醒脑静对大鼠皮层神经细胞的保护作用

醒脑静对大鼠皮层神经细胞的保护作用 醒脑静对大鼠皮层神经细胞的保护作用 2002年6月第l9卷第2期 June2002,Vo1.19,No.2 广州中医药大学 JournalofGuarIgzII?UniversityofTraditionalChin~Medicine125 文章编号:1007—3213(2002)02—0125一O2 醒脑静对大鼠皮层神经细胞的保护作用 万文成,李杰芬,罗海燕,李小英,张少琼 (广州中医药大学基础医学院,广州510405) 摘要:【目的】研究麝香,冰片等组成的醒脑静对神经细胞的保护作用.【方法】利用原代培养的大鼠大脑皮层神经细胞, ,3h)对脑细胞的兴奋毒性作用.【结果】醒脑静观察醒脑静对抗谷氨酸(1010l?L, 能减少谷氨酸所造成的细胞内乳酸 脱氢酶漏出量,减轻细胞的形态学改变.【结论】醒脑静能够对抗谷氨酸介导的兴奋性毒性,对培养的大鼠大脑皮层细胞具 有保护作用. 关键词:醒脑静/药理学;神经元/药物作用;麝香/药理学;冰片/药理学 中图分类号iR285.5文献标识码:A 醒脑静是一种中药复方制剂,主要成分为麝 香,冰片等开窍药L1j,对中枢神经系统的感染性疾 醒脑静能增强 病或中毒性疾病有较好的苏醒作用. 大鼠大脑皮层神经元耐缺血缺氧的能力j,对脑缺 血大鼠皮层组织中的神经元,胶质细胞具有保护作 用].本研究旨在进一步探讨醒脑静对大鼠大脑皮 层的神经细胞的保护作用. 1材料与方法 1.1实验动物新生SD大鼠(出生24h以内) 由本校实验动物中心提供. 1.2药物及试剂醒脑静由无锡山禾药业股份有 限公司生产(批号:0lcr722).L一谷氨酸(Glu), 多聚赖氨酸(poly—D—Lysine),N一2一羟乙基哌 嗪一N一2一乙磺酸(}{IPES)为美国Sigma公司产 品. 1.3仪器722光栅分光光度计,由上海第三分 析仪器厂生产. 1.4大鼠大脑神经细胞培养按文献[4]方法, 无菌条件下分离新生鼠大脑皮层,切成0.5?m3碎 块,置于含2.5g?L胰蛋白酶的Hank'8液中, 37?消化15min,加入含200mL?L小牛血清的 DMEM培养基中止消化.然后用移液管反复轻轻吹 打组织,制成单细胞悬液.离心,200g,5min. 弃上清,再用完全培养液重新悬浮细胞,调整细胞 ×106?mL,,接种在预先用poly—D— 密度为1.0 Lysine覆盖的35mln平皿中,每皿种2mL.培养3 — 4d改用含2.5哗?L阿糖胞苷的培养液培养 24h,以抑制胶质细胞的生长,再改用常规培养液 收稿日期:2002—03—05 作者简介:万文成(1962一),男,讲师 培养.培养液由DMEM,200mL?L小牛血清, 2mmol?L谷氨酰胺和21mmol?L葡萄糖组成. 细胞在37?,含5%CO2和95%空气的混合气体中 培养1O12d即可用于实验.培养过程中每周换 液2次,每次更换50%培养液. 1.5细胞毒性实验及醒脑静的对抗作用实验取 培养10d的神经细胞进行实验,实验共分4组: ?正常对照组;?损伤组;?醒脑静大剂量组 (20mL?L);?醒脑静小剂量组(10mL?L). 每组设4皿.实验时,参照文献[5]方法,除正常 对照组外,其余各组同时加入等量的低糖DMEM 培养液和10tmaol/L的谷氨酸;醒脑静组在加谷氨 酸前10min,向培养液中加入不同浓度的醒脑静. 再将各组置于培养箱中培养8h后,镜检并取上清 液测乳酸盐脱氢酶(IJ)H)活性. 1.6观察指标用倒置显微镜观察神经细胞的形 态变化,以培养液上清中LDH活性作为定量评价 细胞受损伤程度的指标.测定LDH时,参考文献 [6],先测培养液上清中LDH活性,然后将相应的 培养细胞置于一3O?,3h以上,使细胞破碎,再 测总LDH活性.细胞损伤程度以培养细胞释放的 LDH占总LDH活性的百分比表示. 1.7LDH活性测定按文献[7]进行. 2结果 培养10d后的神经细胞立体感强,胞体有明 显的折光性,呈锥体,双极或多极形,细胞呈团聚 集,分布疏密不均;细胞突起相互交织成网.损伤 组中,大部分细胞折光度降低,胞体肿胀,神经元 l26万文成,等.醒脑静对大鼠皮层神经细胞的保护作用第2期 突起断裂,变短.培养液中LDH漏出率明显增加. 但是,在加入Glu前加入醒脑静的两组细胞受损程 度相对较轻,LDH漏出率较损伤组为低,与损伤 组比较具有显着性差异;且高剂量组较低剂量组的 形态学改变更轻一些,LDH漏出率更低,统计学 检验也有显着意义(见表1). 表1醒脑静对Glu介导的神经细胞的LDH漏出率的影响 TabIe1EffectofXNJ0ntheI的seofLDHfromcortical rl~tlrorlsinducedbyGlu(?s) GroupspLglt/% 正常对照组(A) 损伤组(B) 醒脑静低剂量组(c) 醒脑静高剂量组(D) lO.3?3.4 38.8?4.0 28.3?5.2 22.8?3.6 检验方法:t检验;*与损伤组比较(GroupB)P<O.05, **P<0.01 3讨论 据报道,正常情况下,神经元内LDH含量丰 富,且流出量极少,而当神经元受损后,随受损程 度的加重,膜通透性增强,LDH流出相应增加. 在10ttmol/LGlu低糖培养液培养的条件下,神经 元已形成了离体"缺血"模型].Koh认为测定培 养液中的LDH含量能够定量评价神经元的受损程 度.因此,我们以培养液中LDH的漏出率作为 主要的观察指标.Glu浓度过高导致神经细胞损伤 的机制可能在于,其作用于突触后膜上的NMDA (N一甲基一D一天冬氨酸)受体和非NMDA受体, 钙离子通过NMDA受体偶联的钙通道和电压依赖 性钙通道内流,使突触后神经细胞内钙超载以及自 由基生成增多,导致细胞损伤,膜通透性增强, LDH大量外漏. 临床观察,醒脑静对中枢神经系统的许多疾病 引起的意识障碍有较好的苏醒作用….实验研究表 明,醒脑静能使脑缺血大鼠皮层电图(Ec0G)保 持在较高状态,显示其具有一定的抗脑缺血作 用;对脑缺血大鼠皮层组织中的超微结构具有保 护作用bJ,能提高脑缺血大鼠皮层组织中超氧化物 歧化酶(SOD),谷胱苷肽过氧化物酶(GSH—Px) 的活性,减少过氧化脂质(【JP())生成u.本研究 利用神经细胞原代培养技术,观察到醒脑静能减轻 细胞的损伤性变化,减少LDH的漏出率,显示出 对抗过量Glu对神经细胞的兴奋性毒性作用,进一 步证实了醒脑静具有抗脑缺血作用. 参考文献: [1]杨秀露,徐玮一,龚跃新,等.醒脑静注射液的药理作用研 究[J].中国药房,1993(1):l8. 陈洁文,罗荣敬.醒脑静与川芎嗪对不完全性全脑 [2]万文成, 缺血大鼠脑皮层电图的影响[J].广州中医药大学, 1997,14(2):92 [3]罗海燕,万文成,陈洁文,等.醒脑静对脑缺血大鼠大脑皮 质超微结构的保护作用[J].中医药研究,2000,16(4): 37. [4]洪庆涛,唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的体外原代培 养[J].神经解剖学杂志,1994,10(3):259. [5]裴林,纵艳艳,孙亚锋,等.谷氨酸对培养神经元的兴奋毒 性及氯氨酮的保护作用[J].徐州医学院,1995,15 (3):221. [6]马丽焱,肖培根,梁发权,等.三七总皂苷对原代培养大鼠 皮层神经细胞的保护作用[J].中国药学杂志,1998,33 (3):143. [7]赵善政.乳酸脱氢酶测定[M].临床生化检验.上海:上 海科学技术出版社,1979.314. [8]裴林,纵艳艳,张光毅.氯胺酮和右美沙芬对培养神经元缺 氧损伤的保护作用[J].徐州医学院,1996,16(4): 337. [9]KohJY,ChoiDW.Quantitativedeterminationofdutan1atecortical nM1almyincellbylactatedehydrogaseeflluxassay[J].JNeu— rosciMet,1987,20:83. [1O]万文成,罗海燕,陈洁文,等.清热解毒开窍醒脑防治脑 缺血的实验研究[J].深圳中西医结合杂志.2001,ll (1):5. ProtectiveEffectofXangNaoJingonCulturedCorticalNeuronsinRats WWe~heng,Hfen,oHaiyan.LIXiaoying.ZHANGShaoqiong (BasicMedicalCollege,Guan0tIUniversityofTCM,Gtlan~ou510405,China) Abstract:【Objective】 TostudytheprotectiveeffectofXingNaoJing(XNJ)onculturedcorticalneuronsinrats. 【Methods】 Pl4ma~culturedcorticalneuronswereappliedtoobservetheeffectofXNJincounteractingth eexeitotoxieity ofglutamicacid.【Results】? decreasedthereleaseofintracellularlactiedehydrogenaseindueedbyglut~acacid andreducedthehistologicalchangesofculturedcorticalneurons.【Conclusion】 XNJCallcounteracttheexeitotoxieityof glutamieacidandprotecteult~corticalneuronsinrats. Keywords:XINGNAOJING/phannacology;NEURONS/drugeffects; BORNEOLUMSYNTHETICUM/pharmacology ;