抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡

抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡 抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡 f27一lz 陈明等抗F雎抗体诱导^肾小球系膜细胞揭12第3期 抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡 陈明0厶刘晓惠黄颂敏屈燧林刘先蓉许国章刘聪 酋葚科第一医院肾病科,成都61oo41) 卿.6 392.12, 中国图书分类号R 摘要目的:研究抗Fas抗体对人肾小球系膜细胞的致凋亡作用,探讨Fas—FasL在肾脏损伤中的作用.:常规方法 分离,培养人肾小球系膜细胞(Mcs),并传代鉴定,用不同浓度的抗Fas抗体(0,2,5,10~/m1)刺激4—6代?,Ics16h后,荧光染 色观察凋亡变化,二苯胺法和DNA凝腔电泳方法定量和定性分析hI髑DNA片段化变化.结果:抗Fas抗体可诱导Mcs揭 亡,且致凋亡效应呈依赖性关系.结论:Fas.FasL系统在Ncs揭亡中起着重要作用. 关键词FFasL生生莲唑r卜族南参田日毛寸习亡 Anti-Fasantibodyinduceapoptosisinculturedhumanglomerularlnesangialcells CHEN舾,删Xiao-Hui,HUANGSong-Minet.珈moyNephrology,theFirstUnitersHo~pitatFCes~China UniversityofMedicalScience,Cher..gdu610041 Ab曲州咧eve:_r0investigatedn:echar6~mainducingaosisofhuman衄arrr瞄aIalcells(Mcs)byanti一andbody. Mellxids:/elseweeulmredwithanti-Fasantibody(anti.F鹧Ab)atdifferenteoncenlxatiortsf0r16llrs.Apoptc~-isofMcswasevaluatedand qtu~edby~erldlng姐噼(AO)~tainedandDNAfrag~entalionassay.RI:Anli-F~anb0dy?foundtobeabletoinduceapopi~sis ineuhurehur~m瑚娜dcellsandtileeffectofanti?Fasarb0dyinducingapopme,i~wasd晒 e_de1den1cc虬d帅:anditsligand ?l11dplayaanroleintheiIlj1ryofhumand?arcell K姆K出Fa吕.Fl舳LAnli-F~andb0dyH【衄me咖alcell 细胞凋亡在肾脏疾病的发生和发展过程中起重 要作用,但其机制尚不清楚..研究明Fas抗原 存在于多种细胞表面,一旦被激活可介导细胞凋 亡.本文拟用Fas配体(眦)的协同剂——抗Fas 抗体研究Fas-F~L系统对人肾小球系膜细胞(Mes) 的作用,旨为研究肾小球疾病开拓新的理论思路 : 1材料与方法 取新鲜正常人肾组织在无菌条件下去除肾包 膜,按湛氏的方法重叠过筛分离并用?型胶原酶 (Si胂Chemicalco)(300U/m1)消化肾小球用RP MJl64o培养肾小球,直到细胞布满瓶底后,用0.25% 胰蛋白酶.EDTA(Slgm~ChemicalCo)消化细胞后传 代培养.取第4,6代细胞经形态学鉴定(相差显微 镜,透射电镜,扫描电镜)及抗胸腺细胞抗体,抗 I)esmin抗体免疫荧光鉴定证实为系膜细胞(Mcs) 后.取第4,6代?,以lx104,孔接种于24孔培 养板上,待细胞贴壁过夜后,换成无血清tlPMI1640 ?现工作于泸州压学院附属医院肾内科,泸州646000 作者简介:陈明,男.31岁,内科学硕士; 黄顼敏.女,副教授.硕士导师.主要研究糖尿病肾病 液,继续孵育48h,使细胞同步于G期,去上清液后 分成对照组,实验组A,B,c4组,分别加入羊血清 I2II11,抗Fas抗体(SantaCraaCo)2,5和1O II11各1ml,继续培养16h.收集Mes作下列捅亡检 测(A0). 1.1/~Ias凋亡的形态学观察将2吖淀橙染液 (100rII11)加50阻待观察Mes悬液中充分混匀后, 再加入L%多聚甲醛溶液4o1固定细胞后,于24h 内荧光镜下(以细胞出现核浓缩或核碎裂为细胞凋 亡)计数每份标本出现凋亡的细胞数[每份标本 至少计数2130个细胞,计算凋亡率(%)]. 1.2DNA片段化率的测定用二苯胺测定方法, 用Bio-Ra也?型比色仪在590nm波长下比色测定每 份标本I)NA片段化率(%) 1.3I)NA凝胶电泳取实验后Mes悬液,4~e离心 (500r/rain)PBS洗涤后,加入等体积裂解缓冲液(5 rrm~l/LTrisHCI,pH8.0,100rrmM]LNaC1,100rrmaolfL ElYrA,I%SDS,2130II11蛋白酶K)充分混匀,37? 孵育12h后按传统酚.氯仿.异戊醇抽提I)NA方 法',收集Mcs的I)NA,在L.6%凝胶中160mV电泳 2h后,观察DNA条带分布情况.Mcs细胞凋亡率, McsDNA片段化率用?s(%)表示,用配对z检验 及直线相关进行统计学处理. 2结果 形态学观察表明抗Fas抗体能诱导Mcs凋亡, 细胞凋亡率随抗Fas抗体剂增加而增高.Mcs的 I)NA片段化定量分析显示McsDNA片段化率与抗 Fas抗体浓度呈直线正相关(Y=10.20+4.6X,r= 0.972,P<0.001)(表1);McsDNA电泳分析表明抗 Fas抗体可致Mcs的DNA呈不同程度"梯形"改变, 而对照组Mcs的DNA断裂不甚明显(图1). 表1抗Fas抗体诱导Mes凋亡DNA片段化率和凋亡细胞 计数的定?分析 Tab.1DNAfragmentationofMcsapoptosisinducedbyanti. Fas2tllll']l~w舔qI班IItIaanaly,~s Control 10pg/mlAnti?FasAb 5/mrAnti-FasAb 2Itg/mlAnti—FasAb Marker 圈1抗Fm抗体诱导Mcs凋亡的DNA凝肢电泳分析 Fig.1DNAfragn~maUonofMesapopto~inducedbymarl- Fasmaibodywasqualityanalysls 3讨论 细胞凋亡是多细胞机体的重要生理,病理过程, 主要表现为细胞核的皱缩,染色质浓聚,碎裂,DNA 片段化这种现象贯穿于'肾脏正常生理及疾病发生 的全过程….文献[2]报告Fas.FasL系统可通过细 胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导细胞毒性作用和对免 疫应答的调节作用而参与机体的细胞凋亡过程. Wong等报告Fas抗原不仅存在于淋巴细胞,巨噬细 胞表面,也存在于肝,肺实质细胞表面.本实验通 过用FasL的协同剂——抗Fas抗体与Mcs共同培养 16h,细胞形态学角度观察到抗Fas抗体导致Mcs 核浓缩,核碎裂,与正常对照组比较存在明显差异 (尸<0.01),从McsDNA裂解片段化的定性分析可 中国免疫学杂志t999年第15 见受刺激后Mcs的DNA呈"梯形"分布.Mcs的DNA 片段化的定量分析也有相同结果这些结果充分证 实抗Fas抗体对Mcs具有致凋亡作用,间接证实了 Mcs膜表面存在着Fas抗原,与文献『6]报告的抗Fas 抗体可诱导鼠肾小球系膜细胞凋亡的结果相似 Los等认为Fas抗原存在于细胞表面的特定区域.一 旦被FasL或类似物激活,可通过白细胞介素转化酶 或Ced-3基因产物转移凋亡信息人细胞内,产生类 似于原癌基因或化学药物的物质作用于细胞DNA. 或者导致类似CTL反应作用于细胞DNA,使其裂解 而致细胞凋亡.可见细胞凋亡不仅受细胞本身的 Ced-3,Bc1.2基因控制也受Fas.FasL系统的调控 本实验使用不同浓度的抗Fas抗体刺激人肾小 球Mcs,发现Mcs凋亡与抗Fas抗体剂量呈正相关, 与Ogaswaza等报告不同剂量的抗Fas抗体诱导大鼠 肝细胞凋亡的实验结果相似 综上所述,抗Fas抗体可通过激活Mcs膜上的 Fas抗原,导致剂量依赖性的Mcs凋亡.BRiber等认 为诱导过度增生的Mcs凋亡可达到控制系膜增殖性 肾炎的目的由此可见我们可利用Fas一L系统 的作用原理,合成重组的FasL和/或协同剂,促使增 多的系膜细胞凋亡,从而达到预防肾脏病进展的目 的. 4参考文献 1SavillJ,Mco~eyA,Hughes』.Apoptosisandr?scardt~$Kidney Int,1995;49(suppl,54):S14 2SC~steittPTheFagdeath‰Seicaee,1995267:1449 3谌贻骥,高进,邢宝才肾小球系膜细胞培养北京医科 .1989;21(6):335 4llleraVA.Pemnd~CE.SmnzLL"apoptcdsinspleN~1wa- phocytes:Regulati~lbyproteinkitmseCandI. Jinmm1.1993 141~2965 5姜泊.张亚历,周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京:人 民军医出版社,1994:66457 6WangCH,GoeddelDVF皓,~figenandP55mrectorsigaal?一 opt~isdlztincepathv~~.』Imnmno1.1994~t52:175t 7L牌M,G唧V.PmmingLEetD,.Rt]CEJCED-3pm- teina.~forFadApo-Imediated~oplosis.Nat-are,t995375:81 80锄呐I血』,WatmdJeFR,Ad~hiMet?f.Lethaleffectthe丑ntL minmice.Nature,t993;369:806 9BakerAJ.No~teyA,Hu目J?fk鞴|目雌?apopt~is:Ihe m讲medm~isan{僵T鹌im咖瑚ulPd1趼inexpert- mental删删哂pmllferafive甲血』ClJnlnv~.t,1994~94:2105 [收稿1997—09-06修回1998一o5] (编辑徐杰)