注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2表达的影响

注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2达的影响 注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再 灌注损伤后环氧合酶2表达的影响 中{回扁复区学骠磊2()10年.笫25卷,笫8瑚 注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血 再灌注损伤后环氧合酶2表达的影响 林霞刘宁,谷有全陈江君z蒋珍秀 ? 基础研究. 摘要 目的:研究注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX一2)表达的影响. 方法:健康雄性SD大鼠132只,随机分为假手术组,模型组,治疗组,后两组再分为再灌注6h,24h,48h,3d,5d亚组, 每亚组12只大鼠.应用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,造模成功治疗组即刻腹腔注射七叶 皂苷钠5mg/kg/d,其余各组均腹腔注射等量生理盐水.各组大鼠于不同时间点分别评定神经功能缺损评分,免疫组织 化学法脑组织COX一2的表达,TFC染色测定脑梗死体积 结果:注射用七叶皂苷钠能显着减少脑组织COX一2的表达,改善神经缺损症状,与各时问点模型组比较.氏0.05 结论:注射用七叶皂苷钠对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用, 其作用机制可能与减少脑组织COX一2的表达 有关. 关键词注射用七叶皂苷钠;SD大鼠;恼缺血再灌注损伤:环氧合酶2 中图分类号:R743,R493,R285文献标识码:A文章编 号:1001—1242(2010)一08—0729—04 Effectofaescinateontheexpressionofcyclooxygenase一 2inratswithfocalcerebralischemiareperfusion injury/LINXia,LIUNing,GUYouquan,etaU/ChineseJournalofRehabilitationMedicine,2010,25(8): 729—732 Abstract Objective:TostudytheeffectofaescinateOntheexpressionofcyclcooxygenase一2(COX一2)inratswithfocal cerebralischemiareperfusioninjury. Method:Onehundredandthirty-twohealthymaleSprague—Dawleyratswe rerandomlydividedintoshamoperated group,modelgroupandtreatmentgroup.Thelattertwogroupswereseparatelysubdividedintoreperfusion subgroupsatthe6thh,24thh,48thh,3rddand5thd.Therewere12ratsineachsubgroup.Ratswere selectedtoestablishfocalcerebralischemiareperfusionmodelbymiddlecere bralarterythreadembolismmethod. Aftersuccessfulmodeling,thetreatmentgroupwasappliedinstantlywithintraperitonealinjectionwithaescinate 5mg/kg/d,whiletherestgroupsweregivenwithintraperitonealinjectionwithequalvolumeofsaline.The neurologicaldeficitscoresofratsineachgroupwererespectivelyconductedatdifferenttimepoints.TheCOX一2 expressioninbraintissuewasdetectedbyimmunohistochemistrymethodandtheinfarctsizesweremeasuredwith TTCstaining. Result:AeseinatecouldsignificantlyreducetheexpressionofCOX-2incerebraltissueandimproveneurological symptomscomparingwithmodelgroupatdifferenttimepoints(P<0.05). Conclusion:Aescinateplayedaprotectiveroleonfocalcerebralischemiareperfusioninjuryandthemechanism mightberelatedtothereductionofCOX-2expression. AuthorSaddressTheFirstClinicalMedicalCollegeofLanzhouUniversity,Gansu,730000 Keywordsaescinate;SDrats;cerebralischemiareperfusioninjury;cyelooxygenase一2 DOI10.3969j.issn.1001—1242.2010.08.003 1兰州大学第一临床医学院,730000;2兰州大学第一医院神经内科;3 通讯作者 作者简介:林霞,女,硕士研究生,医师;收稿日期:2009—07,01 WWW.rehi.tom.cn729 ChineseJournalofRehd~ilitationMedicine.Aug20l0.VIA.25,No.8 七叶皂苷钠是从七叶树植物天师栗(Aesculus WilsoniiRehd)干燥成熟果实婆罗子中提取的一种 纯天然植物药.主要作用为消肿,恢复毛细血管正常 通透性,控制炎症和改善循环等.本实验观察注射用 七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后环氧 合酶2(cyclooxygenase一2,COX一2)表达的影响,进一 步探讨其可能的作用机制. 1与方法 1,1材料 ?试剂:注射用七叶皂苷钠(山东绿叶制药公 司,批号200806062国药准字H20023113):COX一2 免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司);多聚甲醛; 水合氯醛:红四氮唑.?动物:成年健康雄性SD大 鼠132只,体重220--250g,清洁级,购自甘肃省中 医学院实验动物中心. 1.2方法 132只大鼠按随机数字表法分为假手术组12 只,缺血再灌注模型组60只,缺血再灌注治疗组60 只,后两组再分为脑缺血2h再灌注6h,24h,48h, 3d,5d组,每组12只.缺血再灌注治疗组脑缺血2h 再灌注即刻腹腔注射七叶皂苷钠5mg/kg/次.之后注 射频率为1次/24h.假手术组,缺血再灌注模型组腹 腔注射等量生理盐水.采用Koizumi等[?--21的改良大 脑中动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血模型.假 手术组只分离颈总动脉及颈外动脉.大鼠在手术中 均用白炽灯加热,以保持体温恒定f肛温37?左右), 苏醒后出现血管栓塞的同侧Hornor征和对侧肢体 运动障碍即为模型成功,表现为左前肢不能伸展,行 走时向左侧倾倒或按逆时针方向转圈.反之则被剔 除. 1.3神经功能缺损评分 参考Ixmga等_3l的6级评分法分别在缺血2h再 灌注6h,24h,48h,3d,5d进行神经功能缺损评分.0 分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪; 2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发 行走,意识丧失;5分:死亡.评分0分和4分予以剔 除;符合评分但有蛛网膜下腔出血,术后死亡作为缺 失值,予以剔除.剔除者均在后续实验中补足. 1.4梗死灶体积的测量 730WWW.rehabi.com.cn 大鼠分别于脑缺血2h再灌注6h,24h,48h,3d, 5d,以10%水合氯醛过量麻醉后处死,迅速断头取 脑,放人冰箱冷冻至适当硬度,取其前脑从视交叉处 由额极到枕极切成2mm厚的冠状面脑片,置入2% TI’C溶液中37?避光孵育30rain.然后用4%多聚甲 醛缓冲液固定.血供正常组织经r不C染色成红色, 缺血或梗死组织为白色.6h后将T]rC染色照片扫描 并存储,用图像采集与系统测定梗死体积.计算 方法为: 梗死体积(%)=(直接梗死体积/全部脑片体积)x100%. 直接梗死体积(%)=各个脑片前后两面梗死面积均值×片 厚的总和 全部脑片体积(%)=各个脑片前后两面面积均值×片厚的 总和. 1.5免疫组化染色 将石蜡包埋标本行冠状切片,厚约3m严格 按试剂盒说明操作.光镜下COX一2在胞浆内出现棕 黄色颗粒,每张切片随机选取5个不重复高倍f× 4O0)视野,输人计算机进行图像分析,测定COX一2 表达的灰度值. 1.6统计学分析 用SPSS11.0统计软件进行数据分析,结果用 均数?标准差表示.各组间比较采用单因素方差分 析法.方差齐用Bonferroni检验,方差不齐用 TamhaneT2检验.P<0.05为差异有显着性意义. 2结果 2.1大鼠神经功能损伤观察及评分 假手术组动物无神经功能缺损表现,活动自如. 模型组,治疗组动物均出现不同程度的神经功能缺 损症状,主要表现为扎堆蜷缩,精神萎靡,活动减少, 不能完全伸展左侧前爪,行走时向右侧划圈,倾倒, 旋转等.各用药组均可不同程度减轻神经功能缺损 症状,降低神经功能评分,缺血2h再灌注后6h模型 组与治疗组神经功能缺损评分差异无显着性意义 (P>0.05),其余各时问点模型组与治疗组神经功能 评分比较均有显着性意义0.01),见表l. 2.21TrC染色结果 假手术组大鼠脑组织无梗死灶,染色后呈均匀 一 致的红色.各模型组,治疗组大鼠脑组织均显示不 中圈席复区学碧忐2010年,第25卷.第8期 表示治疗组与模型组比较P<O.O1 表2注射用七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤盾脑梗死体 积的影响(n=6,虹.%) ?治疗组与模型组比较P<O.O1 同范围的苍白色梗死灶.缺血2h再灌注后6h模型 组与治疗组梗死体积差异无显着性意义(P>O.051, 其余各时间点模型组与治疗组梗死体积比较有显着 性意义(尸?0.O1),见表2. 2.3注射用七叶皂苷钠对各组大鼠脑组织COX一2 表达的影响 免疫组化结果显示.假手术组大鼠COX一2阳 性细胞表达较少.脑缺血2h再灌注后第6小时即可 见病变侧皮质散在表达COX一2阳性细胞,神经元胞 浆着色;脑缺血2h再灌注后第24小时阳性细胞增 多,额,顶皮质及扣带回皮质神经元可见大量棕黄色 阳性细胞,部分血管内皮细胞及海马区神经元也有 表达;脑缺血2h再灌注后第48小时阳性细胞表达 至高峰;之后COX一2阳性细胞的表达逐渐下降:注 射用七叶皂苷钠干预后.各组脑组织COX一2阳性细 胞数减少,灰度值均明显高于模型组(P<O.05), COX一2的表达强弱与灰度值成反比.见表3,图l. 治疗组与模型组比较P<O.05 假手术组48h模型组 3讨论 脑缺血再灌注导致脑组织损伤,其病因学机制 涉及自由基损伤,兴奋性氨基酸毒性,神经细胞内钙 超载,高能磷酸化合物的缺乏,血脑屏障破坏,白细 胞的作用[41及神经细胞凋亡等多种分子生物学机制. 48h治疗组 脑缺血激发花生四烯酸释放以及环氧合酶产物如前 列腺素,血栓烷素水平增高,被认为是脑缺血再灌注 损伤的重要机制之一.COX是前列腺素合成过程中 一 个重要限速酶,有COX一1,COX一2和COX一3三种 同工酶.COX一2是花生四烯酸代谢的限速酶.后者 WWW.rehabi.com.cn731 ChineseJournalofRehabilitationMedicine,Aug.2010,Vo1.25,No.8 产生的前列腺素及血栓素是脑缺血后炎症级联反应 的重要介质.COX一2可通过加重氧化应激损伤;增 强兴奋性氨基酸的毒性作用;增加细胞内钙超载[51; 降解细胞外基质导致细胞凋亡等多种途径加重脑缺 血再灌注损伤I61.姚小梅等研究表明脑缺血再灌注 后cox一2阳性神经元分布多位于梗死边缘,提示 cox一2表达对缺血半暗带神经元的生存和死亡起 重要作用.EduardoCandelario—Jalilt】等研究表明,应 用COX一2抑制剂尼美舒利2h后即可起到改善神经 功能的作用,随着剂量的增大,可显着减少大鼠永久 性大脑中动脉梗死体积,其作用强弱呈现剂量依赖 性.由于COX一2是即早基因,在生理状态下以极低 拷贝数表达,只有当细胞受炎症信号,生长因子等刺 激后表达才增加.因此认为,脑缺血后COX一2的大 量产生可能是损伤加剧的重要因素.张秋玲等[91研究 表明雌激素能增强脑细胞对缺血再灌注损伤的耐受 性,故实验全部选用雄性大鼠,避免了性激素对实验 结果的影响.实验结果显示.大鼠局灶性脑缺血再灌 注损伤后COX一2的表达多位于梗死边缘及额,顶, 扣带回皮质和海马区,而在梗死中心,病变对侧及假 手术组脑组织COX一2表达较少.此结果与刘豪等【.01 的结果相似.大鼠局灶性脑缺血再灌注后第6小时 COX一2表达开始增高,第48小时达高峰.然后开始 降低,第5天时降至较低水平,但仍高于正常.注射 用七叶皂苷钠干预后治疗组各时间点脑组织COX一 2的表达均较模型组减少(P<O.05).其可降低大鼠 神经功能缺损评分,减少脑梗死体积.表明注射用七 叶皂苷钠能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤.与 缺血再灌注模型组比较有显着性意义(P<0.05). 4结论 注射用七叶皂苷钠对局灶性脑缺血再灌注损伤 732Ht,.rehabi.com.cn 具有保护作用.其机制可能与降低脑组织COX一2的 表达,减少毒性代谢产物的产生有关. 参考文献 [1】KoizumiJ,YoshidaY,NakazawaT’eta1.Experimentalstudies ofischemicbrainedema.hanewexperimentalmodelof cerebralembolisminratsinwhichrecireulationcanbe introducedintheischemicarea[J].JpnJStroke,1986,8:1—8. 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