电泳分离血清蛋白实验报告

电泳分离血清蛋白 篇一:醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告 前言 血清蛋白: 血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。 牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70 000，这就是一个数据了。在做PCR的时候会用到它。 牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。 醋酸纤维薄膜电泳: 醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋 酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好;太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血 清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。 特点: 1.(1)醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 (2)快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 (3)灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 (4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球 蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 (5)醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。 一、实验目的 1.掌握电泳法分离血清蛋白质的原理; 2.掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法。 二、实验原理 1.电泳:是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 2.影响电泳迁移率的因素: 内在因素:蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0,7.3之间，在pH8.6的缓 冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快;反之，则较慢。 4.醋酸纤维素溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无 拖尾和吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面 5. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 三、实验材料及试剂 1、实验器材 1. 电泳仪:为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽:为电泳提供场所。 3. 血清加样器 :可用盖玻片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜:2cm×8cm 5. 其它: 培养皿(直径9-10cm)、滤纸、镊子等 2、实验材料及试剂 材料:牛血清 1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6) 2.0.5% 氨基黑10B染色液 3.漂洗液 4.透明液:临用前配制 甲液:取冰乙酸(AR)15ml，无水乙醇(AR)85ml，。 乙液:取冰乙酸(AR)25ml，无水乙醇(AR)75ml。 5.保存液:液体石蜡 6.定量洗脱液(0.4mol/L NaOH溶液) 四、实验步骤 1、电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 2、醋酸纤维素薄膜的润湿 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体。 3、点样 把膜条铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器在血清中沾一下(量薄薄一层为好)，再在膜条一端1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。此步是 实验的关键。 4、电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝 篇二:血清蛋白的分离、提纯与鉴定 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定 一、实验目的: 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 二、实验原理: 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋 白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。 A.盐析法:在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。 B.凝胶层析:利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。 C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳):血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低 于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 A材料 样品:人混合血清 试剂:葡聚糖凝胶(G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤 盐析(粗分离)?葡聚糖凝胶层析(脱盐)?DEAE纤维素离子交换层析(纯化)?醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定) 具体操作流程示意: (一) 盐析+凝胶柱层析除盐: (二)离子交换层析(纯化): (三)醋酸纤维素薄膜电泳: 1、点样(如下图): - 点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多 2、电泳: ?薄膜粗面向下 ?点样端置阴极端 ?两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平 电压:110V 时间:50min 3、染色和漂洗: 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色(一般更换2次)，至背景 颜色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。 : 1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。 2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。 3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。 4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。 5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉 篇三:05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 ( 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 (熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE )就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺( Acr )单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺( Bis )在催化剂 过硫酸铵( Ap ) 和加速剂 四甲基乙二胺( TEMED ) 的作用下发生聚合反应而制得的(其化学结构式见第 2 篇第 1 章)。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ,聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质(见第 2 篇第 1 章)， 使样品分离效果好， 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 , 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来(图 3-4 )，是 目前较好的支持介质， 应用十分广泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩(浓缩效应)成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 【器材】 1 (电泳仪 直流稳压电源，电压 400 , 500V ，电流 50mA 。 2 (垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀( 5 , 6mm ) , 外径 7 , 8mm ，长 80 , 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽 。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流(图 3-5 )。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面， B 为剖面 ) 3 (大号试管和中号试管 4 (微量移液器 5 ( 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 (洗耳球、滤纸条、封口膜等 【试剂】 1 (丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。 2 ( N ， N ， N ,， N , — 四甲基乙二胺( TEMED ) 商品 TEMED 即可，低温，避光保存。 3 ( 10% 过硫酸铵溶液( AP ， W/V ) 10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。 4 (染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。 5 (脱色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 6 (储备液的配制 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表: 储液配制好后放冰箱 4 ? 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。 7 (凝胶液的配制 分离胶和浓缩胶的配制见下表: 8 ( 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 100 ml 。 9 (加样缓冲液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 盐酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混匀后，再加入 0.02g 溴酚蓝， 4 ? 保存备用。 【操作】 1 (凝胶系统的聚合和制备 一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。 ( 1 )电泳玻璃管的准备 取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。 ( 2 )分离胶(小孔胶)的制备 取分离胶 3ml 放入试管，加入 100μl 10% Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口 2cm 时停止(约 1.6ml )。注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器和针头要及时用水清洗，防止堵塞。 再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层(约 0.2ml )以隔绝空气，并防止柱表面的弯月面。加水过程中不要用力过猛，防止将液面胶液冲起。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约 15~20 分钟后，完成凝胶的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。 ( 3 )浓缩胶(大孔胶)的制备 取浓缩胶 1ml 放入试管，加入 50μl 10%Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面，用滤纸吸取残留的缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。 再加入约 1cm 高的浓缩胶(约 0.25ml )，表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合 20~30 min 后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。 吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置 10~20 min 后即可使用了。 2 (样品的制备和点样 ( 1 )样品的准备:取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加样缓冲液混合。可在 4 ? 冰箱保存 2 周。 ( 2 )点样:将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓 冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口(注意不要有气泡存在)和电极丝;上槽的液面应没过玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取 50μl 样品;蛋白样品 1 份(蛋白质含量 1mg/ml ，溶于加样缓冲液中)小心的加入玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。 4 (电泳 ( 1 )电流电压条件 圆盘电泳:直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。 ( 2 )电泳时间 一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。