鞘氨醇单胞菌N1菌株的16SrDNA序列分析和溴氨酸降解的动力学_cropped

鞘氨醇单胞菌N1菌株的16SrDNA序列和溴氨酸降解的动力学_cropped () 文章编号: 046527942 20060220062205 鞘氨醇单胞菌 菌株的 16序列分析1 NS rD NA Ξ 和溴氨酸降解的动力学 1 1 2 李 莹,庄源益,蔡宝立 ( 1. 南开大学 环境科学与工程学院, 天津 300071; )2. 南开大学 生物活性材料教育部重点实验室和微生物系, 天津 300071 摘要: 对降解蒽醌染料中间体溴氨酸的 菌株进行了 16序列分析和溴氨酸生物降解的动力学 1 N S rDN A (研究. 1 菌株经过 16序列测定和同源性分析, 被鉴定为鞘氨醇单胞菌 以前曾称为 . , N S rDN A S p h ing om onas sp )在高浓度溴氨酸时菌株的降解过程存在底物抑制现象, 其行为符合提出的描述 . . 1 P seu d om onas spN A nd rew s 微生物菌体生长的非竞争性底物抑制模型. 本文对此方程进行了非线性回归, 确定了模型参数, 实验数据对该动 力学方程能很好拟合. 此外, 从模型中得出, 溴氨酸浓度为 520, 580 ƒ时, 均达到较高值, 这一实验结 与 m gL Λ q 果为溴氨酸废水的生物处理工艺提供了重要参考条件. 关键词: 鞘氨醇单胞菌 序列; 溴氨酸降解动力学 1; 16N S rDN A 中图分类号: 812; 642 文献标识码: Q O A 0 引 言 () 溴氨酸 学名为 12氨基242溴蒽醌222磺酸, 简称 是蒽醌染料中间体中的一种, 主要用于合成蒽醌 A BA 型染料, 其分子结构中含氨基、磺酸基和溴原子, 而且具有应用范围广、水溶性强、结构稳定、难被普通微生 1 , 4 物降解等特点, 所以其生物降解研究受到广泛重视. 1 , 13 有关溴氨酸生物降解的研究, 已经有一些报道, 但尚未见到有关于降解菌株的 16序列和 S rDN A 溴氨酸降解动力学过程的研究. 本文作者从生产溴氨酸工厂的污染土壤中分离到高效降解溴氨酸的 1 N 8 菌株, 并对该菌株的生理生化性质和降解性能进行了测定, 并对 菌株的 16序列进行了测定1 N S rDN A ()和同源性分析, 证明它是一个鞘氨醇单胞菌菌株 以前曾称为 此 . , . . S p h in g om on a s spP seu d om on a s sp外, 对溴氨酸的生物降解和细菌生长的动力学过程进行了研究, 建立了动力学方程. 这些结果对研究溴氨 酸降解菌株在系统发育中的地位和溴氨酸废水的生物处理工艺具有重要的指导意义.1 材料和方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌株: N 1 菌株, 本实验室从溴氨酸污染的土壤中筛选得到, 经溴氨酸长期培养驯化后保存. 1. 1. 2 试剂: 溴氨酸由天津理工大学理工集团公司提供, 其它化学试剂均为市售分析纯. 培养基: 无机盐培养基: 见文献14 , 溴氨酸为碳源, 浓度为 120, 3 000 ƒ.m gL1. 1. 3 1. 2 方法 菌 株 的 1. 2. 1 扩 增 和 序 列 测 定: 正 向 引 物 N 1 16S rDN A PCR 27F: 5′2A GA GT T T GA T C2 15 23′; 反向引物 1 492: 5′223′. 扩增反应体系为 25 , C T GGC T CA GR C GGT TA CC T T GT TA C GA C T T ΛL 反应条件为 94 ?预变性 3 , 94 ?变性 1 , 55 ?退火 0. 5 , 72 ?延伸 1 , 进行 30 个循环后,m in m in m in m in () 72 ?延伸 10 . 仪为基因公司 产品. 产物经琼脂糖凝胶电泳和纯化 m inPCR Gen e Com p an y L im itedPCR () 回收后与 2载体 大连宝生物公司连接, 转化大肠杆菌. 含有克隆的菌株 16序1851 pM D T D H ΑN S rDN A ( 列由 大 连 宝 生 物 公 司 测 序, 两 端 测 序 引 物 为 T 7 和 Sp 6 启 动 子 序 列, 中 间 测 序 引 物 为 533F GT 2 Ξ 收稿日期: 2004209225 () 作者简介: 李莹 1977—, 女, 天津人, 博士研究生, 主要从事环境污染物的生物降解研究. 15 ) .GCCA GCM GCC GC GGTA A 1. 2. 2 序列数据处理和系统发育树构建: 由 中得到相关菌株的 16序列, 与本研究所测 GenB an k S rDN A 得序列一起输入 软件包中进行 同源性序列排列. 在此基础上, 将序列输入 软1. 81 32 C lu sta lX DN A t reev 件包构建系统发育树. 1. 2. 3 培养基中溴氨酸浓度的测定: 取不同时间的培养物, 用 0. 45 微孔滤膜过滤, 上清液在 485 Λm nm 4 波长处测定吸光度 , 其值反映溴氨酸浓度.A 1. 2. 4 培养基中细胞浊度的测定: 取不同时间的培养物, 用 0. 45 微孔滤膜过滤, 以上清液做参比, 在Λm 600 波长处测定培养物的吸光度 , 其值反映细胞浊度.nm A 1. 2. 5 溴氨酸降解菌的降解动力学实验: 用不同浓度溴氨酸的无机盐培养基培养 N 1 菌株, 于不同时间 取样, 测定培养液的溴氨酸含量和浊度. 由实验数据求出相应的溴氨酸比降解速率 q 和细菌的比生长速率 16 , 并对所求数据和初始浓度进行非线性回归, 求出模型参数.Λ 2 结果与讨论 2. 1 N1 菌株 16S rD NA 序列测定和同源性分析 PCR 扩增的 N 1 菌株 16S rDN A 序列的大小为 1 451 bp , 将该序列输入 GenB an k , 以 BL A ST 软件进行序 () 列同源性比较, 结果显示其序列与鞘氨醇单胞菌属 的多种细菌具有较高的同源性, 与. S p h in g om on a s sp 24 个 菌株的同源性大于 96 % , 其中与 6 个 菌株的同源性大于S p h in g om on a s S p h in g om on a s x en op h a g a () 99 % 1, 所以 菌株应属于 属细菌. 1 菌株的 16序列在 中的登录 1 N S p h in g om on a s N S rDN A GenB an k 号为 496444.A Y 表 1 1 菌株与相关细菌的 16序列比较 NS rD NA Table 1 Sequen ce s produc in g s ign if ican t a l igm en ts of stra in N1 an d re la ted bac ter ia 微生物来源 核苷酸计数 比特 ()同源性ƒ% GenB ank no. g i ()1 435 99. 0 % 1 421ƒ1 150 636 2 734 1 379 S p h ing om onas sp. BN 6 ()1 407ƒ1 420 99. 1 % . 30204 586 612 2 712 1 368 S p h ing om onas spM B IC ()1 051 198 2 654 1 339 1 3951 414 98. 7 % . 12ƒS p h ing om onas spU N F ()1 391ƒ1 441 98. 6 % 6 018 094 2 639 1 331 . 17S p h ing om onas spA n t ()1 3901 412 98. 4 % ƒ348 716 2 585 1 304 .B ac il lu s sp ()5 834 341 2 506 1 364 1 403ƒ1 448 96. 9 % 295. S p h ing om onas spD hA ()31 871 803 2 490 1 256 1 3401 366 98. 1 % .ƒS p h ing om onas sp ()1 2721 279 99. 5 % ƒ32 469 229 2 480 1 251 6S p h ing om onas x enop h ag a A J ()()1 270ƒ1 279 99. 3 % 32 469 233 12 464 1 243 S p h ing om onas x enop h ag a ()()21 2701 279 99. 3 % ƒ32 469 232 2 464 1 243 S p h ing om onas x enop h ag a ()32 469 230 2 464 1 243 1 271ƒ1 279 99. 4 % 8S p h ing om onas x enop h ag a A J ()32 469 231 2 460 1 241 1 2701 279 99. 3 % 1ƒS p h ing om onas x enop h ag a P ()12 957 163 2 448 1 235 1 376ƒ1 423 96. 7 % . S p h ing om onas spYT ()1 378ƒ1 427 96. 6 % . 7411 414 804 2 444 1 233 S p h ing om onas spK ()33 860 369 2 434 1 228 1 3931 446 96. 4 % . 016ƒS p h ing om onas spF Z ()()32 469 228 32 432 1 227 1 267ƒ1 279 99. 1 % S p h ing om onas x enop h ag a ()4 589 390 2 430 1 226 1 376ƒ1 426 96. 5 % . 3990S p h ing om onas spM B IC (). 111 051 197 2 426 1 224 1 3751 423 96. 6 % ƒS p h ing om onas spU N F (). 55 081 822 2 416 1 219 1 392ƒ1 447 96. 2 % S p h ing om onas spJ S ()4 165 422 2 409 1 215 1 388ƒ1 445 96. 1 % P seu d om onas abik onens is ()34 329 467 252 407 1 214 1 3121 334 98. 4 % . 1ƒS p h ing om onas spA s (). 39924 589 699 2 403 1 212 1 368ƒ1 420 96. 4 % S p h ing om onas spM B IC ()233. 4 138 587 2 393 1 207 1 374ƒ1 427 96. 3 % S p h ing om onas spD hA ()28 848 941 2 377 1 199 1 372ƒ1 425 96. 3 % . 6330S p h ing om onas spA S ()1 150 635 2 377 1 199 1 3781 435 96. 0 % . 1ƒS p h ing om onas spB 15 911 913 S p h ing obium y anoik uy ae 2 377 1 199 ()1 3571 407 96. 5 % ƒ ( ) 1 052 980 ƒ1 432 96. 0 % 1 2 371 1 196 1 375S p h in g om on a s y a n o ik uy a e B 从 GenB an k 中调出已命名的与 N 1 菌株具有较高同源性的 27 株菌的 16S rDN A 序列, 与 N 1 菌株的 ()16序列比较后, 构建了系统发育树 图 1. S rDN A 图 1 基于 16序列的系统发育树 S rD NA . 1 16F igPhy logen e t ic tree ba sed on the S rD NA sequen ce 1 of Nan d the sequen ce s of re la t in g spec ie s 2. 2 溴氨酸生物降解动力学模型的建立 () 由实验数据 表 2可知, 随着溴氨酸初始浓度的增加, 起初溴氨酸降解加快, 随后又减慢. 可见, 在溴 氨酸降解过程中, 由于其本身对微生物有一定的毒害作用, 当浓度达到一定值时, 会对降解过程产生抑制 作用, 因此在建立其动力学模型时, 可以考虑选择底物抑制模型. 表 2 溴氨酸降解动力学实验数据 2 Table Exper im en ta l da ta of A BA degrada t ion k in e t ic s 溴氨酸浓度 - 1- 1- 1- 1- 1 相对误差ƒ% 相对误差ƒ% 实验值 计算值 ƒƒ 实验值ƒ计算值ƒq h q h Λ h Λ h ()?ƒm gL 124. 4 0. 218 4 0. 214 9 1. 443 1. 194 8 1. 187 9 0. 564 501. 2 0. 439 1 0. 444 0 1. 104 2. 282 0 2. 292 9 0. 475 1 017. 1 0. 373 8 0. 370 3 0. 945 2. 092 2 2. 083 5 0. 418 1 514. 1 0. 290 6 0. 288 3 0. 798 1. 698 3 1. 736 1 2. 177 2 069. 3 0. 242 6 0. 226 2 7. 250 1. 555 8 1. 431 7 8. 668 2 567. 2 0. 184 8 0. 188 4 1. 911 1. 179 1 1. 229 1 4. 068 3 108. 2 0. 137 3 0. 159 0 13. 648 1. 013 3 1. 062 1 4. 595 16 , 20 16提出的一种描述微生物菌体 几种底物抑制模型已建立, 其中最简单最常用的是由 A n d rew s () 生长的非竞争性底物抑制模型, 如式 1所示. ΛS m ax()1 Λ = 2 S S + K + S K i 在溴氨酸降解过程中, 菌体的生长和基质的降解基本偶联, 故可以采用描述菌体生长的模型描述溴氨 () 酸的去除, 方程形式如式 2所示. qS m ax ()2 q = 2 S S + K + S K i - 1 () 式中, Λ和 Λ分别为细菌的比生长速率和最大比生长速率 h ; q 和 q分别为溴氨酸的比降解速m ax m ax - 1 () 率和最大比降解速率 h ; S 为溴氨酸浓度 m gƒL ; K 和 K 分别为底物饱和常数和底物抑制常数 m gƒL.S i - 1 3. 529 h , 将表 2 中的数据以式 1 和式 2 为模型进行非线性回归, 得 到 式 1 的 模 型 参 数 Λ= m ax - 1 K = K = 式 2 的 模 型 参 数 qh , K 150. 8 m gƒL ; = 6. 769 = 558. 7 m gƒL , S L , i m axS 1 816. 5 m gƒ K =i 598. 4 m g L. ƒ 模型的方差分析分别如表 3 和表 4 所示, 拟合曲线如图 2 和图 3 所示. 由以下图表可以看出, 实验数 据与模型的拟合是很好的. 表 3 细菌生长模型非线性回归方差分析 - 3 1 Table Var ian ce ana ly s is to n on l in ear regre ss ion equa t ion of Ngrowth 方差来源 平方和 自由度 均方 相关系数 F 回归平方和 0. 575 56 3 0. 191 85 2 残差平方和 0. 000 804 4 0. 000 201 954. 7 = 0. 988 2r 0. 576 36 7 总离差 () 注: F = 954. 7> F 3, 4, 回归方程具有显著性. 0. 05 图 2 细菌生长模型动力学方程曲线与实验点 图 3 溴氨酸降解模型动力学方程曲线与实验 的拟合点的拟合 . 2 1 Exper im en ta l da ta s im ula t ion to the F igExper im en ta l da ta s im ula t ion to the NF ig. 3 growth k in e t ic s equa t ion A BA degrada t ion k in e t ic s equa t ion 表 4 溴氨酸降解模型非线性回归方差分析 - Table 4 Var ian ce ana ly s is to n on l in ear regre ss ion equa t ion of A BA degrada t ion () 方差来源 平方和 自由度 均方 相关系数 0. 05 3, 4F 回归平方和 18. 711 75 3 6. 237 25 2 0. 021 93 4 0. 005 483 = 0. 984 3残差平方和 6. 59 r 18. 733 68 7 总熟差 () 注: F = 1 137. 6> F 3, 4, 回归方程具有显著性 0. 05 () () K × K = 分别对式 1和式 2求导, 得出当 S = S i 1 816. 5 × 150. 8 = 523. 4 m gƒL 时, Λ 取最 - 1- 1K × K = 大值为 0. 444 4 h . 当 S =S i 558. 7 × 598. 4 = 578. 2 m g L 时, q 取最大值为 2. 3084 h .ƒ根据模型方程, 溴氨酸浓度为 520, 580 ƒ时, 均达到较高值, 这一结果为溴氨酸废水的生与 m gL Λ q 物处理工艺提供了重要参考条件. 参 考 文 献 () 1 卢俊瑞 1 溴氨酸活性染料生产废水治理 [. 工业水处理, 1999, 19 3: 20- 21. J () 2 辛宝平, 庄源益, 胡国臣, 等 1 菌株 23 对溴氨酸脱色特性探讨[. 城市环境与城市生态, 1999, 12 5: 1- 3. N K J () 环境科学研究, 1999, 12 6: 32- 35. 3 金若菲, 王竞, 张劲松, 等 1 蒽醌染料中间体微生物降解脱色研究 [.J () ( ) 4 辛宝平, 庄源益, 邹其猛, 等 1 黄杆菌 对溴氨酸脱色的研究 [. 中国环境科学, 2000, 20 4: 332 - . F lav obac te r spJ 336. () 5 庄源益, 辛宝平, 宋文华, 等 1 蒽醌染料中间体溴氨酸降解酶的特性 [. 城市环境与城市生态, 2001, 14 2: 1- 3. J () 环境与开发, 1999, 14 4: 1- 2. 6 辛宝平, 庄源益, 宋文华, 等 1 优势菌对溴氨酸脱色的实验研究[. J () 7 环境化学, 2000, 19 6: 507- 512. 庄源益, 辛宝平, 邹其猛, 等 1 含溴氨酸体系中菌株 的生长及其吸附特性 [. N A X J () 8 李莹, 蔡宝立, 庄源益, 等 1 溴氨酸降解菌株的分离和特性 [. 微生物学通报, 2003, 30 1: 5- 8. J () 9 李莹, 蔡宝立, 庄源益, 等 1 溴氨酸脱色菌的筛选及其特性的初步研究 [. 工业水处理, 2002, 22 2: 22- 24. J () 10 大连理工大学学报, 2000, 40 5: 557- 561. 黄丽萍, 周集体, 杨凤林, 等 1 菌株 降解溴胺酸特性研究 [. 3 H P J 11 () 黄丽萍, 周集体, 田颖, 等 1 动胶菌 利用溴氨酸生长的温度效应 [. 大连理工大学学报, 2002, 42 4: 437- 440. 3 H P J () 12 黄丽萍, 周集体, 王竞, 等 1 菌株 对溴氨酸的降解机理 [. 中国环境科学, 2001, 21 2: 180- 184.3 H P J ( ) 13 黄丽萍, 周集体, 包永明, 等 1 动胶菌 及其胞外酶降解溴胺酸产物的分析 [. 环境科学学报, 2002, 22 3: 364-3 H P J 368. 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S p h in g om on a s spfo rm e r ly P seu d om on a s spK in e t ic m o de l fo r g row th an d b rom am in e ac id 1 . b io deg rada t io n o f st ra in N w a s su gge stedSu b st ra te in h ib it io n a ro se w h en b rom am in e ac id 1 , w a s p ro v ided w ith st ra in N a t h igh co n cen t ra t io n w h ich can f it w e ll w ith an d rew k in e t ic su b2 2. . st ra te in h ib it io n m o de lT h e p a ram e te r s a re e st im a ted w ith no n lin ea r reg re ssio n m e tho dT h e . exp e r im en ta l da ta ve r if ica t io n fo r th e m o de l equ a t io n s is sa t isfac to ryR e su lt s f rom th e m o de l show s Λ an d q w ill reach h igh e st va lu e w h en th e co n cen t ra t io n o f b rom am in e ac id w a s a t 520, 580 ƒ. m gLT h e se exp e r im rn ta l re su lt s w o u ld p ro v ide op t im a l co n d it io n s fo r th e d ispo sa l .tech n ic s o f b rom am in e ac id w a stew a te r Key words: S p h ing om onas sp. sta in N 1; 16S rDN A sequence; k ine t ic s o f b rom am ine ac id b io deg rada t io n