【doc】TNP-470联合CTX对小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的影响

【doc】TNP-470联合CTX对小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的影响 TNP-470联合CTX对小鼠LA795肺腺癌皮 下移植瘤生长的影响 湘南学院(医学版)20o8年12月第10卷第4期9 TNP一470联合CTX对小鼠LA795 肺腺癌皮下移植瘤生长的影响 王小华,张平,李国亮,张忠山,王铲 (1湘南学院附属医院肿瘤科,湖南郴州42.3000;2南华大学学院,湖南衡阳4210o1; 3中国医学科学院肿瘤研究所药物检测中心,北京100021) 摘要:目的研究血管生成抑制剂TNP一470联合CTX对小鼠L795肺腺癌生长的抑制作用.方法将40只接 种高转移性的LA795肺腺癌细胞1739小鼠随机分成5组:对照组,溶剂对照组,TNP一470组,环磷酰胺(crx)组和1NP 一 470+CTX组.接种4d后开始用药,用药期间,每隔1d测量皮下移植瘤体积,20d后处死全部小鼠,剥离皮下移植 瘤并称重.采用免疫组化和图像系统定量检测皮下移植瘤中微血管密度(m),血管生长因子bFGF及增殖核抗 原PCNA的达,用原位凋亡-TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数.结果各用药组肿瘤的生长明显受到抑制,而联合用 药组抗瘤作用进一步增强,且具有协同作用.CTX组,I帅一470组和联合用药组与 对照组相比都能减少bFGF表达;与 CTX组相反,TNP一470组肿瘤组织中抗原PCNA的表达与对照组相比无差异显着性.TNP一470组和联合用药组肿瘤 组织中的MVD与对照组相比都明显减小;而各用药组的凋亡指数比对照组都明显增高.结论TNP一470组xCTX组 中LA795肺腺癌生长受到明显抑制,两者联合应用具有协同作用. 关键词_.TNP一470;LA795;凋亡;血管生成抑制剂 中图分类号:R734.2文献标识码:A文章编号:1673—498x(20o8)o4一OOO9—04 InhibitoryEffectsofTNP一470inCombinationwithCTXon GrowthofLungAdenocarcinomaLA795inMice WANGXiao—Hua,ZHANGPing,LIGuo—hang,etal (DepartmentofOncology,TheAffiliatedHospitalofXiangnanUniversity,Chenzhou,Hunan423000,China) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofangiogenesisinhibitorTNP一 470combinationwithCTXOilthegrowthof lungadenocarcinomaLA795inmice.MethodsFortyT739micebearinghighmetastaticLA79511111101"cellswererandom— izedintofivegroups:controlgroup,vehiclecontrolgroup,TNP一 470group,CTXgroupandTNP一470+CTXgroup.Dif- femnttreatmentswereservedfrom4thdayaftertransplantationandallmiceweresacrificedafter20days.Thevolumesof ttllTlOrsweremeasuredrespectivelyduringthethempytime,andsubcutaneouslunlorswereprocessedforhistologicalexami— nation.Tumorsmicmv~ldensity(MVD),theexpressionofPCNAandbFGFweredetectedbyimmunohistochemical methodwithimageanalysesystem.Apoptosisintunlorswasmeasuredbybiotinyated— dUTPnickandhb~ling(TUNEL) n1ethed.ResultsIneachtreatmentgrouptunlorgrowthwassuppressedsignificantly.Thecombinationgroupshowedsignifi— cantenhancementinanti— tUlTIOrefficacy.ExpressionofbFGFwasclearlyinhibitineachtreatmentgroup,butapoptosis Wasenhanced,ascomparedwiththecontrolgroup.ContrarytoCTX,TNP一 470hadnoeffectsontheexpressionofPCNAin tu/nor.TumorMVDWaslowerincombinationgrouporTNP一 470groupcomparedtocontrolgroup.ConclusionTNP一 470caninhibitthegrowthoflungadenocarcinomaLA795.Whencombinedtl1a ?.itmayproducesynergeticeffect. KeyWords:TNP一470;LA795;Apoptosis;Angiogenesis 实体瘤的生长和转移需要肿瘤新生血管生成,自 妣kIIlan[]首先提出实体瘤生长需要血管的生成理论 收稿日期:2008—11—03 基金项目:湖南省卫生厅科研基金资助(2o0309o) 作者简介:王小华(1975一),男,主治医师,医学硕士. 后,有关血管抑制剂的研究十分活跃,抗肿瘤血管生 成疗法也就成为当前肿瘤生物治疗研究热点之一. 10JoumalofXiangnanUniversity(MedicalSciences)Dec.2008Vo1.10No.4 本实验利用LA795肺腺癌细胞形成T739小鼠皮下肿 瘤动物模型,应用血管生成抑制TNP一470及化疗药 CTX,观察单独及联合用药对LA795肺腺癌皮下移植 瘤生长的抑制作用,并探讨TNP一470抗肿瘤生长的 作用机制. 1材料和方法 1.1试剂TNP一470由日本Osaka,Takeda化学工 业公司提供,用无水乙醇3rnl溶解,97n1l生理盐水稀 释.CYX为齐鲁制药厂产品,生理盐水溶解.CD34 免抗人或鼠一抗(福州迈新公司),bFGF为免抗人或 鼠一抗(北京中山公司),PCNA鼠抗鼠一抗以及 TUN-EL原位调亡检测试剂盒(武汉博士德公司). 1.2动物1739雄性小鼠40只,鼠龄45周,均重 20g左右,及LA795肺腺癌荷瘤鼠2只,均由中国医 学科学院肿瘤医院动物室提供,中国医学科学院动物 研究所提供SPF级饲养环境. 1.3肿瘤动物模型断颈处死2只荷瘤鼠,无菌条 件下剥离瘤块,按1g肿瘤组织加4Hll生理盐水放入 表现皿中,用剪刀剪碎肿瘤,然后移入匀浆机中研磨 成匀浆液,过360目铜网,生成肿瘤细胞悬液,倒人离 心管中,加入生理盐水,显微镜下调节细胞浓度为2 ×106/ml,然后于每只雄性T739近交系小鼠右后腿根 部外侧皮下注射0.2ml肿瘤细胞悬液,形成小鼠皮 下肿瘤动物模型. 1.4体内实验实验小鼠皮下移植处均成瘤,并随 机将其分成5组,每组8只.?对照组(给予生理盐 水);?溶剂组(给予3%的乙醇);?TNP一470(30mg/ kg);?x组(40mg/kg);?TNP一470(30mg/kg)+ CTX(40mg/kg).用药均为等量液体注射,TNP一470 与3%的乙醇为左侧腹部皮下注射,CIX与生理盐水 为左侧腹腔注射.肿瘤移植4d后开始给药,隔日1 次,共7次.用药期间每2d测量小鼠皮下肿瘤.肿 瘤接种24d后处死全部小鼠,剥离皮下移植瘤,称瘤 重,然后浸入10%的中性甲醛溶液固定,石蜡包理, 组织切片(4/an),进行免疫组化染色及凋亡检测.按 下列公式计算肿瘤体积和抑瘤率[]:V=a×b2/2,V 代表肿瘤体积,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径.抑瘤率 = 1一[ET/EC](Ec:对照组肿瘤体积或瘤重,ET:用 药组肿瘤体积或瘤重) 1.5皮下移植瘤内微血管MVD,bFGF,PCNA表达 采用免疫组化sP法检测,肿瘤细胞凋亡用TUNEL原 位凋亡法检测,方法步骤按试剂盒进行. bFGF的判定,高倍镜下计数100个细胞,肿瘤细 胞浆中呈棕黄色阳性细胞<5%为阴性,?5%阳性. 采用GermanKonTKONIBSA2.5全自动图像分析系测 定肿瘤组织中bFGF的平均灰度和象素面积,按公式 换算成阳性单位(PU),以PU值定量bFGF表达. MVD的判定标准,凡与临近的肿瘤细胞,微血管或结 缔组织分开的,呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞 串计为一个血管,但肌层较厚或管腔面积大于8个红 细胞直径的血管不计数.MVD计数参考Weidner 等[3]的方法.PCNA及凋亡计数,任取一张切片,以细 胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,选择阳性细胞密 集区域,排除坏死区,计数10个高倍视野中阳性细胞 数及细胞总数,计数增殖指数SPF和凋亡指数AK. 根据q值来判断联合用药疗效,若小于0.85为 拮抗;O.85,1.15为相加;大于1.15为协同.. q值= (EA,EB,EA+B分别表示TNP一470组,CTX组 及联合用药组抑瘤率) 1.6统计学处理所有数据采用均数土标准差(贾 ?S)表示,采用组间,检验,数据分析采用SPSS10.0 统计软件完成. 2结果 2.1小鼠皮下移植瘤生长情况接种后,各组皮下 移植瘤的体积逐渐增大,肿瘤接种后的第1,4d,移 植瘤生长基本相同,l8—24d,对照组移植瘤生长明 显快于其它3组,TNP+CTX组肿瘤生长最慢(表1). 表1各组小鼠皮下肿瘤生长情况(元?s.nm3) 湘南学院(医学版)2008年12月第10卷第4期 2.2各组小鼠皮下肿瘤抑制效果TNP一470组, CTx组与联合用药组皮下瘤重均明显小于对照组,均 具有差异显着性.溶剂组抑瘤率为6.3%,与对照组 比较差异无显着性(P>0.05),因此本研究中TNP一 470组,CTX组,TNP+CTX组的观察结果及抑瘤率结 果均与对照组进行比较.11NP一470组抑瘤率为31. 4%,CTX组抑瘤率为46.3%,TNP+CTX组抑瘤率明 显上升,达81.5%,计算q=1.21>1.15,说明两者联 合应用具有协同作用.见表2. 表2各组小鼠皮下移植瘤重量及抑瘤率的比较 2.3各组肿瘤组织bFGF,MVD的表达血管内皮细 胞生长因子bFGF主要表达于肿瘤细胞的胞浆中,呈 棕黄色,见图1.CTX组,TNP一470组,联合用药组与 对照组比较,bFGF表达减少,有差异显着性.所有肿 瘤组织内MVD均阳性表达,内皮细胞被染成棕黄色, 微血管的大小形态差异较大,有的仅为单个内皮细胞 或内皮细胞簇,有的细胞不明显或形态不规则,见图 2.联合用药组与其它3组相比,MVD显着减小;TNP 一 470组与CTX组,对照组比较,MVD也显着减小. 图1肿瘤内MVD的表达 (sP法染色,×100) 3讨论 图2肿瘤内bFGF的表达 (sP法染色,×400) 肿瘤的生长与肿瘤新生血管的形成密切相关,新 生血管在为肿瘤细胞增殖提供营养同时,也促发原发 肿瘤的播散.虽然抑制肿瘤血管生成是当前生物治 疗肿瘤有效方法,但单凭这种治疗方法不可能治愈肿 瘤.如何将抗血管生成治疗同其它治疗方法有机结 合起来,进行多靶位攻击,以提高肿瘤治疗的疗效,已 成为目前研究的热点.TNP一470是一种烟曲霉素人 工合成物,通过抑制内皮细胞增殖,迁移而抑制新生 这些结果显示,TNP一470能明显抑制肿瘤血管生成, 而CTX对小鼠皮下肿瘤内微血管无明显影响,见表 3. 表3各组皮下肿瘤内bFGF,MVD的表达 注:与对照组比较,P<0.05;与CTX组比较,P<0.05 2.4各组肿瘤内增殖PCNA表达与凋亡检测PCNA 核增殖抗原表达于细胞核内而呈棕黄色,见图3.对 照组绝大多数细胞核染成棕黄色,PCNA增殖指数为 83.8?3.95,联合用药组PCNA增殖指数为55.7?4. 32,较TNP一470组(78.8?4.08)或CTX组(65.8?5. 06)明显减小.镜下凋亡细胞核亦呈棕黄色染色,未 凋亡的细胞核呈蓝绿色,见图4.TNP一470组,CTX 组,联合用药组凋亡率较对照组明显增高,见表4. 表4各组肿瘤组织内PCNA增值指数SPF 与凋亡指数AK的检测(%) 注:与对照组比较,P<0.05 图3肿瘤内PCNA的表达图4肿瘤内凋亡的细胞 (sP法染色,×400)(TUNEL法染色,X4oo1 血管形成_4j.实验表明,TNP一470抑制肿瘤的生长 主要是通过抑制肿瘤血管形成作用来实现的l_5j. CTX是一种常用化疗药物,它的作用机理主要是和 DNA双链交叉联结,抑制DNA复制,使部分DNA断 裂,而杀伤或杀死肿瘤细胞.本实验结果显示,与 TNP一470或CTX单独治疗组相比,联合用药组移植 瘤的生长速度明显减慢,最后的重量和体积明显减 少,计算q值为1.21,提示二者联合应用有协同作用. 免疫组化结果表明,CTX及TNP一470都能降低bFGF l2JoumalofXiangnanUniversity(MedicalSciences)Dec.2008Vo1.10No.4 分泌,与对照相比具有异差显着性,但CTX组肿瘤组 织内MVD未见明显减小,而TNP一470组MVD表达 明显减小,这说明TNP一470可能从多个环节抑制肿 瘤血管的生成,如抑制肿瘤内皮细胞的增殖与迁移, 抑制血管内皮细胞其他生长因子如VEGF等-5J.CIX 则单从杀伤杀死肿瘤细胞减小了bFGF分泌,而MVD 未见明显减小,这说明肿瘤血管的生成是一个多因素 多环节复杂过程,单方面因素抑制并不能完全抑制血 管生成.另外CTX降低了PCNA表达,从而抑制肿瘤 增殖,相反TNP一470未能明显抑制PCNA表达而抑 制肿瘤细胞增殖.用原位凋亡检测法(TUNEL法)检 测皮下肿瘤细胞凋亡率,同对照组比,TNP一470,CTX 都能提高肿瘤细胞的调亡率,联合用药组则明显提高 肿瘤的凋亡率,凋亡率为38.25%,同对照组相比具有 差异显着性.这就提示TNP一470抗肿瘤,主要是通 过抑制肿瘤血管生成及提高肿瘤细胞的凋亡率来实 (上接第8页) 现的,而CTX则是靠杀伤杀死肿瘤细胞,降低肿瘤细 胞的增殖率来发挥抗肿瘤效应的,因而两者合用能明 显抑制肿瘤的生长,且具有协同性. 参考文献: [1]FolkmanJ.Tumorangiogenesis:therapeaticimplications[J].N EIlgJMed,1971,285(20):1182—1186 [2]OkeillyMS,BochmT,ShinsY,eta1.Endostalinai1trdogenons inhibitorofangiogenesisandtunlorgrowth【JJ.Cell,1997,88 285 (2):277— [3jWeidnerN.Tumorangiogenesis:Reviewofcurrentapplicationin ~lnlorprognosis[J].SeminDiagnpathol,2006,10(4):302—313 [4]S,TsutsumiM,KonishiY,eta1.Theroleofangiogenesis intumorgrowthofsyrianham~erpancreaticcancercelllineHPD — NR[J].Gastroenterology,20O4,108:1526—1533 [5]KatoT,SatoK,Y-=~namaH,eta1.Enhancedsuppressionaftu. motgrowthbycombinationofangiogenesisinhibitorTNP一470 andcytotoxicagentsinmice[J].CancerRes,2OO5,54:5143 )),,,)) 参考文献: [1]PeelingJ,YanHJ,ChenSC,eta1.Prool~tiveeffectoffreetad.i, ca1inhibitominintracerhageinrar【J].BrainRes,1998,795:63 — 70 [2]全国第四届脑血管学术会议.各类脑血管疾病诊断要点及 临床功能缺损程度评分标准(1995)[J].中华神经科杂志, 1996,29(6):379—383 [3]任泽光,吴建中,尹可.高血压脑出血后脑出血流及自由 基变化规律及其与脑水肿的关系[J].中华神经外科杂志, 1995,11:209—210 [4]DorschNW.Hemorrhazicstroke,Intracere—bralandsubarach— noidheamorrhage[J].AustFamPhysician,1997,26:1145一 l15o [5]LeeKR,ColonGP,BetzAL,eta1.Edemafromintracerebralhem— orrhag~:theroteofthrombin[J].JNeurosurg,1996,84:91—96 [6]CastilloJ,DavalosA,Alvarez—SabinJ,eta1.Molecularsignatures ofbraininjuryafterintracerebralhemorrhage[J].Neurology, 2002,58:624—629 [7]AbilleiraS,MontanerJ,MontaneerJ,eta1.Matrtixmetallopro— teinase一9concentrationafterspontaneousintracerebralhemor- \,\,s\, rhage[J].JNeurosurg,2003,99:65—70 [8]MaIsu0YYAharaIkedaM.era1.Roleof他咖phil8inradical productionduringiachemiaandrepe~filsion0ftheratbraineffect ofneurophildepletiononextracellularascorbylradicalfornla~on [J].JCeredBloodFlowMetab,1995,15:941—947 [9]HalliwellB.Reactiveoxygenspeciesandthecentralnervoustys— tern[J].JNeurochem,1992,59:1609—1623 [10]MarizD,BeerM,BetzAL.Dimethyhhioureareducesischermic brainedemawithouteffectingcerebralbloodflow[J].JComb 357 BloodFlowMetab,1990,10:352— 【11]ChenPH,Sch~yJW,fishmanRA,eta1.Braininjuryedema, andvascularpermeabilitychangesinducedbyoxgenderivedfree rad~ts[JJ.Neurology,1984,34:315—320 [12]刘庆新,张苏明.急性脑出血继发缺血半暗带的研究进展 [J].国外医学脑血管疾病分册,2002,10:191—194 [13]WatanabeT,M.Effectsofanantistrokeagen:MCI一186 oncerbralarachidonateca~~te[J].JPharmacolExpTiler, 1994.271:1624—1629 [14]吕卫红.盐酸甲氯芬酯的药理作用和临床应用[J].西北 药学杂志,2004,1:45—47