超声介导微泡空化增加鼠肺内皮细胞基因转染及其（可编辑）

超声介导微泡空化增加鼠肺内皮细胞基因转染及其（可编辑） 20 1 0;30 11 南方医 科大 学学报 J S ou th M ed Un iv 窑 25 05 窑 超声介导微泡空化增加鼠肺内皮细胞基因转染 及 其作用机制 1 2 1 1 1 2 周忠 江 袁 叶海 燕 袁 崔 凯 袁 王玉 筵 渊 南方 医科 大 学南 方医 院心 内科 袁 广 东 广 州 510 515 曰 广 东省 人民 医院 妇 产科 袁 广东 广 州 51 008 0 冤 摘要 院 目的 初 步探 讨超 声 介导 声学 微 泡 野 空 化 效应 冶 对鼠 肺 微血 管内 皮 细胞 基因 转 染的 影 响及 其作 用 机制 遥 方法 6 孔 板培养 鼠肺 微血管 内皮 细胞 袁 加 20 滋 g 基 因 质粒 EGF P 及 1 0% 白蛋白微泡 渊 全氟 显 冤 袁 连 续波 超 声照 射 进行 微泡 野 空 化 冶袁 观察 不 同照 射时 间 相同 机 械指 数 渊 MI 1.0 冤渊 A 组 院 30 s 曰 B 组 院 60 s 曰 C 组 院 90 s 曰 D 组 院 1 20 s 曰 E 组 院 180 s 冤 及 不 同 MI 相 同照射 时间 渊 60 s 冤渊 B 组 院 M I 0 .5 曰 B 组 院 M I 0 .75 曰 B 组 院 MI 1.0 曰 B 组 院 MI 1.5 曰 B 组 院 MI 1.8 冤 报告 基因转 染情 况 遥 以激光 共 1 2 3 4 5 聚焦观 察细 胞膜膜 流动 性 尧 免疫荧光观察细胞微管蛋白 及微丝 蛋白 遥 结果 反应细 胞 膜流动 性的 荧光 恢复 强 度分 别 为 A 组 01 73 依 00 13 尧 B 组 0.25 0 依 0.03 7 尧 C 组 0.364 依 0.022 尧 D 组 0.3 81 依 0.0 19 尧 E 组 03 95 依 00 09 渊 与 A 组相 比 袁 P 0.01 冤曰 B 组 1 0. 1 71 依 00 17 尧 B 组 0255 依 0. 0 26 尧 B 组 0378 依 0. 007 尧 B 组 0382 依 000 9 尧 B 组 03 97 依 00 08 渊 与 B 组 相 比 袁 P 0. 01 冤遥 反 2 3 4 5 1 应细 胞微 管 蛋白 变化 的 荧 光 强 度 分 别 为 A 组 159.15 依 4.79 尧 B 组 188.23 依 6 .20 尧 C 组 20 5 .80 依 44 8 尧 D 组 2 08.99 依 8.3 4 尧 E 组 2 13.70 依 5.09 渊 与 A 组相 比 袁 P 0.01 冤曰 B 组 17 68 4 依 3.10 尧 B 组 1 87.57 依 14.52 尧 B 组 206.41 依 1 1.66 尧 B 组 2 20 .12 依 13 .3 9 尧 B 组 1 2 3 4 5 2 21.16 依 12.78 渊 与 B 组相 比 袁 P 0.01 冤曰 各组微 丝蛋 白结构完 整 袁 无 断 裂及 紊乱 袁 荧 光强 度差 别 无统 计学 差 异 遥 结 论 超声 1 介导 微泡 空 化能 增加 基 因转 染率 袁 对 细胞 骨 架无 明显 损 伤 曰 当 MI 为 1.0 时 袁 随 照时 延 长细 胞 膜 流 动 性 及 细 胞 骨 架 微 管 蛋白 荧光 强 度增 强 曰 当 照 射时 间 为 60 s 袁 随 MI 增高 细胞 膜 流动 性及 细 胞骨 架 微管 蛋白 荧 光增 强 袁 但 两 种条 件 下均 存 在 一定阈 值 曰 微丝蛋白荧光强度不随超声照射模式而改变 遥 关键词 院 超声照 射 曰 微泡 空化 曰 基因转 染 曰 细胞 骨架 曰 细 胞膜 流动 性 中图分 类号 院 R3 29 ; Q7 8 文 献标志 码 院 A 文章 编号 院 1 673-42 54 2 01 0 11 - 2 505-04 Ult r as ou nd - med iated mi c robu bb le cavit ation en hances gen e tran sduc t ion in r at pu lmon ary end otheli al ce lls parti a l ly b y affe c t in g memb rane f lui dit y an d cyt o s k eleton s tru c t ure 1 2 1 2 Z HO U Z hong -j i a ng , YE H ai-y a n , CU I Kai , W AN G Yu-y a n 1 2 Depart me nt of Car diolo gy , Na nf an g H ospit a l , S outhern Medi cal U niv ers it y , Guang z hou 510515, Ch ina; De partm en t o f Obst e t ri c s a nd Gy n ecolog y , Guang dong Pro v i n cia l Ho s pital of P eople , Gu an g z hou 5100 80 , Chin a A b s tr ac t : O bje ctive T o evalu ate the e ff e ct of the rapeuti c u l tr a soun d-ind uc e d micro bu b ble 's ca v it atio n on pla s mid g en e tr a nsdu ction i n rat pu lm on a ry endoth elial cel ls in re lati on to t h e c ha n g es of me mb r a ne f luidit y and c y tos k eleto n s tr uct ureMe tho d s Rat e nd o thelia l cel ls cul tured in v itro we r e tr an s f ec te d wit h EGF P p lasm id in the prese nce of prote in mic robubb l e sD uring the tr a nsf e ction process , the c ells we re e xp o s ed to conti nuous 2 MHz u lt r a s on ic ir r a dia t io n f or 30, 60, 90, 12 0 and 1 80 s g r o ups A , B , C, D and E, re s pe c ti vel y wit h t h e const ant me ch a nic al in de x MI of 1 .0 , or for 60 s w i th d i f fere nt m echa n ica l in dex MI of 0 .5 , 0 .75 , 1 .0 , 1 .5 , and 1. 8 g rou ps B , B , B , B an d B , res pecti v ely The c hang es o f endoth elial c y tos k eletal 1 2 3 4 5 s tr uct ure a nd me mbra ne fl uid ity we re evalu ated by imm un o fl uor escence s ta i n ing a ft er the exposu r eResu lt s E GF P g e ne tr a nsdu ction incre ase o bvi ous l y wit h p r o lon ged e ch o ir r a dia t io n and incre ased M I. The inten s ity o f immun of l u ore scence s ta ining , w hich r e pre sente d endoth elial me mbra ne f luidit y , was 0 .17 3 依 0 .01 3 , 0 .2 50 依 0 .0 37, 0 .36 4 依 0 .02 2, 0 .38 1 依 0.0 19, a nd 0 .3 95 依 0 .00 9 in gro up s A-E , as co m pared wit h 0 .171 依 0 .0 17, 0 .25 5 依 0 .026, 0 .3 78 依 0 .00 7 , 0 .38 2 依 0.0 09 a nd 0 .39 7 依 0 .00 8 in g r o ups B -B , r e s pecti v elyT he recov ery in tensi ty o f th e im munofl u oresc en c e stai ning re prese nting the c hang es in mic rotub ulin o f the 1 5 c y tos k eleto n s t ru cture w as 1 59. 15 依 4 .79 , 188. 23 依 6 .20 , 20 5 .8 0 依 4 .4 8 , 2 08. 99 依 8 .34 , and 2 13. 70 依 5 .0 9 in g r o ups A-E , a nd wa s 1 76. 8 4 依 3 .10 , 1 87. 57 依 14. 52, 20 6 .4 1 依 11. 6 6, 220. 12 依 1 3.3 9 and 221. 16 依 12. 7 8 in g rou ps B1-B5 , res p ec ti v elyTh e endo thelia l m embr ane f luidit y and microtu bu le f l u oresc ence rec overy inten s ity inc rea sed rema rkabl y c ompare d w it h th e b aselin e P 0 .01 w it hin t h e MI ra nge of 0 .5 0-1 .0 an d the e xp o s ure t im e of 3 0-9 0 s , b ut unde r w ent n o fu rt he r chang es in res pons e to p rolon g ed e xpos ure ti me 180 s a t the M I o f 1 .5 P 0 .0 5N o c ha n g es in m icrofi la ment fl uor escenc e inte nsi ty we r e obs erv ed afte r e xpos ure to diff erent MI or ir radia ti on ti meConc lu s io n Th e rap eu ti c ultr asound-m ed ia ted a lbu min m i c robubb le cav itat ion a ll ows enhances p lasm id g ene tr an s d uc ti o n wit hout c au s ing cyt osk eleto n d amag es. I ncrease d e nd o thelia l me mbra ne fl uidity a nd c ha n g es in c y tos kel eton s tr uct ure , especia lly mic rotub ulin , par t ia ll y c on tr ibu te to th is enhanceme nt. K ey w ords: ultr aso un d ; m icrob ub b le; cyt o skele t o n; me mbra ne fl u i d it y ; m icrotu bu li n ; mic rof il am ent 基 因治 疗 的瓶 颈 之一 是 基因 转 移效 率 较低 袁 超声 但 作用 机 制有 待 阐明 遥 有 研究 认 为 野 空化效应 冶 作用 于 咱 1 - 3 暂 介 导 微 泡 野 空 化 冶 转 基 因 的 有 效 性 研 究 不 胜 枚 举 袁 细 胞膜 袁 产生 野 外 溢孔 冶 袁 使细 胞 膜通 透 性增 加 袁 从而 促 咱 4 -6 暂 进基 因 垮膜 转染 遥 本实 验以 临床 诊断 性超 声介 导 收稿日 期 院 20 1 0-06-1 9 基金项 目 院 广 东省自然 科学 基金 渊 05 3 00929 冤 微 泡空 化 进行 基 因转 染 袁 并观 察 超声 能 量及 照射 模式 作 者 简 介 院 周 忠 江 渊 1968- 冤袁 男 袁 副 主 任 医 师 袁 电 话 院 0 20-62 78 7 389 袁 对细 胞膜 流 动性 及细 胞 骨 架 的影 响 袁 初 步 探 讨 野 空 化 E-mail : z z j2001911 @126c om南 方医科 大学 学报 J S outh Med U niv 第 30 卷 窑 250 6 窑 效应 冶 促基 因 转染 分 子机 制 遥 并 采集 荧 光图 像 袁 计数细胞 尧 荧 光强 度 分析 遥 1 .7 实验分组 1 和方法 转基 因系 统 院 渊 1 冤 超 声 + 质粒 组 曰 渊 2 冤 微 泡 + 质 粒 1.1 报 告质 粒 EG F P 制备 组 曰 渊 3 冤 超声 + 微泡 + 质粒 组 渊 每组 重复 6 孔 袁 超 声 参 复 苏 大 肠 杆 菌 D H 5 琢 袁 摇 菌 扩 增 袁 氯 化 钙 法 将 数 院 MI 院 1.0 袁 时 间 院 60 s 袁 连 续 波 袁 f :2 M H z 袁 深 度 60 EG F P 转 化 细 菌 袁 筛 选 阳 性 克 隆 尧 扩 增 尧 转 化 袁 试 剂 盒 m m 冤遥 在 系统 渊 3 冤 基础 上 再行 分 组 院渊 1 冤 按照 射 时间 分 法 渊 Q I A G N 袁 德国 冤 提取质粒 渊 1 m g /m l 冤 遥 组 院 A 组 渊 30 s 冤尧 B 组 渊 60 s 冤尧 C 组 渊 90 s 冤尧 D 组 渊 1 20 s 冤尧 1.2 内 皮细 胞 培养 E 组 渊 180 s 冤袁 M I 均 为 1 .0 曰 渊 2 冤 按 M I 分 组 院 B 1 组 S D 大 鼠 肺 组 织 修 剪 后 接 种 于 10% F B S 渊 P A A 袁 渊 0.5 冤尧 B 2 组 渊 0.75 冤尧 B 3 渊 1.0 冤尧 B 4 组 渊 1 .2 冤尧 B 5 组 美 国 冤 RP MI 1 640 培 养 基 袁 差 速 生 长 去 除 S M C 袁 使 内 渊 1.8 冤袁 照 射时 间 均为 6 0 s 遥 皮 细胞 纯度 达 95% 袁 传 代至 3 代 时 取 对 数 生 长 期细 1 .8 统计学处理 胞胰 酶 消化 袁 传入 6 孔板 以及激光共聚焦显微镜专 用 应用 S P S S 1 1.5 统计分析 袁 计 量资 料 用均 数 依 5 培 养 皿 中 渊 1 .5 伊 10 / 孔 冤袁 每 孔 加 入 2 m l 完 全 培 养 基 袁 差 表示 袁 完全 随 机设 计 的多 样本均数比较运用 方差 分 细胞 融 合达 60%~ 70% 时用于实验 遥 析 袁 组 间 比 较 采 用 q 检 验 袁 P 0.05 表 示 有 统 计 学 差 1.3 微 泡与 质 粒 EG F P 孵育及微泡空化 异 遥 取 全氟 显冻 干 粉 渊 全氟 丙 烷 人 白 蛋 白 微 泡 袁 南方 医科 大学 药 学部 冤 1 支 袁 3 m l N S 溶解 袁 去上 层浊 液 袁 加 2 结果 入 质 粒 EG F P 袁 4 益 孵 育 2 h 遥 培 养 板 中 每 孔 换 入 1 .8 2 .1 微泡空化对基因转染的影响 m l 1% F BS 的 R P M I 164 0 及 200 滋 l 微 泡质 粒混 合液 图 1 示鼠 肺 铺路 石 样内 皮 细胞 渊 低 倍 冤袁 图 2 分别 9 渊 微 泡 浓 度 10 % 袁 细 胞 数 1 .2 伊 10 /m l 袁 质 粒 20 滋 g 冤袁 孵 示 3 组 G F P 基 因转 染情 况 遥 表 1 示单 纯 超声 照射 无 育 3 h 后按 图 1 行超 声介 导基 因转 染 渊 A cu son 袁 美 国 袁 荧光 细胞 袁 超 声 + 质 粒见 少 许荧 光细 胞 袁 超 声 + 质 粒 探 头距 6 孔 板 3 m m 冤 遥 24~ 48 h 后 荧 光 显 微 镜 观察 袁 + 微泡 组荧 光 细胞 明显 增加 袁 提示 基 因转 染增 强 遥 表 每 孔取 5 个 高倍 视野 计数 袁 计 算 转 染 率 渊 荧 光 细 胞数 2 示 在 各 M I 条 件 下 均 见 荧 光 细 胞 袁 但 以 M I 为 目 / 细胞总数 伊 100 % 冤遥 1 .5~1 .8 时转 染率 最高 曰 照 射时 间为 60~ 90s 转染 率 明 1.4 细 胞膜 流 动性 测 定 显 增加 袁 但延 长 照射 时 间转 染率增加无统计学差异 遥 共 聚焦 专 用 培 养 皿 中 的细 胞 经 照 射 后 袁 每 皿 加 10 滋 g /m l N B D -C6 - H P C 渊 Mo le cu l e P r obe 袁 美 国 冤 孵 育 20 m in 袁 行 激光 共 聚焦 测 遥 选生长良好 袁 荧光强度适中 且 与 周 围 有 逸 3 个 相 邻 细 胞 者 为 淬 灭 对 象 遥 以 F rap 程序 确 定线 扫 描的 起 始点 尧 终点 和光漂白点 遥 漂白 激 光功 率 32 m W 袁 漂白时间 5 0 m s 袁 总 扫描 时 间 200 m s 遥 计算 荧光 恢 复指 数 渊 I 冤 I m /I b 渊 I m 为 第 200 m s 的荧 光 图 1 鼠肺内 皮 细胞 渊伊 4 0 冤 恢 复强 度 袁 I b 为 被淬 灭的 荧 光 强度 冤袁 间 接 反 映 细胞 膜流 动 性的 变 化 遥 1.5 微 泡空 化 对细 胞 微管 蛋 白荧 光 强度 的 影响 细 胞照 射 后以 4 % 多 聚甲 醛固 定 10 m in 袁 加 3.5% B S A 封闭 液温 育 1 h 袁 湿盒 内 1 颐 2 00 一抗 渊 L a b V is io n 袁 美 国 冤 避 光 孵 育 袁 过 夜 后 1 颐 200 F I T C 标 记 二 抗 渊 KP L 袁 美国 冤 避光 孵 育 1 h 遥 P B S 漂洗后以倒置荧光显微 镜 A B 1X 71 渊 O ly m pl us 袁 日 本 冤 观 察 尧 采 集 荧 光 图 像 袁 S im pl ep cr 软件 渊 美国 冤 计数 细胞 并 进行 荧光 强度 分 析 遥 图 2 三组 GF P 基 因转染 1.6 微 泡空 化 对细 胞 微丝 蛋 白荧 光 强度 的 影响 情况 A: 超 声 + 质 粒基因 ; B: 超声 超 声照 射 后 袁 4% 多聚甲醛固定 10 m in 袁 37 益 湿盒 + 质粒 ; C: 超声 + 微泡 + 质粒 内 加 5 滋 g /m l F I TC -ph allo id in 渊 Mo le cu leP r obe 袁 美 国 冤 C 避光 染色 1 h 袁 漂 洗后 以倒 置荧 光显 微镜 1 X7 1 观察第 1 1 期 周忠江 , 等超声 介导微 泡 空化增 加鼠 肺内皮 细胞 基因转 染及 其作用 机制 窑 25 07 窑 表 1 超 声微泡 对基 因转染 的影 响 渊 n 6 , x 依 s 冤 组别 转染率 渊 % 冤 超声 + 质粒 0 微泡 + 质粒 2.3 9 依 0.8 0 # 超声 + 微泡 + 质粒 1 4.1 6 依 1.3 2 # 与 微泡 + 质粒组相 比 袁 P 0.00 表 2 不同机 械指 数与照 射 时间对 基因 转染的 影响 渊 n 6 , x依s 冤 超声条件 转染率 渊 % 冤 机械指数 图 6 荧光漂 白恢 复曲线 0 .50 3 .87 依 0 .81 0 .75 5 .41 依 1 .32 表 3 不同照 射时 间对细 胞膜 流动性 的 影响 渊 n 6 , MI : 1 .0 冤 1 .00 6 .88 依 2 .00 * 组 别 照射时 间 s 荧光 恢复指数 渊 x 依 s 冤 1 .50 11. 85 依 2 .20 * A 30 0.1 73 依 00 13 1 .80 12. 82 依 2 .20 * B 60 0.2 50 依 00 37* 照射时间 3 0 s 6 .32 依 1 .21 C 90 0.3 64 依 00 22* # 6 0 s 9 .38 依 1 .55 D 120 0.3 81 依 00 19* # 9 0 s 12 .9 3 依 1.3 8 E 180 0.3 95 依 00 09* # 1 20 s 13 .4 7 依 2.0 0 与 A 组比较 袁 * P 0. 01 # 1 80 s 13 .9 8 依 2.7 0 与 M I 0.75 组组相比 袁 * P 0.01 曰 与照射时 间 3 0 s 组相 表 4 不同机 械 指数对 细胞 膜流动 性的 影响 # 比 袁 P 0 .0 1 渊 n 6 , 照射时 间 :6 0 s 冤 组别 M I 荧光恢复指数 渊 x依s 冤 B1 0 .5 0.171 依 00 17 2.2 照 射时 间 对细 胞 膜流 动 性的 影 响 B2 0 .75 02 55 依 0.026* 图 3~ 5 示内 皮 细胞 荧 光淬 灭 及恢 复 袁 图 6 中 由下 B3 1 .0 03 78 依 0.007* 而 上 5 条 曲 线 分 别 动 态 显 示 A 尧 B 尧 C 尧 D 尧 E 荧 光 漂 白 B4 1 .5 03 82 依 0.009* 及 恢 复 情 况 袁 表 3 可 见 在 一 定 MI 渊 1.0 冤 条 件 下 袁 随 着 B5 1 .8 03 97 依 0.008* 照 射时 间延 长 袁 细胞 膜 流 动性 逐 渐 增 强 袁 但 当 延 长至 与 B1 组比较 袁 * P 0.0 1 90 s 时 袁 细 胞膜 流 动性 不再显著升高 遥 表 5 示当 M I 为 1.0 时 袁 随着 超声 照射 时间 延 长 袁 细胞 骨架 微 管蛋 白 荧 光 强 度 逐 渐 增强 袁 但 当 延 长 至 9 0 s 时 袁 微管 蛋 白荧 光 强度 不 再显 著 增加 遥 表 5 不同照 射时 间对微 管蛋 白荧光 强 度的影 响 渊 n 6 , MI 1.0 冤 3 组别 照射时间 s 微管蛋白 荧光 强度 渊 x依s 冤 4 A 30 159.15 依 4.79 B 60 1 88 .2 3 依 6.2 0* 图 3 选定 的待漂 泊区 域 C 90 2 05 .8 0 依 4.4 8* 图 4 荧光淬 灭 D 120 2 08 .9 9 依 8.3 4* 图 5 荧光恢复后 E 180 2 13 .7 0 依 5.0 9* 与 A 组比较 袁 * P 0. 01 5 2 .5 机械指数对微管蛋白荧光强度的 影响 2.3 机 械指 数 对细 胞 膜流 动 性的 影 响 图 7 分别 表示 M I 为 1.8 及 0 .5 时微 管蛋 白着 色 表 4 示 在 一 定 照 射 时 间 渊 60 s 冤 条 件 下 袁 随 超 声 情 况 袁 表 6 示 在 一 定 照 射 时 间 渊 60 s 冤 袁 微 管 蛋 白 荧 光 MI 增 加 袁 细 胞 膜 流 动 性 渐 增 高 袁 但 当 MI 增 加 至 1 .0 强度 随 M I 增加 而增 强 袁 但当 M I 增至 1 .0 时 袁 微 管 蛋 时 袁 细 胞膜 流 动性 无 显著 增高 遥 白 荧光 强 度无 显 著增 加 遥 2.4 照 射时 间 对微 管 蛋白 荧 光强 度 的影 响 2 .6 微丝蛋白窑 250 8 窑 南 方医科 大学 学报 J S outh Med U niv 第 30 卷 超声 场中 声学 微 泡 发 生 振 荡 尧 破 裂 发 生 所 谓 野 空 化效 应 冶袁 可 使细 胞周 围 温 度 升高 袁 胞 膜 流 动 性 增 加 曰 同时 微泡 破 裂作 用 于 胞 质 液 还 可 产生 剪 切 应 力 使 细 咱 7 - 8 暂 胞膜 断裂 袁 形 成 野 外溢 孔 冶 袁 均 可使 细胞 膜及 细胞 骨 架 发生 结 构和 功 能改 变 袁 继而导致离子通道活化 尧 细 胞 信号 传 导和 物 质转 运 增强 遥 通 常研 究 中观 察 到的 细 A B 胞膜 的损 伤 多是 轻 微 尧 暂 时 的 袁 2~2 4 h 后 细 胞 形 态 逐 图 7 微管蛋白荧光 咱 6 , 9 暂 咱 9 暂 渐 恢复 正 常 遥 Bu t le r 等 研究发现细胞膜流动性增 A: M I 1.8; B: M I0 .5 加 促进 物 质垮 膜 转运 遥 本 研究 证 实超 声 照射 微 泡后 促 进 质粒 基 因的 内 皮转 染 袁 基因 转 染与 细 胞膜 流动 性增 表 6 不 同机械 指 数对微 管蛋 白荧光 强度 的影响 加 密切 相 关 袁 同 时未 观 察到 严重细胞损伤和细 胞膜 流 渊 n 6, 照射时 间 :6 0 s 冤 动 性降 低 袁 证实临床诊断性超 声 可介 导 质粒 基因 的靶 组别 MI 微 管蛋白 荧光 强度 渊 x 依s 冤 向 转导 遥 B1 0.5 176. 8 4 依 3 .10 B2 0.75 1 87.5 7 依 14.5 2 * 微丝 尧 微管蛋白是构成细胞骨架的基本 结 构 袁 参 B3 1.0 2 06.4 1 依 11.6 6 * 与 细胞 膜 的流 动 性改 变 及物 质 跨膜 转 运 袁 对于 维持 细 B4 1.5 2 20.1 2 依 13.3 9 * 胞 正常 功 能至 关 重要 遥 在 本实 验 所采 用 的照 射 时间 以 B5 1.8 221. 1 6 依 1 2.7 8 及 M I 范围 内 袁 观察 到超 声 联合 微泡 对细 胞膜 及细 胞 与 B1 组比 较 袁 * P 0. 01 骨架 无 明显 生物 损伤 袁 而 且在 照射 时间 为 30~ 90 s 及 M I 为 0.5~ 1.0 时 袁 细胞 膜 流动 性 与微 管 蛋白 的荧 光恢 不 管 超 声 照 射 时 间 及 超 声 照 射 能 量 M I 如 何 变 复 强度 呈 线性 正 相关 变 化 袁 说明超声联合微泡 对细 胞 化 袁 细 胞骨 架微 丝蛋 白 荧 光强 度 于 超 声 照 射 前 尧 后均 膜 野 分子打孔 冶 作 用 袁 可 能与 微 管蛋 白空间结构 和功 能 无明 显 变化 渊 图 8 冤遥 变化 直接 相关 曰 为何 当 照射 时间 超 过 90 s 以及 M I 超 过 1. 0 时 细 胞 膜 流 动 性 与 微 管 蛋 白 荧 光 恢 复 强 度 出 现 平台 现 象 钥 很可能与细胞膜流动性与微管蛋 白出 现 咱 9 -1 0 暂 功 能饱 和 有关 遥 超声 联 合微 泡 基 因 靶 向 传 输 有 许多 问 题 值 得 深 入 探索 袁 尤其 作 用机 制 的阐 明至关重要 遥 本实 验初 步 观察 了一 定 超声 能 量 及 照 射 模 式 对细 胞 流 动 性 及 细 胞 骨架 的 影响 袁 对于 继 续探 索 转基 因机制提供 初步 借 鉴 遥 本实验未观察到微丝蛋白荧光强 度变 化 情 况 袁 可 图 8 微丝蛋白荧光 能 与微 丝 蛋白 变 化较 快 或实 验 设计 缺 陷相 关 袁 今后 拟 3 讨论 优化 实验 设 计继 续 观 察 遥 结 合 临 床实 际 筛 选 出 更 高 不 适于 冠脉 介 入 尧 血管 搭 桥 尧 药 物 治 疗 效 果 欠佳 效 尧 合理 尧 安 全的 传输 能 量 模 式 以 及发 掘 高 效 靶 向 的 的终 末 期缺 血 性心 肌 病 袁 可 能寄 希 望于 促血管新生 基 转 基因 微 泡如 脂 质微 泡 尧 配体 结 合微 泡 将是 继续 研究 咱 1 1 -1 3 暂 因 治 疗 袁 实 现 自 身 野 分 子 搭 桥 冶 以 缓 解 症 状 及 改 善 预 的 热点 遥 后 遥 基因 治疗 问题 之一 在于 实现 靶基 因 渊 如 V EG F 尧 bF GF 尧 H I F 等 冤 的 转染 和表 达 遥 研 究 显 示 超 声 介 导的 参 考文 献 院 咱 1 暂 Li u Y, M iy os hi H , Na kamura M , et al. En capsu l a ted ultras ound 微 泡 野 空化 冶 效 应可 实 现 携 载基 因 的 内 皮 细 胞 靶 向转 micro bubble s: t h era peuti c a pplic ati o n i n drug / g e ne d eliv ery 咱 J 暂J 移 袁 增 加治 疗性 药 物 和 基 因的 表 达 从 而 发 挥 治 疗作 Co ntrolled R elea se, 2 006, 1141 : 8 9-99. 咱 1 - 2 暂 用 袁 但 作 用 机 制 未 完 全 阐 明 遥 细 胞 膜 为 脂 双 层 结 咱 2 暂 G eis NA , Ka t u s H A, Bek ere djian R , e t a lU l tras ound ta rge ted 构 袁 细 胞膜 流 动性 既 是反 映细胞内分子运动状态的 标 micro bubble de s truction fo r d rug a nd g ene deliv ery 咱 J 暂 Exp ert O pin 志 袁 又 是维 持 细胞 正 常功 能的重要条件 遥 细 胞膜 流动 D rug De l iv , 2008 , 5 10: 1 121-3 8. 咱 3 暂 Ren JL , Wan g Z G, Z hang Y , et al. T r an s fe ction ef ficie nc y o f T D L 性 的降 低以 及细 胞 膜 跨 膜 电位 的 改 变 是 细 胞 损 伤的 compo und i n HU V E C en h ance d b y ultras ound-ta rg eted 早期 标 志 遥 细 胞受 损 可表 现 为细 胞 膜流 动 性降 低 袁 细 micro bubble dest ruc tion 咱 J 暂Ult ras ound M ed Biol, 2 00 8 , 34 11: 胞器 代 谢及 功 能障 碍 袁 而胞 膜 流动 性 增加 往 往伴 随 物 1857 -67. 咱 3 -5 暂 质转 运 增强 遥 渊 下转 25 15 页 冤