培养基配方

培养基配方 任何与精液的生成或运输有关的器官和部位发生感染时，精液均可染菌。前列腺炎与精囊腺炎的致病菌有葡萄球菌、链球菌，大肠杆菌、类白喉杆菌J尿道炎常见致病菌有淋病双球菌，大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌l附睾炎最常见的致病菌为结核杆菌和淋病双球菌，其次为大肠杆菌，葡萄球菌((链球菌等。通过对精液进行涂片或培养检查，能及时发现上述致病菌。 (一)标本收集清洁尿道外口(包皮过长者应翻起)，用无菌等渗盐水反复冲洗，然后用按摩和手淫法将精液射入无菌瓶中。 (二)涂片检查将精液涂于载玻片上，干后通过火焰数次固定，分别作革兰氏染色及抗酸染色后镜检。 1(革兰氏染色法 【试剂】 (1)结晶紫染液:称取结晶紫4,8 g，溶于95,酒精100ml中，制成饱和液;再取饱和液20m1与lOg,L的草酸铵溶液80ml混合即成。 (2)卢戈氏碘液:先溶碘化钾2 g于lOml蒸馏水中，再加碘1g;待碘全部溶解后，加蒸馏水200ml即成。 (3)脱色剂:96,酒精或丙酮乙醇溶液(95,乙醇70ml，加丙酮30m1)均可应用。但后者较单用95,酒精好，易于掌握，反应准确。 (4)复染液:可用稀释石炭酸复红液(取萋一尼氏抗酸染色液中的石炭酸复红液lOml，加蒸馏水90ml即成)或沙黄溶液(25g,L的沙黄乙醇溶液10ml，加蒸馏水90m1)。 【操作】将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染1分钟后，流水冲洗;滴加卢戈氏碘液1分钟后水洗，再用脱色剂脱色，摇动玻片至紫色不再脱落为止;水洗;加稀释石炭酸复红液染30秒,1分钟;流水冲洗，晾干后镜检。 【结果】精液涂片中革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。 ，。 【注意事项】 新配制的染液应先用已知的革兰氏阳性和阴性菌(如金黄色葡萄球菌与大肠杆菌)作对照，以检查染液的质量。结晶紫与草酸铵溶液混合后不能保存太久;如有沉淀出现应重新配制。 2(抗酸染色法 【试剂】 (1)Ziehl氏石炭酸复红液:称取碱性复红4 g，溶于95,酒精lOOml内即成碱性复红饱和酒精溶液。取该饱和液100ml，与50g,L的石炭酸水溶液90ml混匀即成。 (2)3,盐酸酒精:取浓盐酸3ml加915,酒精97ml混匀。 (3)吕弗勒(Loeffler)氏碱性美蓝溶液:称取美蓝(亚甲蓝)2g，溶于95,酒精lOOml中制成饱和液;再取饱和液30ral加入蒸馏水100ml及lOOg,L的氢氧化钾水溶液O(1mI即成。 【操作】 用片夹夹住精液涂片，滴加ziehl氏石炭酸复红溶液，以微火加热，保持染液冒蒸汽，切勿煮沸、烧干。染液要干时随即添加，如此维持5分钟;冷却后，以流水从玻片背面冲洗掉多余的染料，滴加3,盐酸一酒精脱色，至玻片上几无红色为止;水洗后以碱性美蓝液复染1分钟;水洗，待干，油镜检查。 【结果】抗酸杆菌染成红色，非抗酸菌或细胞均染成蓝色。 【注意事项】石炭酸一复红加温染色过程中，温度不宜过高，切勿使染料沸腾和蒸发干;如急于观察结果，可将染色后标本用吸水纸平铺于玻片上，轻压吸干，但用过的吸水纸上可能沾有极少量染色的抗酸杆菌，故不宜再用于吸干第二份标本，以免发生错误诊断。 2006-12-8 16:04:00 袁渭清 等级:版主 文章:77 积分:663 门派:无门无派 注册:2006年10月16日 第 2 楼 (三)精液的细菌培养 1(常用培养基 (1)血液琼脂(血平板): 【配方一】 、 成分:普通营养琼脂90rot;脱纤维羊血(或兔血)10ml,， 制法:将已灭菌的普通营养琼脂(pH7(6>加热融化;冷却至50?左右， 以无菌手续加入lOm]脱纤维羊血(临用前置37?水浴箱预温)，轻轻摇匀(勿使有气泡)，倾注于灭菌平皿内，每一平皿(直径9 cm)13,15ml或分装试管，制成斜面;待凝固后，抽样置37?培养18,24h，观察有无细菌生长;如无菌生长，置4?备用。 【配方二】 成分:肉膏汤(pH7(8)800ml;硫酸镁(493g,L)8 ml;脱纤维羊血80ml;琼脂21,23g;5(0g,L对氨基苯甲酸8 ml。 制法:将肉膏汤置三角烧瓶内，加入硫酸镁、对氨基苯甲酸及琼脂，混 ?高压灭菌30分钾，取出冷至50?左右，以无菌合并使液体浸湿琼脂，121(3 手续加入37?水浴预温的无菌脱纤维羊血或兔血，轻轻摇匀，倾注平板，凝固后，抽样置37?培养18,24h，如无菌生长冷藏备用。 (2)巧克力色血琼脂(巧克力平板): 成分:与血琼脂配方相同。 制法:与血琼脂相同，但于培养基中加入血液混匀后，须再置85?水浴lO,15分钟，使血液的颜色由鲜红转变为巧克力色;取出并冷至50?左右，倾注平板，经无菌试验后存4?备用。 (3)麦康凯琼脂:分离肠道杆菌用。 成分:蛋白胨20g;乳糖10g;lOg,L的中性红水溶液5ml;氯化钠5 g;琼脂20一-'25g~胆盐5 g(或牛胆酸钠4 g与去氧胆酸钠l g)，加蒸馏水l 000ml。 制法:将蛋白胨、氯化钠、胆盐及乳糖加于500M蒸馏水中加热溶解;将琼脂加于余下的500ml蒸馏水中加热溶解;将上述两液趁热混合，调整pH至7(4，以绒布过滤，按每瓶l00m1分装，115(6?高压灭菌20分钟，待冷却至50,60?时，每100m1培养基中加入经煮沸灭菌的lOg,L中性红溶液O(5ml，混合后倾注平板。 注意事项:胆盐能抑制部分非病原菌及革兰氏阳性细菌的生长，但能促进某些革兰氏阴性病原菌的生长;因含有乳糖及中性红指示剂，故分解乳糖的细菌(如大肠杆菌)，菌落呈红色;不分解乳糖的细菌，菌落不呈红色。 (4)伊红美蓝琼脂(EMB):分离肠道杆菌用。 成分:肉膏汤琼脂(pH7(4)100ml;20g,L的伊红水溶液(灭菌)2 ml;乳糖l g;6 g,L的美蓝水溶液(灭菌)1 mI。 制法:加热溶化已灭菌的肉膏汤琼脂，加入乳糖l g;待冷至50?左右，加入伊红及美蓝溶液，混匀倾注平板，凝固后备用。 (5)罗氏培养基:分离结核杆菌用。 成分:磷酸二氢钾(无水)0(96g;天门冬酰胺(天门冬素)O(72g;枸橼酸镁O(12g;硫酸镁(MgSO4?7H 20)O(048g;纯甘油(中性)2(4m1;蒸馏水120m1;马铃薯粉6(Og，新鲜鸡蛋6,8个;10g,L的孔雀绿溶液8 ml。 制法:将磷酸二氢钾至纯甘油的各成份混合，置沸水中加热溶解，加入马铃薯粉，边加边搅拌，注意勿结成块，并继续在沸水浴中加热半小时，时加搅拌，待冷至65?时加入全蛋液200ral及10g,L孔雀绿溶液8 m1，充分混匀，分装于无菌试管，每管约5,6 ml，塞上橡皮塞;置血清凝固器内经90?l h，制成斜面。 (6)沙保弱氏培养基:培养真菌用。 成分:蛋白胨lOg;葡萄糖40g;琼脂20g;蒸馏水l 000ml。 制法:上述成份混合加热溶解(一般可不校正pH)，分装试管，121(3?高压灭菌15分钟，趁热制成斜面。如不加琼脂即为沙保弱氏液体培养基。 (7)葡萄糖肉汤:用于增菌。 成分:酵母浸膏3 g，构橼酸钠3 g;牛肉汤l 000m1(;247g,L硫酸镁20ml;葡萄糖3 g;磷酸氢二钾2g;5 g,L对氨基苯甲酸5ml。 制法:除葡萄糖及硫酸镁外，其他各物混和，加热溶解，校正pH至7(6，再煮沸5分钟，用滤纸过滤并分装于100ml三角烧瓶中，每瓶50m1，包扎瓶口，121(3?高压灭菌15分钟;将葡萄糖配成100g,L的水溶液，硫酸镁配成247g,L的水溶液，分别高压灭菌(葡萄糖为113?)15分钟，于每50ral、无菌肉汤内加入灭菌葡萄糖及硫酸镁水溶液各1 m1混匀，于37?培养48h。证明无菌生长后存于4?备用。 (8)解脲支原体培养基: 成分:牛肉浸液70ml;蛋白胨1(0g;NaCl O(5g;KH2PO 4O(15g;4(0 g,L酚红O(5mI。 制法:调pH至6(O，加热融化后滤纸过滤，121(3?高压灭菌，无菌加入小牛血清20ral;250g,L鲜酵母浸液10ml;青霉素20万单位;400g,L尿素(G3滤器过滤除菌)0(5ml，分装试管，每管4 ml。如倾注平板，将上述液体培养基中加入琼脂粉1(0g。 2(一般细菌培养以无菌技术将待测精液接种子血平板(或巧克力平板)、伊红美蓝平板(或麦康凯平板)。必要时也可先接种子葡萄糖肉汤增菌液内，待有菌生长后再行移种。接种后的培养基置35?温箱，在分离培养某些细菌(如淋球菌)时，尚需将已接种的培养基置5,lo,的C02环境(无CO2培养箱时，可用烛缸代替)。 2006-12-8 16:07:00 袁渭清 3(精液中常见细菌的鉴定程序 (1)淋病双球菌，将精液接种于巧克力平板35?下，5,lO,CO:环境中培养24,48h后取生长的可疑菌落涂片检查，测定对青霉素的敏感性及β一内酰胺酶的产生情况，并进一步荧光抗体试验等鉴定。 (2)肠杆菌科细菌:取伊红美蓝平板和麦康凯平板上可疑菌落作生化反应，进一步鉴定。 (3)非发酵菌;按非发酵菌生化反应鉴定。 (4)葡萄球菌及链球菌:根据涂片、染色检查结果作血浆凝固酶、O,F、杆菌肽、Optochin等试验鉴定。 (5)厌氧菌培养:按厌氧菌培养的要求收集标本，并立即送厌氧培养。 (6)结核杆菌培养:标本收集后，自行液化接种罗氏培养基，置37?培养约2个月;观察结果。如发现可疑菌落，作涂片染色确认。 (7)真菌培养:取精液接种于沙保弱氏培养基内进行培养鉴定。 (’ (8)精液的支原体培养:解脲交原体除能引起非淋菌性尿道炎外，尚可导致不育、自发流产和死胎。最近，邵海枫等<1989)对330例生育和不育男性精液标 本进行解脲支原体检测，发现不育男性解脲支原体检出率(66(1,)显著高于生育男性(23(6,)。分离培养方法为无菌滴管吸取精液O;lmI，接种子液体培养基内，每份标本接种2支。置37?烛缸内养。分别于24、48、72h观察结果;如解脲支原体生长，则水解尿素，使培养基pH升高，液体变红色即为阳性。再将此液用O(45um微孔滤膜将变红色的培养悬液过滤，滤液转种1支液体培养基，仍出现阳性反应，且液体澄清，可确定为解脲支原体。将培养悬液转种于平板培养基上，观察集落形态。{生殖就医指南网www.,,zn.cn. 是你知心的朋友}取培养悬液沉淀或集落涂片，染色后观察支原体形态。