剂 ,,,，,,,,培养基 ,,,,,公司 胎牛血清 杭州四季青 胰蛋白酶 美国,,,,,,;,公司 口一葡聚糖 ，,,,,,,,,, ,,, 美国,，,,,公司 小鼠,,,, , ,,，,,检测试剂盒 美国,,,公司 兔抗大鼠,,,,,多克隆抗体 ，,,,,,,,,, 小鼠抗人仅(,,(,;,,,单克隆抗体 北京中山公司 兔抗小鼠,，?,单克隆抗体 ,,;,, 过氧化物酶标记羊抗兔，,, 美国 ,,,公司 ,,,提取试剂(,,,,,,,) 德国,,;,,公司 ,,,引物 上海生工 ,,,,,, ,，,,, ,,, ,,,,,, 晶美生物 ,,,, 美国,,,,,,;,公司 甲叉双丙烯酰胺 美国,,,,,,;,公司 丙烯酰胺 美国,,,,,,;,公司 ,,,,,一,, ,，,,, 甘氨酸 美国,,,,,,;,公司 叠氮钠(,,,,,,,,,,,) 美国,,,,,,;,公司 十二烷基硫酸钠,,,溶液 ，,,,,,,,,, 江苏大学硕士学位论文 ;,,,浓度测定试剂盒 上海中医药大学 ,,,,,巯基乙醇 美国,,,,,,;,公司 ,,,,,原溶液,，,，,?,?四甲基乙二胺 沪试 ,,,,(,,,? 沪试 过硫酸胺(,,) ,，,,, ,,,,考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用) 上海化学试剂厂 牛血清白蛋白(,,,) ,,,,,;, ,,,,显色试剂盒 ，,,,,,,,;, ,,,, ,，,,,,(,主要试剂的配制方法,,,,,,,,培养液的配制与消毒(,,,,,,) 先将培养基粉剂加入培养液体积,,,的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋,,, 次，冲洗液一并加入培养基中，充分搅拌至粉剂全部溶解。用注射器向培养基 中加入配制好的青、链霉素液各,(,,,，使青、链霉素的浓度最终各为,,,单 位,,,。然后用,,,,,,的盐酸和,,,,调,,到,(,左右。最后定容至,,,,,,， 摇匀。配制好的培养液用蔡式滤器在超净工作台内过滤，将过滤好的培养液分 装入小瓶内置于,”,冰箱内待用。使用前要向,,,,,培养液中加入,,,谷氨酰 胺溶液。,,,缓冲液的配制与消毒(,(,,,,,,,) ,,,， ,(,, ,,, ,(,, ,,,,,,,。, ,,,, ,(,,, ,,,,,, ,(,, 加去离子水至,,,,,,，高压灭菌，,。,保存备用。细胞消化液(,(,,,胰蛋白酶与,(,,,,,,,) 用高压的,,,配制,(,,的胰蛋白酶并以,(,,,,滤膜过滤，同时配成 ,(,,,,,,,高压灭菌消毒，将两种液体以等体积混合使其终浓度为,(,,,胰 , 江苏大学硕士学位论文 蛋白酶，,(,,,,,,,，分装，(,,”,贮存。青、链霉素溶液的配制与消毒 „ 市售链霉素,,,万单位,瓶，加入,,,无菌,,,,, 青霉素,,万单位,瓶加入,,,无菌,,,,, 混合后,(,,，,,,滤膜过滤，分装，,,,,,保存。 工作液浓度:,,,单位,,,链霉素，,,,单位,，,,青霉素,,,,,,的,,,试剂 ,,,需现用现配，称取,(,,,,,(,,粉末置于,,,,,,,,,管中，加,,,,,,液， 摇匀后,”,保存。抗体稀释液: 取,, ,, ,(,,, ,,,,加,,蛋白干粉和,,,,浓缩抗体稀释液混匀，此抗体稀 释液可保存一周左右。一抗和二抗均用此稀释液保存一周,,,的聚丙烯酰胺溶液: 溶解,,(, ,丙烯酰胺和,(, ,甲叉双丙烯酰胺于双蒸水中，待充分溶解后定 .