2012overlap原理总结

l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l 简单讲，原理如下：引物1（正向）和引物2（反向）扩增产物为A；引物3（正向）和引物4（反向）扩增产物为B，现在欲将产物A和B融合为产物C。在设计引物时，先按照普通引物设计好，然后在引物2的5’端和引物3的5'端分别加上4-8个碱基（引物2所加的碱基应为产物B的5' 端4-8个碱基序列；引物3所加的碱基应为产物A的3' 端4-8个碱基序列）。第一轮PCR，先分别用引物1、引物2扩增出片段A；引物3、引物4扩增出片段B。分别割胶回收产物A和产物B，这样扩增出来的产物A和B会具有相同的末端。第二轮PCR，用引物1和引物4来扩增，用第一轮的两种扩增产物A和B混合稀释之后为，进行扩增。因为产物A和B有相同重叠的末端，在PCR反应时，模板变性、退火、延伸，就会将A和B融合成产物C。 overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。 另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。 如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。 PCR相关网站 PCR相关的专业网站一个PCR相关的专业网站，内容很全 实验方法与步骤详解 美国AXYgen公司 This 158 page PCR manual covers the following topics PCR Primer design PCR Methods PCR Polymerases PCR Variables PCR Troubleshooting Special PCR Topics Appendixes and a comprehensive Index BioGuide - PCR 魏茨曼基因组和生物信息学研究所的一个网页，介绍PCR的初步知识。 包括： What is PCR? What are some good reference books for PCR? How should I select a set of primers to use for PCR? Programs for designing PCR primers What is "Hot-start" PCR? What is AP-PCR or RAPD PCR? What is "Touchdown" PCR? Is there a simple method to sequence lambda, M13, or plasmid clones using PCR? A Look at PCR Cloning Tools PCR常见问题及回答 #2 PCR和Realtime PCR的原理讲的很透, 一个介绍Realtime PCR的教学网站，里面的powerpoint文件非常好 :85/pcr/realtime-home.htm SYBR Green PCR #638781 PCR QUICK GUIDE PCR拼接 知道蛋白如何寻找其氨基酸序列 关于DNA的flash版和文字版 # ABI Prism 7000 简要使用说明 好书推荐：Practical Protocols of Gene Engineering Website dealing with cloning and molecular analysis of genes Some really wonderful illustrations of the techniques of genetic engineering! A truly amazing global resource page on cloning, stem cell research, and related ethical issues, including recent news articles and legislative updates Animation and article on interspecies cloning From PBS...an animation that illustrates how stem cells are cultivated Animations illustrating the use of viruses as vectors for gene therapy Animations of techniques used for cloning mammals, as well as a create-your-own-clone link Another animation of PCR ~rjh9u/pcranim.html Animations of restriction digests and gel electrophoresis Gel electrophoresis techniques and simulations A wonderful website that includes links to a virtual lab on agarose gel electrophoresis: A Massachusetts Institute of Technology website dealing with Southerns, Northerns, Westerns, and cloning: 2-D gel electrophoresis of proteins: A website containing lots of links to electrophoresis techniques and simulations: Want to learn more about chemical bonds? Check out this website: 多个录象-多个著名公司 PCR和 RFLP动画片 redasoft visual cloning 2000 patch 分子生物学屏幕保护程序下载 pcr 蛋白 amavi100 dna旋转 ddnabase cyclovir 分子生物学相关软件 １.DNA分析：数据库GenBank, EMBL, DDBJ 查询软件；用来帮助进行PCR引物设计与基因探针设计的软件；功能很全面的DNA序列分析工具包；DNA分析与绘图软件,可绘制线性或环形DNA图；限制酶消化工具；以Java语言写成的序列比较查看器２.RNA分析：RNA二级结构分析软件；预测RNA二级结构图３.蛋白质分析：蛋白序列分析软件包；研究膜蛋白拓扑学结构和其它特性的JAVA软件４.生化教学：生化基础概念演示教学程序； 生化教学文件 ５.生化工程：生物反应器（发酵罐）设计软件；发酵实时模拟软件；计算机辅助设计特别是生物工艺设计的软件包６.序列格式转换：FASTA与BLAST查询输出文件的处理软件７.引物分析８.序列综合分析９.检索与阅读１０.基因芯片