【word】 贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用
贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用
660
中国人兽共患病
ChineseJournalofZoonoses
文章编号:1002—2694(2011)07—0660—03
贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用
商立民,金洪涛,刘全
中图分类号:$8559文献标识码:A
蓝氏贾第鞭毛虫病(giardiasis),简称贾第虫病,
是由蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)引起的一
种以腹泻为主要症状的肠道疾病,也有人称蓝氏鞭
毛虫病(1ambliasis).因贾第虫病曾在国际旅游者
中流行,故又称为”旅游者腹泻”.
自20世纪70年代以来,在世界各地相继发生
了本病的流行或暴发流行,相关的研究也确认贾第
鞭毛虫是导致人类腹泻的最主要寄生性原虫,估计
每年导致约2.8亿人感染一.近年来,在艾滋病患
者中常发现有贾第虫的合并感染,在同性恋人群中
本病亦可互相传播,贾第虫已被认为是一种机会致
病性原虫,其重要性已引起各国重视.由于贾第虫
可感染人和多种野生动物及家养动物,故目前国际
上已将贾第虫病列人人兽共患寄生虫病.
贾第虫病呈全球性分布,据WHO估计,全世
界人群感染率约为1,20,其临床
现复杂多
样,从急慢性腹泻,腹痛,恶心,呕吐,胃肠胀气到无
明显临床症状l2],极易与其他疾病相混淆,从而忽视
或延误了本病的治疗,因此快速,准确诊断对本病的
治疗和监控起着十分重要的作用,本文就贾第虫病
的分子生物学诊断方法及其应用加以综述.
1多聚酶链反应(PCR)
对贾第虫进行鉴定和基因分型的靶基因主要
有:小亚单位rRNA基因(SSU—rRNA),B贾第素基
因(J3一giardin),谷氨酸脱氢酶基因(gdh),一延伸因
子1基因(ef一1),磷酸丙糖异构酶基因(tpi)等.
Rebecca等应用PCR方法检测贾第虫小亚单位rD—
NA基因和传统的检测方法对曼谷204份人粪便和
229份犬粪便进行检测比较,结果显示PCR方法具
有较高的特异性和敏感性.通过对上述贾第虫特
定基因的扩增和序列分析,比较其基因片段的特异
性,对贾第虫进行分型,将其分为了7个有效聚集
体,即聚集体(A—G).Erica等对从灰海豹粪便中提
取贾第虫基因组,用谷氨酸脱氢酶基因(gdh)进行
分型鉴定,在原有的七种聚集体之外发现了第八种
通讯作者:刘全,Email:liuquan1973@hotmail.COFll
作者单位:军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预
防与控制重点实验室,长春l30122
聚集体,即集聚体H,这种新聚集体的发现说明贾
第虫具有更为丰富的遗传多样性和更为广泛的宿主
范围.
2实时荧光定量PCR(Real—timePCR)
Real—timePCR方法能够对特异核酸扩增的全
过程进行连续的实时监测,能够测定样品起始
的核酸含量,从而对样品中含有的虫体数量进行定
量检测.此外,相对于传统的PCR方法Real—time
PCR具有更高的敏感性,而且能够在闭合管内进行
高通量分析,无需对扩增产物进行电泳分析,避免了
样品污染的可能一.
Adriana等用Real—timePCR法与传统的镜检
和抗原检测方法对意大利疑似肠道寄生虫感染的
771份患者粪便样品进行检测,与传统方法相比较
Real—timePCR具有100的特异性和敏感性[7].
Verweij等用Real—timePCR方法对贾第虫小亚单
位rRNA基因进行扩增检测,对104份已知含有贾
第虫包囊的粪便标本检测,102份阳性,特异性达到
98.1;对贾第虫抗原阳性的粪便标本进行检测亦
呈阳性].Binz等应用探针法荧光定量PCR技术
能够检测出0.8个贾第虫滋养体,具有较高的特异
性和敏感性.
3反转录PCR(RT.PCR)
尽管常规PCR方法对样本中存在的贾第虫检
测具有高度的特异性和敏感性,但不能区分包囊是
否具有活性和感染力,因此在对环境样品检测时,需
要建立一种特异的方法来检测环境中样本是否含有
有活性的包囊,由于RT—PCR依赖于mRNA的完
整性,而mRNA的半衰期通常较短,因此完整的
mRNA即可证实活性包囊的存在.应用RT—PCR
方法检测贾第虫mRNA即可检出样品中是否含有
活性包囊.由于包囊在热应激条件下可大量合成热
休克蛋白(hsp)70,因此RT—PCR通常将热休克蛋
白(hsp)70作为目的基因进行检测,能够增加检测
活性包囊的敏感性..
Gyu—Cheol等针对贾第虫的热休克蛋白(hsp)
7O基因
特异的引物对水生系统中有活性的包
囊进行检测,检测的敏感性可达到1个包囊
7期商立民等:贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用661
lOOpI,在热应激的条件下检测的敏感性可以增加
1000倍,这种检测的高敏感性在检测环境样品中是
否含有活性的包囊具有重要意义ll.
4多重PCR(multiplexPCR)
多重PCR是通过在同一PCR反应体系里加上
二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反
应,可以对多种致病因子进行鉴定和检测,具有高效
性,经济性和简便性等特点[1.
StarkD等应用多重PCR技术与real—time
PCR(RT—PCR)相比较用来检测包括贾第虫在内的
4种常见的致病原虫,发现多重PCR与RT—PCR的
符合率达到100,而且多重PCR具有很高的特异
性和敏感性,没有交叉反应发生[=1.TaniuchiM等
应用多重PCR技术对肠道寄生虫检测的敏感性和
特异性分别为83和1()0,故可用此方法对肠道
寄生虫进行筛选_l.
5基因芯片技术(microarray)
基因芯片技术(microarray)是指将成千上万
DNA克隆片段或寡核苷酸片段固定在固体表面(玻
璃片或尼龙膜)上,用荧光或其他标记的mRNA,
cDNA或基因组DNA探针进行杂交,从而同时快
速检测多个基因表达状况,进行DNA分析等的一
种技术,其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂
交技术.基因芯片技术应用于基因表达水平检测的
最大优越性是可自动,快速检测目的材料中成千上
万个基因的表达情况.
Dae—Young等研制了针对小亚基rRNA基因
检测包括贾第虫在内的三种原虫基因芯片技术,其
检测的敏感性可达到5O个包囊/次,该技术能够避
免环境样品中存在的PCR抑制剂对PCR检测的影
响,具有很好的特异性,不与非靶基因发生交叉反应
也无假阴性反应_l.Wang等研制的寡核苷酸徽阵
列技术不仅能够对贾第虫进行检测,而且还能对其
进行基因分型,其高度的敏感性和特异性为大量临
床和环境样品的检测和基因分型提供了一种行之有
效的方法[.
6荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交技术的基本原理是应用荧光标记
的核酸探针与同源互补的靶DNA经变性一退火一复
性,形成靶DNA与核酸探针的杂交体,经荧光检测
体系在镜下对待测DNA进行定性,定量或相对定
位分析.
I.emos等用FISH方法与贾第虫18SrRNA进
行杂交对贾第虫进行检测,Dorsch等针对贾第虫
16SrRNA设计的荧光标记的寡核苷酸探针,利用
rRNA只在有活性的包囊中高效表达的特性,对贾
第虫有活性的包囊进行检测…j,Graczyk等将荧光
原位杂交技术与针对贾第虫细胞壁抗原决定簇的
FITC标记的单克隆抗体技术相结合,能够对贾第
虫有活性的单个包囊进行检测l】.
7环介导等温扩增(LAMP)
环介导等温扩增技术是针对靶基因的6个区域
设计4条特异引物,在具有链置换活性功能的DNA
聚合酶的作用下实现等温条件下DNA分子的核酸
扩增技术,该方法具有特异性高,操作方便等
特点[2.
NagoTT等应用I.AMP技术对贾第虫病患者
的粪便样本进行检测,结果显示检测敏感性为84
(16/19),能够检出的最少虫体数可达到3.12×1o.
个,相对于传统的镜检方法敏感性提高了400倍以
上,从而为临床样本的检测提供了一种高敏感性和
准确性的方法_2.
8展望
分子生物学技术为贾第虫的快速诊断提供了一
个平台,各种检测方法的应用使我们对贾第虫的生
物学有了更进一步的认识.视检测目的不同,采用
不同的检测方法,PCR方法可以对贾第虫进行检
测,基因分型和流行病学调查,Real—timePCR可对
环境样品贾第虫含量进行定量分析,RT—PCR主要
是对环境样品中含有的包囊进行活性和感染力的检
测,多重PCR可同时检测多种寄生虫,基因芯片技
术可同时对多个不同的目的基因进行检测等.随着
分子生物学的迅速发展以及其在贾第虫方面的广泛
应用,将有助于对贾第虫的宿主特异性,传播途径和
流行趋势等方面有更好的了解.
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