第六章 兽药残留检测技术 苯并咪唑类pppt课件

第六章兽药残留检测技术第七节苯并咪唑类药物残留的危害与检测方法.一、概述苯并咪唑类(Benzimidazoles，BEN)是一种驱虫剂,被广泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。自20世纪60年代早期,美国合成噻苯达唑以来,已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑作为第一个商品化的苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。.由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大,且驱虫谱不广,目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物——阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。.苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。苯并咪唑环.苯并咪唑类药物1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太尔(Febantel,FEB)5、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)8、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)9、奥苯达唑(Oxibendazole,OXI)10、氟苯达唑(Flubendazole,FLU)11、三氯苯达唑(Triclabendazole,TCB).1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)别名噻菌灵、特克多、涕必灵、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪,为白色至奶黄色粉末,无臭,味微苦,微溶于水或乙醇,易溶于稀盐酸或稀碱液中,不溶于氯仿或苯中。广谱驱虫药,可能是抑制虫体的延胡索酸还原酶。对动物多种胃肠道线虫均有驱除效果,对成虫效果好,对未成熟虫体也有一定作用。内服吸收快,广泛分布于各组织中。猪、羊、牛给药后2~7h达血药峰浓度。在体内迅速代谢成5-羟噻苯达唑(5-OH-TBZ).犊牛用药后,肾中药物浓度最高,但肝的滞留期比肾长;噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在肝和肾中的残留量分别为57µg/kg、581µg/kg和153µg/kg、19µg/kg；休药6天只有肝中有5-羟噻苯达唑残留量(63µg/kg)；噻苯达唑在肌肉和脂肪中未被检出，但5-羟噻苯达唑在用药后1日内可检出,其残留量分别为肌肉54µg/kg、脂肪64µg/kg。奶牛用药后12h,噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在奶中的残留量分别为5007µg/kg和168µg/kg，84h时分别为20µg/kg和25µg/kg。.2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)别名噻苯达唑酯,为广谱驱虫药。对动物肠道寄生虫和肺蠕虫有明显作用。制剂有混悬剂、糊剂或饲料粉的形式。内服后在体内迅速代谢,原药和代谢物主要经胆汁排泄,尿中占给药量的25%,其中原形的不足5%。牛内服后30日内,肝中可检出残留物,其中一部分为结合态。坎苯达唑有致畸性,因此休药期要求适当的延长。牛休药期21天,羊休药期28天。.3、苯硫脲酯(Thiophanate)别名硫菌灵、硫苯尿酯,属苯并咪唑的前体药物,即在动物体内转变成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而发挥驱虫作用。本品为微黄棕色结晶性粉末,在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶,在环己酮中易溶。动物制剂有混悬剂和丸剂两种,或用作饲料添加剂。广谱驱虫药,对大多数动物的胃肠线虫成虫及幼虫均有良好效果。内服吸收快而完全,8h达血药峰浓度。用药后24h,几乎能从所有组织器官中(特别是肝、肾)测出药物。用药后72h内,大部分药量经粪和尿排出体外。.畜禽用药后,残留量在肝和肾中较高,而其他可食组织中相对较低。绵羊一次内服100mg/kg后休药1日,肝、肾、肌肉和脂肪中的残留量分别为930µg/kg、1060µg/kg、670µg/kg和2930µg/kg;休药3日后均低于100µg/kg。犊牛一次内服100mg/kg后休药7日,肝、肾和肌肉中的残留量均低于200µg/kg。猪一次内服75mg/kg后休药1日,肝、肾、肌肉和皮/脂肪中的平均残留量分别为5550µg/kg、6600µg/kg、2600µg/kg和16200µg/kg;休药3日分别为180µg/kg、100µg/kg、<100µg/kg和250µg/kg;休药7日组织中残留均低于100µg/kg。奶牛一次内服100mg/kg后休药6h、20h和30h,奶中残留量分别为440µg/kg、320µg/kg和140µg/kg;休药44h奶中未检出残留量(方法检测限50µg/kg)。.4、非班太尔(Febantel,FEB)别名苯硫氨酯,为无色粉末,在丙酮、氯仿、四氢呋喃和二氯甲烷中溶解,在水和乙醇中不溶。非班太尔(FEB,属苯并咪唑类前体药物,内服后在胃肠道内迅速代谢为芬苯达唑(FBZ)及其砜类化合物(FBZ-SO和FBZ-SO2),FBZ-SO又称奥芬达唑(OFZ),原药在体内浓度很低。代谢物的驱虫活性比母药非班太尔要强得多,而发挥有效的驱虫效果。非班太尔在美国已批准用于各种动物的驱线虫药,以复方制剂上市,如用于犬、猫的产品多与吡喹酮等配合,以扩太驱虫范围。.牛内服后18h,肝中约占总残留量的90%,其中芬苯达唑30%~41%,奥芬达唑4%~19%,奥芬达唑砜14%~15%,非班太尔3%~6%,以及一些微量的氨基代谢物。休药10日,肝中残留量下降很多,其中以结合态的约占75%。鼠、羊、牛和猪内服后,组织中的残留量依次为肝>肾>脂肪>肌肉。.5、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)别名硫苯达唑、苯硫达唑，无臭无味，在二甲基亚砜中溶解，在甲醇中微溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。为广谱、高效、低毒的新型苯并咪唑类驱虫药。它不仅对动物胃肠道线虫成虫、幼虫有高度驱虫活性,而且对网尾线虫、矛形双腔吸虫、片形吸虫和绦虫亦有较佳效果。芬苯达唑在国外,不仅用于各种动物,甚至还有野生动物的专用制剂。由于芬苯达唑溶解度较低,因而给动物内服时吸收极少,如给绵羊、牛、猪内服因吸收少,经粪便排泄的原形药约占44%~50%,而经尿排泄的不足1%。.吸收后芬苯达唑在动物体内迅速代谢为芬苯达唑亚砜(FBZ-SO)即奥芬达唑(OFZ)、芬苯达唑砜(FBZ-SO2)、芬苯达唑-2-氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代谢物。原药和代谢物主要经胆汁排泄。在绵羊体内的代谢产物,由胆汁分泌后可再经肝肠循环。猪用药5mg/kg后休药7天,肝中母药残留量为0.28mg/kg,其他无组织残留。.牛用药10mg/kg后休药2天,肝、肾、肌肉和脂肪中的母药残留量分别为8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和0.95mg/kg;休药7天,只在肝中能检测到残留量0.67mg/kg。奶牛内服10mg/kg后,12~24h奶中芬苯达唑浓度达峰值,休药7天降至100µg/kg;12h芬苯达唑亚砜浓度达峰值,然后迅速下降,96h时未检出;48h芬苯达唑砜浓度达峰值,96h时未检出。鳟鱼内服后,在体内部分代谢为奥芬达唑,并蓄积于鱼皮中。母药和奥芬达唑的消除期分别为96h和24h。芬苯达唑砜代谢物在鱼体内几乎没有。.6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)别名磺唑氨酯,为白色或类白色粉末,有轻微的特殊气味,在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。奥芬达唑为芬苯达唑的衍生物,属广谱、高效、低毒的新型抗蠕虫药,其驱虫谱大致与芬苯达唑相同,但驱虫活性更强。奥芬达唑与阿苯达唑同为苯并咪唑类中,属内服吸收量较多的驱虫药。但反刍兽吸收量明显低于单胃动物,而且舍饲反刍兽比放牧时吸收量多。牛用药后10~18天,牛肝中残留量从55.5µg/kg降低至10µg/kg。羊用药后10~24天,羊肝中残留量从476µg/kg降低至12µg/kg。奶牛内服2.5mg/kg后1天,奶中的残留量为最高(0.49mg/kg),休药8日则降低至0.005mg/kg;在48~72h内奶中主要代谢物为芬苯达唑砜。休药期为牛11天、羊21天,产奶期禁用。.7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)别名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,为白色或类白色粉末,无臭,无味,在丙酮或氯仿中微溶,在乙醇中凡乎不溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。高效广谱驱虫药,系苯并咪唑类药物中驱虫谱较广、杀虫作用最强的一种,对各种线虫、绦虫均有高度活性,对虫卵发育也有显著抑制作用。因不溶于水,故在肠道内吸收缓慢。.原药在动物体内的主要代谢产物为阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑-2-氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者为杀虫的活性成分。在体内分布量依次为肝、肾和肌肉占内服后血药达峰时间为2~4h,并且持续15~24h。原药与亚砜代谢物在血中的浓度极低,半衰期为8.5~10.5h。24h内约85%的给药量经肾排出,13%随粪排出。.牛和羊残留消除研究明,用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很大,刚开始时主要为亚砜代谢物,接着是砜类和氨砜类代谢物。用药后在日内牛肝和牛肾中的残留物有95%为结合态,但羊组织中结合态代谢物很少。奶牛内服10mg/kg后,12h奶中亚砜代谢物残留量达峰值,然后迅速下降,36h时未被检出;24h砜类代谢物残留量达峰值,但消除缓慢,需156h可排净;氨砜代谢物在奶中的量很低,36h达峰值,消除期180h。其他代谢物在服后24h达峰值,48h时低于方法的检测限,但消除期为156h。.8、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)别名甲苯咪唑,为白色、类白色或微黄色结晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中极微溶解,在水中不溶。为广谱驱虫药,不仅对动物多种胃肠线虫有高效,而且对某些绦虫亦有良效,并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之一。甲苯达唑早在20世纪80年代已广泛用于世界各国的医学和兽医临床。.内服后胃肠道吸收差(5%~10%),吸收后迅速分布于血浆、肝、肺等,血药达峰时间为2~4h,半衰期2.5~5.5h。在动物肝内很少代谢,代谢物为极性很强的羟基(MBZ-OH)和氨基代谢物(MBZ-NH2)。在24~48h内经粪便排泄的原形药物约占80%左右,经尿排泄的约为5%~10%。吸收后药物,仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。.二、组织中苯并咪唑残留和限量苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药物本身有关外,还与给药途径、靶组织和消除期有关。标志残留定义为母体药物及其主要代谢产物的总和。阿苯达唑：ABZ用药后,在停药初期,残留物主要为ABZ-SO和ABZ-SO2;而在较长的停药期,主要残留物为ABZ-NH2-SO2,因此标志残留为ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的总和,以ABZ计。对FEB、FBZ和OFZ,标志残留为FBZ、OFZ(FBZ-SO)，和FBZ-SO2的总和,以FBZ-SO2计。药物消除研究表明,OFZ和FBZ-SO2是组织中最常见的残留物。.在蛋中,氟苯达唑FLU标志残留主要为母体药物,而在鸟类和猪可食组织中标志残留为FLU和FLU-HMET,因此以FLU和FLU-HMET的总量来定义FLU的标志残留。甲苯达唑MBZ标志残留定义为MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2的总和,以MBZ计。残留消除研究表明,MBZ-NH2和MBZ-OH是组织中最持久的残留物,对最高残留限量(MRL)的影响最大。噻苯达唑TBZ标志残留定义为TBZ和5-OH-TBZ的总和。在动物可食组织中,TBZ的母体药物是最常见的残留物,但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯结合物为主要残留。.三氯苯达唑TCB标志残留定义为TCB、TCB-SO和TCB-SO2的总和。TCB禁止用于泌乳期动物,由于TCB-SO2消除时间长,因此它可以作为残留监测的目标化合物。奥苯达唑OXI标志残留为母体药物。其他苯并咪唑类药物,如CAM、LUX、PAR和BEN,在欧盟禁止用于动物源食品,因此欧盟未规定MRL值。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)。.部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL).三、样品处理苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性,在适当的pH条件下,分子可以质子化(pKa约5~6)或去质子化(pKa约12)。在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶于水性溶剂,并被提取,然后调节pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范围内都能电离,易溶于酸性或碱性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。.对于CAM、TCB和TCB代谢产物,它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时,控制溶液的pH值尤为重要。三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、TCB-SO2和CAM分别在pH7.3~10.9、5.0~9.0、3.8~8.0和7.4~11.1呈中性,因此,只有当pH7.4~8.0时,所有这些分子都呈中性。大部分苯并咪唑类药物在pH8时都呈中性,当预测某些苯并咪唑类药物的pKa约为8时,这时欲对这些组分同时提取变得相当困难。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH>8.6和8.3,以非电离形式存在。.1、水解肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80~110℃,在1~4h即可完成水解。酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而被广泛采用。.酶水解酶水解通常使用β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于一定温度下孵育18~72h。与酸水解相比,酶水解比较温和,一般不会引起药物的分解,但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。.Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏1h)水解,释放出游离的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等对TBZ在蛋鸡和奶牛中代谢产物进行了研究,发现结合物主要是硫酸酯结合物。Markus等对肝样中的ABZ及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解,释放出游离的ABZ-NH2-SO2。Coulet等对组织中的TBZ蛋白结合物用碱解方法水解。.2、提取及净化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。.例如MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH>7.5时,这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的-OH,其pKa为9.8,在pH<7.8时不被电离。因此,溶液只有在pH7.5~7.8间,所有化合物不被电离,呈中性,这时可用极性溶剂(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)来提取。.(1)血浆、血清或其他生物液体生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。Bogan等将血浆样品调节至pH7.4,用乙酸乙酯来提取FBZ、OFZ和ABZ。Hoaksey等将血浆样品用乙腈脱蛋白,再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。Alvinerie用乙酸乙酯提取血浆中TCB、TCB-SO和TCB-SO2,以及TBZ和5-OH-TBZ,直接用HPLC-UV测定。.Allan等将血浆样品用酸性溶液稀释后过C18小柱,依次用20mL水、0.5mL甲醇+水(40+50)和0.4mL甲醇淋洗,最后用1.6mL甲醇洗脱,甲苯达唑及其代谢物的回收率大于80%。Hennessy等将这一方法用于胆汁中TCB的提取,但样品过柱前先用乙酸乙酯提取,后来也用于血浆样品中ABZ的提取。自动萃取仪具有省时、省力、重复性高的优点,应用日趋广泛。Rouan等采用自动萃取仪、C18固相萃取柱提取/净化血浆样品中TCB,回收率可达到90%以上。.(2)组织动物组织中的苯并咪唑类提取一般用有机溶剂,并经LLP和SPE净化。有人采用LLP和SPE相结合方法进行净化,用HPLC-UV检测。也有人采用LLP的单一净化方法,用选择性高的荧光检测或LC-MS/MS检测。虽然LLP净化方法选择性较差,但适合于苯并咪唑类的多组分提取,而用复杂的净化方法可能回收率较低。.Brandon等用二甲亚砜-水(10+90)来提取肝组织中的TBZ,在ELISA测定前用PBS稀释。Brandon等采用类似的方法,用二甲亚砜-水(10+90)提取肝组织中11种苯并咪唑类残留,包括水溶性低的FBZ。Marti等用乙腈提取肌肉、肝脏、肾脏组织中8种苯并咪唑类残留,提取物用LLP净化,包括正己烷、饱和氯化钠和二氯甲烷洗涤,然后用C18固相萃取柱浓缩/净化,再用HPLC-UV或GC-MS分析,除OFZ外,回收率均在65%以上,OFZ在肝脏和肾脏中的回收率仅为45%和39%。.Farrington等用乙酸乙酯提取肝组织中5种苯并咪唑类残留,并用酸性氧化铝和C18柱净化,HPLC-UV分离测定,回收率在73%~90%。Blanchflower等用甲醇-水(20+7)提取肝和肌肉组织中FBZ和OFZ,提取液用石油醚洗涤,经磷酸盐缓冲液稀释后,再用乙醚-乙酸乙酯(60+40)洗涤,FBZ和OFZ的回收率大于80%和70%。Wilson等用乙酸乙酯提取肌肉和肝组织中8种苯并咪唑类残留。Wilson方法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的提取/净化。.Hajee等对鳗鱼肉的均质液用磷酸盐缓冲液调节至pH7.5,发现只有在pH7.5~7.8之间,所有的MBZ标志残留物(MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2)呈中性,能被乙酸乙酯提取;在SPE净化中分别采用正相和反相柱,发现氨基丙基柱较合适;在过氨基丙基柱前,先用正己烷调节乙酸乙酯提取液的极性,上样后,氨基丙基柱用异辛烷淋洗,再用甲醇洗脱;MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分别为80%、60%和85%。Cannavan等用乙酸乙酯提取肝、肾和肌肉组织均质液(调节至pH7.0)中TBZ和5-OH-TBZ,过氰丙基(CN)SPE柱,TBZ和5-OH-TBZ的回收率分别为96%~103%和70%~85%,若采用氘化TBZ作为内标物,可提高5-OH-TBZ回收率的重现性。.Capece等在pH8.0条件下用乙酸乙酯提取肌肉、脂肪和肾脏组织中的FBZ标志残留物,提取液直接HPLC分析。DeRuycke等在碱性条件下用乙酸乙酯提取鸡蛋和肌肉组织中FLU、FLU-HMET和FLU-HMET,提取液蒸干,再用甲醇和正己烷进行液-液分配净化,LC-MS/MS分析,FLU标志残留物的回收率在70%(鸡蛋)~87%(肌肉)之间。Edder等在碱性条件下从肝脏和肌肉中提取了11种苯并咪唑类药物和左旋咪唑残留,用MBC作为内标,提取物经甲醇和正己烷液-液分配净化,回收率大于70%。等等.(3)牛奶和奶制品奶制品相对于组织样品要容易处理些,而且牛奶含更少的色素和内源性干扰物。牛奶样品一般要脱蛋白和脂肪预处理,再调节溶液pH值,用水不相溶的有机溶剂(如:乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷)来提取,pH值的选择与被测物的种类和数量有关。.例如Tocco等发现在pH6时,用乙酸乙酯可提取牛奶中TBZ和5-OH-TBZ。Fletouris等发现在pH9.8时,用乙酸乙酯提取牛奶中ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的效果最好,回收率分别为81%、78%和100%。后来他们在pH10时,用乙酸乙酯提取牛奶中10种苯并咪唑类残留,比较了不同的pH值(3~11.5)对提取效率的影响,发现pH10时大多数苯并咪唑类药物的回收率较高,平均回收率为79%~100%,FBZ的回收率为56%~66%。Flotouris等还试验了在pH2~9条件下用乙腈提取,FBZ的回收率接近100%,表明用乙腈提取时,pH值的变化对提取效率影响不大。.牛奶中多残留分析的提取和净化方法.三、分析方法苯并咪唑类药物残留的测定方法主要有生物检测法、分光光度法、薄层色谱法、免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法，采用紫外、荧光和质谱检测。.1、生物检测法生物检测法曾被用来检测食品中苯并咪唑类残留,但现在大部分用来评价驱虫剂的效能。生物检测法首先用TLC板将残留物分离出来,然后用含培养剂和生物指示剂的溶液喷雾TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的区域表明药物残留的存在,抑制区域的大小与残留物的浓度有关。.Erwin等建立了一种检测BEN的生物学方法；Peterson等建立了农作物中BEN和MBC的生物检测法,提取液通过硅胶TLC板分离BEN和MBC残留物,随后用琼脂和青霉素芽孢混合液喷雾,室温培养20h,生物检测法的灵敏度比紫外分光光度法高出十倍左右。Dew等利用猪蛔虫幼体对TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ敏感性,建立了一种生物筛选法;生物检测法作为检测食品中苯并咪唑类残留的筛选方法,具有成本低的优点,但生物体对苯并咪唑类药物的敏感性差异很大,实际应用中还需作进一步的评估。.2、分光光度法采用分光光度法测定农作物中的BEN残留。Pease等先将BEN转化为2-氨基苯并达唑(2-AB),然后用溴衍生化,再进行荧光光度法(λex285nm,λem335nm)或紫外-可见分光光度法(445nm)测定,检测限为100µg/kg。2-AB、TBZ和2-(2-呋喃)-苯并咪唑本身具有荧光,然而只有2-AB与溴反应可产生有色衍生物。因此,溴化后通过紫外-可见分光光度法测定,可区别2-AB和其他苯并咪唑类药物。Aharonson等采用柱层析法净化农作物中的BEN和TBZ残留,再用荧光光度法测定。.Baeyens等利用MBZ和FLU在碱性条件下与0.3%过氧化氢反应产生荧光,检测了制剂中药物含量,这一方法也可用于四咪唑、右旋咪唑和左旋咪唑的检测。.3、薄层色谱法TLC作为半定量分析方法,适合于食品中苯并咪唑类残留检测的筛选。Norman等采用TLC和荧光检测法(λex302nm,λem360nm)测定柑橘类水果中的TBZ。White等采用TLC法检测农作物中MBC残留,板上喷雾一层荧光指示剂,用氯仿-醋酸盐-乙酸混合溶剂(190+10+4)展开,在254nm处紫外检测,检测限为50µg/kg。Corti等采用TCL法检测马铃薯中TBZ和其他残留物,样液滴加在C8板上,用乙醇-水(10+3)展开,在248nm处紫外检测,但这种方法的灵敏度比高效液相色谱法低。.Corti等还采用TLC法还测定了水果中BEN、MBC和TBZ,以氯仿-环己胺-甲醇(6+1+01)作展开剂,在NH2-HPTLC板上将MBC和TBZ的残留物分离出来,285nm处紫外检测。Abjean等建立了TLC法检测肝组织中ABZ-NH2-SO2的筛选方法,以乙腈-氢氧化铵(10+0.6)作展开剂,在涂有荧光指示剂的硅胶板上将ABZ-NH2-SO2分离出来,检测限低于500µg/kg。.4、免疫分析法免疫分析法是一种简便、灵敏、选择性高的检测方法。一般情况下,生物样品如血浆、血清、牛奶能够直接测定或者稀释后测定。早期,放射免疫法被应用于测定动物组织和农作物中的苯并咪唑类残留。Nerenberg等建立了放射免疫法检测血浆中的OFZ,多克隆抗体通过兔免疫接种OFZ和多聚赖氨酸载体培养得到,后来这种方法应用于绵羊脂肪组织中OFZ残留的检测。Newsome等采用多克隆抗体、放射免疫法检测农作物中BEN及其主要代谢产物MBC,多克隆抗体通过兔接种半抗原-2-氨基苯并咪唑和人血清蛋白培养得到。.ELISA检测近来,ELISA被普遍应用且大大超过了放射免疫检测法。Brandon等建立了一种竞争性ELISA法检测肝组织中的TBZ残留,单克隆抗体通过鼠接种TBZ和5-OH-TBZ半抗原,在牛血清蛋白(BSA)中培养得到。他们发现,用TBZ免疫得到的抗体对TBZ和5-OH-TBZ特异性高,而用5-OH-TBZ免疫得到的抗体特异性较差,对CAM和TBZ-NH2有交叉反应。对不含噻唑环的苯并咪唑类药物(如:ABZ、MBZ和FBZ),结果表明没有明显的交叉反应。.基于辣根过氧化物酶结合(HRP)的竞争性ELISA法已被用于肝组织提取液以及水果、蔬菜和果汁中TBZ的检测,果汁样品稀释后可直接检测。Brandon等研制出一种鼠单克隆抗体,通过鼠接种ABZ的琥珀酰胺半抗原和BSA载体制得的抗体,对11种苯并咪唑氨基甲酸酯有良好的交叉反应,包括ABZ、FBZ、OXI、MBZ、FLU、MBC和一些代谢产物,但对噻苯达唑类(TBZ、CAM和5-OH-TBZ)没有交叉反应。另外,他们还建立了一种基于辣根过氧化物酶结合的竞争性ELISA法,用来检测牛肝提取液中的苯并咪唑残留,后被用于牛奶中FBZ残留的检测;牛奶样品测定前用PBS-Tween-BSA稀释。.Bushway等应用ELISA试剂盒对加工或未加工的果蔬中TBZ残留检测进行了评估,用BEN-MBC半抗原制得的多克隆抗体对TBZ有显著交叉反应,可被用于食品中的检测。Newsome等建立了ELISA法检测农作物中BEN和TBZ残留,多克隆抗体通过兔免疫接种制得,抗原是由人血清蛋白和TBZ、MBC(BEN的降解产物)的琥珀酰胺半抗原相偶合得到。Crooks等研制出一种多克隆抗体,对8种苯并咪唑氨基甲酸酯类药物有交叉反应。以ABZ琥珀酰胺和HAS载体蛋白偶合物作为抗原,抗体通过羊免疫接种制得,建立了基于HRP的竞争性ELISA法检测牛肝组织中的苯并咪唑类残留。.5、气相色谱法只有少数苯并咪唑类药物(如:TBZ、5-OH-TBZ)可直接用GC法分析。Lafuente等采用硅酮键合相的毛细管柱(10m×0.53mm)分离水果中TBZ残留物,分别用氮磷检测器(NPD)和电子捕获检测器(ECD)检测,发现NPD检测的灵敏度更高,LOD为10µg/kg。Oishi等采用GC-NPD法检测TBZ,石英毛细管柱(25m×0.2mm)分离,LOD为10µg/kg。大部分苯并咪唑类药物极性较高,难以气化,热稳定性差,故GC法分析需要衍生化。.衍生化由于苯并咪唑类分子结构上含氨基和羟基,可与衍生剂发生酰化、硅烷化和烷基化反应。常用的酰化衍生剂有三氟乙酸酐(TFA)、七氟丁酸酐(HFB)和五氟苄基酰氯(PFB-CO-Cl);硅烷化试剂有N,O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)和N-甲基-(三氟乙酰胺)(MBTFA);烷基化衍生剂有碘甲烷、溴代五氟苯、五氟苄基溴(PFB-Br)、二甲基乙缩醛-二甲基甲酰胺(DMA-DMF)和氢氧化三甲基苯胺(TMAH)。.另外也可以将氨基甲酸酯官能团水解后形成氨基,再进行酰化、硅烷化和烷基化反应。衍生物经GC分离后,可采用电子捕获检测、氮磷检测和质谱(MS)检测。Jacob等用N,O-双三甲硅基乙酰胺衍生化GC-MS法,测定了TBZ残留物的光分解产物,后来用相同的方法证实了尿中CAM代谢物的结构式。VandenHeuvel等建立了柱上甲基化衍生、GC-MS法测定CAM残留物,进样前残留物溶解于0.125mol/L的三乙基氢氧化铵的甲醇溶液中。.Tanaka等用GC-FID法测定TBZ的甲基衍生物,衍生化是通过在乙腈中二甲基甲酰胺和二甲基乙缩醛反应(120℃、40min),该方法可检测出水果中TBZ残留量100µg/kg。Physalo等将BEN通过乙酸酐衍生化(100℃、30min),毛细管GC-NPD测定,检测限10µg/kg,但采用GC-ECD检测,灵敏度约降低10倍。Bardalaye等对Physalo的方法作了改进,用来检测水果中的TBZ残留。Markus等建立了衍生化GC-MS-EI法测定组织中的ABZ-NH2-SO2残留。Balizs等用PFB-Br衍生化,毛细管GC-高分辨质谱法(HRMS)测定组织中的TBZ和ABZ残留。.6、液相色谱法HPLC法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的分析,通常采用反相柱如C18、C8柱分离,也有采用正相柱如uBondapakNH2柱分离。存在问题：采用硅胶基质的RP-HPLC法测定苯并咪唑类时,硅胶键合相表面残余的带负电荷硅醇基能强烈吸附苯并咪唑类药物,导致保留时间过长、峰拖尾或变形。当流动相在弱酸性或中性时(pH5~7),苯并咪唑类的离子化被抑制,最后出峰的组分保留时间较长,峰展宽严重;当流动相为酸性时(pH2~3),苯并咪唑类的离子化增强,先出峰的组分容易分离,但后出峰的组分拖尾严重。.解决办法：为降低游离硅醇基的吸附作用和增加苯并咪唑类药物在流动相中的溶解性,可采取离子抑制或离子增强的方法来解决。通过调节流动相的pH值、加入离子对试剂、掩蔽剂、盐和较高比例的有机改性剂等,对流动相进行优化。例如,在酸性流动相中加入四丁基铵阳离子,可改善苯并咪唑类的色谱性能,消除峰变形,提高分辨率。.早期,分离柱有采用硅胶柱或阳离子交换柱。Karlaganis等用硅胶柱分离血浆中的BNZ,以乙腈-氯仿饱和水溶液-甲酸(75+92.5+0.25)作流动相。Alvinerie等用硅胶柱分离TCB、TCB-SO、TCB-SO2和OFZ,在15min内获得良好的分离。Kirkland等用阳离子交换柱分离植物和土壤中的BEN残留。Arenas等用强阳离子交换柱分离牛奶中的TBZ和5-OH-TBZ。.Bogan等最早采用C18柱分离8种苯并咪唑类残留,分析时间14min,但分离度较差。Long等和Wilson等分别建立了多残留RP-HPLC法分离8种苯并咪唑类药物,分析时间为35min,采用梯度洗脱,可改善分离度。Rose用C8柱、二元泵梯度洗脱,35min内分离OFZ和9种代谢产物。Roudaut等用C18柱,二元泵梯度洗脱,分离了10种苯并咪唑类残留,除OXI和OFZ外,所有残留物在16min内获得分离。.Negro等采用离子对色谱法分离血浆和尿中TCB-SO和TCB-SO2,考察了影响色谱性能的实验参数,如溶液pH、有机改性剂含量、离子对试剂(烷基磺酸钠)的烷基链长,结果表明,最适宜的流动相为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)-乙腈(55+45)含0.001mol/L癸烷磺酸钠。DeRuyck等建立了离子对色谱法分离FBZ、TBZ、ABZ、OXI和LEV残留的方法,采用梯度洗脱,辛烷磺酸钠作为离子对试剂,用磷酸调节流动相pH3.5。.检测器苯并咪唑类及其代谢物在245nm和295nm处有强的吸收,可用紫外检测。在295nm处摩尔吸收系数相对较低(>10000),但干扰少,吸收峰稳定、灵敏度足够,应用较多。对于本身有荧光的化合物,如阿苯达唑及其代谢物和噻苯达唑及其代谢物,可用荧光检测,内源性杂质干扰小、检测灵敏度高。光电二极管阵列检测(PDA)可提供化合物的吸收光谱图(200~700nm),与标准品谱图进行对照,可对样品作出初步的定性判断。.PDA检测器价格低廉、应用广,但在专一性和灵敏度上欠高,特别在检测动物组织中痕量的药物残留时有一定局限性。质谱检测(MS)特别是串联质谱检测(MS/MS)作为通用型检测器,具有高灵敏和高选择性的优点,能提供化合物的结构信息,予以定性确证,在残留分析中的应用日趋广泛。LC-MS通常采用短柱((150mm)分离,色谱柱平衡时间短,适合样品的高通量分析。.Blanchflower等采用LC-MS法测定FBZ和OFZ残留,发现等度洗脱比梯度洗脱重复性好。Cannavan等采用梯度洗脱来分离TBZ和5-OH-TBZ,流动相由乙腈和0.1mol/L醋酸铵组成。Balizs建立了15种苯并咪唑残留测定的LC-MS/MS方法,采用细直径柱(2.1mm)分离,流动相流速为0.04~0.2mL/min,苯并咪唑类药物在6min内出峰,但没有达到完全分离。DeRuycke等建立了LC-MS/MS法测定蛋和肌肉组织中苯并咪唑残留,包括FLU、FLU-HMET和FLU-RMET。后来,他们还检测了牛奶中左旋咪唑和7种苯并咪唑类药物的残留。.