负压微柱层析法快速测定糖化血红蛋白HBA1c

负压微柱层析法快速测定糖化血红蛋白HBA1c 负压微柱层析法快速测定糖化血红蛋白 HBA1c 现代检验医学杂志2007年3月第22卷第2期JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.259 负压微柱层析法快速测定糖化血红蛋白HBAlc 熊传郑,朱海波,邓建平,陈丽峰(黄石市爱康医院,湖北黄石435000) 摘要:目的对传统的微柱层析法操作过程进行改良,以缩短层析柱分离样品的时间,从而提高该法测定糖化血红蛋白 HBAlc的检测速度.利用负压装置对糖化血红蛋白HBAlc微层析柱下端进行负压引流,使液体过柱时间大幅缩 短,显着提高糖化血红蛋白HBAlc检测速度.结果采用负压微柱层析法测定糖化血红蛋白HBAlc可将样品分离时间由 原来的2h缩短到15min.经对比试验,改良方法与原方法无显着性差异(P>O.05),测定结果相关性显着(r一0.931,P< 0.01);与高效液相色谱法测定结果亦呈显着性相关(r一0.946,P<0.01);该方法批内变异CV=3.63%,批间变异cv= 4.11.结论负压微柱层析法有效提高了糖化血红蛋白HBAlc检测速度,其测定结果与原方法无显着差异,且改良所需 成本低廉,可应用于临床实验室HBAlc的快速测定. 关键词:负压;微柱层析法;快速测定;糖化血红蛋白HBAIc 中图分类号:Q503R446.112文献标识码:A文章编号:1671-7414(2007)02-059-04 RapidDeterminationofGlycosylatedHemoglobin HBA1cwithVacuumColumnChromatography XIONGChuan—zheng,ZHUHai—bo,DENJian—ping,CHENLi—feng (丁^LoveHealthHospitalofHuangshi,HubeiHuangshi435000,China) Abstract:ObjectiveOperationofthetraditionalmicrocolumnchromatographyprocessimpr ovementstoreducethetime tosampleseparation,thusincreasingthedetectionrateofglycosylatedhemoglobinHBAlc.MethodsTheuseofvacuum devicestodrainagelowerglycosylatedhemoglobinHBAlcmicrochromatographycolumn,fluid—timebycolumnsubstan— tiallyreduced,significantlyimproveddetectionrateofglycosylatedhemoglobinHBAlc.ResultsDeterminationofglycosy- latedhemoglobinHBAlcwithvacuumchromatographymicrocolumn,thetimeofsampleseparationcouldbeshortened fromtwohoursto15minutes.Bycomparisontest,themethodandtheresultsoftheoriginalmethodwasnosignificantdif— ference(P>O.05),theresultswerehighlypositivecorrelated(r一 0.931,P<O.01).Todeterminationresultsofhighper— formanceliquidchromatographywerehighlypositivecorrelated(r一 0.946,P<O.01),within—CV=3.63.inter—assayCV 一 4.11%.ConclusionVacuummicrocolumnChromatographyhaseffectivelyenhancedtheglycosylatedhemoglobin HBAlcdetectionrate,nosignificantdifferenceinresultswiththeoriginalmethod,andupgradinglow—cost,whichcanbe appliedtorapiddeterminationoftheclinicallaboratoryHBAlc. Keywords:vacuum;microcolumnchromatography;rapiddetermination;glycosylatedhemoglobinHBAlc 糖化血红蛋白HBAIc可反映受检者前6,10白HBAIc检测速度.负压微柱层析经 过与原方法 周内的平均血糖水平,因此该项目可作为糖尿病长的对比试验以及与高效液相色 谱法的相关性试验, 期控制的良好指标,尤其对1型DM和GDM的治结果均较为理想,可应用于临床 实验室对糖化血红 疗有监控作用.临床实验室常用的糖化血红蛋白蛋白HBAIc的快速检测,现报道 如下. HBA1c测定方法有色谱法,电泳法和免疫比浊法,1材料与方法 其中利用色谱分析原理进行糖化血红蛋白HBAIc1.1材料 测定的方法又可分为柱层析法(包括普通柱层析和1.1.1试剂:西班牙Biosystems 微柱层析法测定 微柱层析),高效液相色谱法(HPLc),快速蛋白液糖化血红蛋白HBAlc试剂盒. 相色谱法(FPLC)及亲和层析法等.目前在我国以1.1.2设备 微柱层析法应用最为广泛.采用微柱层析法测定糖1.1.2.1722分光光度计;上海第三分析仪器厂 化血红蛋白HBA1c精密度高,重复性好L1],但测定 时间较长,整个样品分离过程通常需要2h左右. 目前使用HPLC,FPLC等仪器虽然可提高糖化血 红蛋白HBAIc检测速度,但此类仪器测定项目较 少且价格较为昂贵,特别是在基层单位难以得到广 泛应用.本实验室使用自行设计并制作的负压装置 对微层析柱进行负压引流,可有效提高糖化血红蛋 生产. 1.1.2.2高效液相色谱仪:日本HLC一723G7 TOSOHGLYCOHEMOGLOBIN. 1.1.2.3负压装置:本实验室自行设计并制作:? 负压泵;2XZ一0.5型旋片式真空泵(抽气速度0.5 L/s,浙江临海精工真空设备厂产);?空气流量 计:LZB40玻璃转子流量计(武汉流量计厂产);? 作者简介:熊传郑(1952一),男,中专,主管技师,从事临床检验3o余年. 60现代检验医学杂志2007年3月第22卷第2期JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.2 负压装置连接方法:将引流导管(直径7ram)一端 穿过橡皮塞插入收集管(带刻度),另一端连接微层 析柱底端,利用三通阀来切换该导管的引流状态和 断流状态,断流状态时,导管内剩余液体可流入收 集管;将负压导管(直径9ram)一端穿过橡皮塞插 入收集管,另一端连接负压泵接口;将负压调节导 管(直径19ram)一端穿过瓶塞插入收集管,另一 端连接空气流量计,通过控制空气流量计阀门的开 关可调节收集管内的负压.为防止引流导管收集液 体被直接从负压导管吸走,两根导管口不宜距离太 近.按以上连接组成负压引流层析装置,如图 1所示. 图1负压快速柱层析装置 1.1.3标本:收集本院临床全血标本(肝素抗凝) 41份,其中健康者(无糖尿病史且空腹血糖正常 者)标本15份及确诊为糖尿病患者标本26份,待 测. 1.2方法 1.2.1空气流量优选试验:在上述41份标本中随 机抽取1O份,先将流量计控制在2O,40L/h,测 定该10份标本糖化血红蛋白HBAlc浓度;然后依 次将流量计加大至40~60L/h,60~80L/h,80, 100L/h等不同流量级别(在该负压装置条件下, 流量计最大空气流量为100L/h),分别测定该10 份标本在不同空气流量下测得的糖化血红蛋白 HBAlc浓度,并对测定效果进行观察评价. 1.2.2与原方法的对比试验:采用原方法与负压 微柱层析法同时对41份临床全血标本进行糖化血 红蛋白HBAlc测定,然后进行配对t检验及相关 性统计分析. 1.2.2.1原方法组测定:按Biosystems微柱层析 法测定糖化血红蛋白HBAlc试剂盒说明书操作步 骤,测定41份临床全血标本HBAlc水平. 1.2.2.2改良方法组测定:按下述方法测定41份 临床全血标本HBAlc水平.?取全血50l加溶 血剂(试剂I)200l混匀制备成溶血产物;取溶血 产物50l加试剂?12ml混匀(HB总),待比色;? 确认负压装置连接正确后启动负压泵,待气压稳定 后将空气流量调节至70,80L/h,然后打开三通 阀进行引流;?当层析液内原有的保存液全部渗入 树脂后立即关闭三通阀,不要使树脂内液体被吸 干,然后进行加样及加试剂的步骤;加入试剂(或样 品)后,打开三通进行引流,收集管开始收集洗脱 液,当收集的洗脱液的量等于加入量时应立即关闭 三通阀,否则树脂内水分被吸干,将影响测定结果; 然后进行下一步加试剂步骤,试剂加入后可打开三 通阀继续引流,其余操作同原法操作步骤;?分别 该方法及原方法分离样品所需时间及测定结 果,并对测定结果作t检验及相关性分析. 1.2.3,与高效液相色谱法相关性分析:在上述已 测的41份标本中随机抽取20份标本,在HLC一 723G7型高效液相色谱仪上测定,并对测定结果作 相关性分析. 1.2.4精密度试验:取全血标本一份用负压微柱 层析法批内重复测定20次,计算批内变异CV;再 用此份标本连续5d每批测定4次,计算批问变异 CV. 2结果 2.1空气流量优选试验结果该实验从开始加样 到最后一次洗脱液收集完成为一次完整的样品分 离过程,对此过程进行计时作为该实验的分离 时间.通过控制流量计的空气流量阀可调节收集管 内负压强度,在40,100L/h范围内,流量计的空 气流量越大,收集管内负压越小,流速随之降低;流 量计空气流量越小,则负压越大,流速随之加快.因 此,在该空气流量范围内,可通过调节空气流量来 控制收集管内的负压,继而达到控制样品分离时问 的目的.当空气流量小于40L/h时,由于负压过大 使层析柱内树脂向底部挤压过紧,对洗脱液流动形 成阻力,故测定时问无明显增加;并且在该条件下 树脂挤压过紧,使洗脱液难以渗入到树脂中央,造 成部分糖化血红蛋白HBAlc无法洗脱,以致测定 结果偏低.而当空气流量大于80L/h时,收集管内 产生的负压较小,流速明显减慢,未能达到快速分 离的目的.当空气流量控制在60~80L/h时,收集 管内负压适宜,液体流速较快,测定结果较为理想, 样品分离时间为12,15min(因树脂致密程度不 同,分离时间略有差异).因此,选择该空气流量范 围作为控制该实验负压强度及样品分离时间的参 数较为理想.观察不同空气流量下测定结果,样品 分离速度及分离效果,并作评价,见表1. 2.2负压微柱层析法与原方法对比试验结果负 压微柱层析法?s)7.69?2.17(用时15min)与 原方法7.69?2.40(用时2h)比较显着提高了糖 现代检验医学杂志2007年3月第22卷第2期 JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.261 化血红蛋白HBAlc检测速度;两法测定结果经对 比试验无显着性差异(P>0.05);两种方法相关性 显着(r一0.931,P<0.01),回归方程:Y一1.23+ 0.84(y代表由原法浓度推算的负压柱层析法 浓度),见图2. 表1空气流量(L/h)优选试验 图2负压微柱层析法与原方法相关性 图3负压微柱层析法与高效液相色谱法相关性 2.3负压微柱层析法与高效液相色谱法相关性分 析负压微柱层析法与高效液相色谱法相关系数 显着性检验见图3(r一0.946,Pd0.01),相关系数 有高度显着性,可判定两种方法有相关关系,回归 方程:y=::0.67+0.98(y代表由负压微柱层析法 浓度推算的高效液相色谱法浓度). 2.4精密度试验批内测定负压微柱层析法的精 密度CV=3.63;批间测定负压微柱层析法精密 度CV=4.11. 3讨论色谱分析是临床测定糖化血红蛋白 HBAlc的最常用方法,主要有离子交换层析法(包 括普通柱层析及微柱层析),高效液相色谱法 (HPLC),快速蛋白液相色谱(FPLC)和亲和层析 法等],其中高效液相色谱法可作为目前该项目的 金.近年来,随着免疫检验技术及全自动生化 仪器的不断发展,免疫比浊法测定糖化血红蛋白 HBAlc也得到越来越广泛的应用,但至今尚无国 际认可的参考物对该项目进行标准化[3],故标准品 难以溯源,直接影响了其测定的准确度.目前,我国 临床实验室多采用离子交换微柱层析法进行糖化 血红蛋白HBAlc测定.微柱层析法测定糖化血红 蛋白HBAlc精密度高,重复性好,因此在我国被临 床广泛应用.但微柱层析法的测定步骤中有多次液 体过柱的过程,通常耗时较长,受此环节影响其整 个测定过程时间较长,不利于临床实验室对糖化血 红蛋白HBAlc的快速检测.微柱层析法是依靠液 体自身重力向下流动对层析柱进行洗脱分离样品 的,层析柱填充物的颗粒直径大小将直接影响液体 过柱时间.使用颗粒直径过细的填充物,会增加洗 脱的阻力而延长实验时间,因此一些对糖化血红蛋 白HBAlc分离效果较好但颗粒直径细的物质受到 限制,不能应用于该法.现对微柱层析法实验步骤 中液体过柱过程进行改良,采用负压装置对微层析 柱下端引流,以此缩短液体过柱时间,经测试后效 果较为理想,可达到快速检测的目的.通过调节进 气端空气流量控制液体的流速,并对不同空气流量 条件下测定效果进行比较,选定空气流量在60, 80L/h样品分离及测定效果最为理想,该条件下 样品分离时间可缩短为12,15min[由于收集管 内的负压强度受各导管直径,负压泵性能,流量计 规格及层析柱填充物的致密程度等多种因素影响, 故该实验提供的空气流量参数只适合于本配置下 的负压装置;若负压装置配置不同,可按12,15 min时间分离样品(相当于液体流速为30~40ml/ h)为条件对空气流量参数进行优选]. 微柱层析法是利用被分离的各组分的电荷性 质及数量不同,与离子交换剂的吸附和交换能力的 不同而达到分离的目的.影响层析法分离效果的因 素主要有:树脂的选择,树脂粒度,离子强度和pH, 样品液体积,层析柱长度和直径等.该实验中除改 变流速外,其它因素均与原法相同.而液体过柱的 流速可根据实验要求而决定,可采用范围为30, 200ml/h,本实验中液体流速约为40ml/h,因此 该改良不会对样品分离效果产生影响L2].使用负压 装置对微柱层析法进行改良,改良过程简单,所需 器材易于购买,且成本较低廉.负压微柱层析法与 原方法测定结果无显着性差异(P>0.05),并且相 关性显着(r一0.931,P<0.01);该方法与高效液 相色谱法测定结果亦呈显着性相关(r一0.946,P 62现代检验医学杂志2007年3月第22卷第2期 JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.2 d0.01);批内变异CV为3.63,批间变异CV为 4.11;在糖化血红蛋白HBA1c检测速度上,负压 微柱层析法可将样品分离时间由原方法中的2h 左右缩短到12,15min.结果表明,该方法在提高 糖化血红蛋白HBAlc检测速度方面效果较为理 想,测定结果较为满意,因此该方法可用于临床实 验室糖化血红蛋白HBA1c快速检测,并可为负压 微柱层析在其它方面的应用提供参考依据. (致谢:黄石市中心医院检验科提供日本HLC一723G7 TOSOHGLYCOHEMOGLOBIN高效液相色谱仪,陈丽峰 副主任技师协助测试.) 参考文献: [11张秀明.现代临床生化检验学[M].北京:人民军医出 版社,2001:lO4一lO7. [21中山大学生物系生化微生物学教研室编.生化技术导 论[M].第1版.北京:人民教育出版社,1978:20g一 211. [31韩志钧,黄志锋,卢业成,等.临床化学常用项目自动 分析法[M3.沈阳:辽宁科学技术出版社,2005:998— 1000. 收稿日期:2006—12—21 邻苯三酚红钼法和双缩脲法测定尿蛋白的分析 孙午,熊莺,涂艳,梁皓(九江市第一人民医院检验科,江西九江332000) 中图分类号:R446.122文献标识码:A文章编号:1671—7414(2o07)02—062—01 健康成人24h经尿排出的蛋白质总量为2O,8Omg,取0.05时,两者差异具有统计学意义,但是相关系数偏小. 约6O来自血浆蛋白,4O%来自泌尿系统分泌物,定量测出现这种情况,一方面我们考虑两种方法的线性范围不同, 定超过150mg/24h即称为蛋白尿[1].蛋白尿主要反映肾PRM法的线性范围为O,5g/L,TP法的线性范围为1O, 小球和肾小管损害程度,尿蛋白定量检查是观察肾病患者120g/L[2].临床实践中,肾病患者尿中虽然含有大量蛋白 疗效及判断预后的一个重要指标.本文采用邻苯三酚红钼质,有的甚至可达10g/24h,但大多在3,5g/LR].这样由 法(PRM)和双缩脲法(TP)测定尿蛋白,进行两种方法的比于两种方法的性能和实际病人情况,造成两种方法的不相 较,同时为了避免尿量对于两种方法统计比较的影响,不进关.另一方面有关文献报道TP法和PRM法在测定尿蛋白 行24h尿蛋白计算,而单纯进行尿蛋白定量.上相关性显着Dj,这说明两种方法在测定特异性上具有一 1材料和方法?标本来源:本院274名住院病人,病人致性,只是存在测定范围上的差异,与本文中PRM法和 尿液标本无黄疸,无乳糜.?仪器:德灵DIMENSIONRXLTP法在高值处具有较好的一致性是相吻合的,从而能解 全自动生化分析仪(美国).?试剂和方法:慈城微量蛋白测释当置信度取0.05时,两者差异具有统计学意义.虽然沉 定试剂盒(PRM),德灵原装配套总蛋白的双缩脲试剂盒淀TP法和PRM法在测定尿蛋白上相关性显着,但是不利 (TP).检测按试剂盒说明书方法操作.?统计学方法:所得于自动化,可以实现自动 化的TP法和PRM法的差异又过 数据采用相应的F检验和t'检验.大,因此建议应该采用PRM法进行尿蛋白定量及24h尿 2结果274名住院病人尿蛋白测定结果(士s,g/L)为蛋白计算,为临床提供有效,准确的测定结果. PRM法1.065士0.28,CV为0.263;TP法0.720士0.参考文献: 23,CV为0?319.[1]朱忠勇.实用医学检验学[-MJ.北京:人民军医出版 2.1齐性分析PRM和TP法测定尿蛋白均值之间的方社,1992,936—937. 差齐性分析采用F检验:F=1.192,P<0.01,两者差异具[2]叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[K].第2 有统计学意义.版.南京:东南大学出版社,1997:155—156,162— 2.2准确度比较PRM法和TP法测定尿蛋白均值之间163. 准确度的比较采用t'检验:f'一27.625,P<0.01,两者差异[31陈筱菲,池胜英,刘存丽,等.尿总蛋白测定情况调查 具有统计学意义.和邻苯三酚红钼法评价[J].温州医学院,2004, 2.3相关分析PRM法和TP法测定尿蛋白均值相关分34(5):369,37O. 析及检验(以PRM法为X,TP法为y):y一0.15+O.54X,[41袁冬梅,宁光慈.双缩脲法手工与上机测定24h尿蛋 r=0.132,置信度取0.01时,P>0.01,两者差异不具统计白实验观察口].安徽卫生职业技术学院,2003, 学意义;置信度取0.05时,P<O.05,两者差异具有统计学2(5):59. 葸义.r5]ThomasMarshalla,KatherineMWilliams.Totalpr一 3讨论本文采用PRM法和TP法分别测定274名住院Oteindetermlnati0ninurine:ellminatl0nofadlffer一 病人尿蛋白数值,最后的统计结果表明两种方法差异存在entlalresponsebetweenthec00massieblueandDy- 统计学意义,PRM法结果高于TP法,这与ThomasMar—r0gallo1redprOteindye-bindingassays[J].Cllical shalla等实验所示PRM法测定结果高于其它多种方法的c|llrv,2000,46(3):392—398. 结果相似[5].两者结果相关分析结果与置信度取值有关,当收稿日期;2006—02— 13 置信度取0.01时,两者差异不具有统计学意义,当置信度