井冈霉素生产工艺改进及其功能化树脂的研究（可编辑）

井冈霉素生产工艺改进及其功能化树脂的研究（可编辑） 湖南师范大学 博士学位论文 井冈霉素生产工艺改进及其功能化树脂研究 姓名:钟世华 申请学位级别:博士 专业:有机化学 指导教师:徐满才 20091001中文摘要 本文利用微生物发酵的方法生产井冈霉素,从井冈霉素生产工艺 的菌种着手,对菌种的自然选育与纯化、发酵培养基配方的优化、 发 酵工艺中染菌的控制和井冈霉素的提取精制等工艺做了改进。 利用体积排除效应,通过对交联剂和致的选择,合成了新型 聚丙烯酸型树脂。根据井冈霉素分子中仲胺基在碱性介质中显正 电性的特点,提出了~步法提取井冈霉素的工艺。 利用井冈霉素分子结构中富含邻羟基和间羟基的特点,在合成大 孔交联疏水聚苯乙烯网络的基础上,通过化学转化合成一种新型 智能 疏水/亲水性聚苯乙烯支载井冈霉素两亲聚合物微球。利用该材 料的特 殊亲和性能和本身分子结构的体积排除效应,实现对分子大小不 同的 化合物及天然产物的吸附分离。 井冈霉素菌种的自然选育和产素能力研究 采用自然选育方法对井冈霉素生产菌株进行了筛选,获得了遗传 性能稳定的高产菌株。考察了发酵培养基中碳源、有机氮源对菌种产 素能力的影响。结果明:采用:为:..,固形物含量 为%左右的菌种培养基配方,得到的井冈霉素生产菌产素能力高。 正交法优化井冈霉素发酵培养基研究 以黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、肉粉、玉米粉、、山芋 淀粉及大米淀粉因素水平的正交试验对井冈霉素发酵培养基配方 进行了优化。结果表明:最适碳源为大米淀粉,最适氮源为黄豆饼粉、花生饼粉。最适碳氮比为:..。最适培养基为大米淀粉.%、 黄豆饼粉..%、磷酸二氢钾.%;得到的发酵液易过滤,滤 液清澈。 井冈霉素发酵染菌的控制 通过对井冈霉素发酵工艺中种子、发酵培养基和发酵设备及其附 件的染菌分析,综合生产试验,获得了控制井冈霉素发酵工艺中染菌 的有效办法。应用于湖南微生物研究所,年染菌率从.%下降 到.%。 新型大孔聚丙烯酸树脂一步法提取井冈霉素工艺 根据井冈霉素分子结构中仲胺基在碱性介质中显电正性的特点, 合成了新型大孔聚丙烯酸型树脂,采用一步法吸附提取井冈霉素 工艺,同时考察了发酵液温度、浓度和酸度对树脂吸附的影响,探索 了树脂对井冈霉素动态吸附的工艺参数。获得了高浓度井冈霉素井 冈霉素含量达%产品。 聚苯乙烯支载井冈霉素微球的合成 以苯乙烯为单体,二乙烯苯作交联剂,用甲苯和液体石蜡作致孔 剂,通过对交联剂和致孔剂的比率调剂,采用悬浮聚合法合成不同孔 径的大孔疏水网络,然后将网络进行氯甲基化,再将氯甲基化的交联 聚苯乙烯和井冈霉素在,.二甲基甲酰胺中进行胺 化反应,得到几种不同孔径的新型聚苯乙烯支载井冈霉素两亲聚合物 微球。采用红外光谱、元素分析等手段分析了该树脂的结构,测定了 该树脂的孔结构、含水量、弱碱交换量和溶胀性能。 聚苯乙烯支载井冈霉素微球对硼酸络合吸附性能研究 利用聚苯乙烯支载井冈霉素微球中井冈霉素分子结构中富含间、 邻羟基的特点,研究了该树脂对硼酸的络合吸附。得到了该树脂对硼 酸在不同温度下的吸附等温线,并利用热力学探讨了该树脂的吸 附机理,并将该树脂对硼酸的吸附效果与目前商用特效硼酸树脂做了 对照。结果表明其动态吸附能力是葡甲胺基硼酸特效树脂江苏 苏青水处理集团有限公司的倍。 聚苯乙烯支载井冈霉素微球对吸附性能研究 研究了聚苯乙烯支载井冈霉素微球对溶液在不同温度下的吸 附等温线,利用热力学函数计算出了该过程的吸附焓、自由能和熵, 探讨了该树脂对的吸附机理和吸附能力。结果表明:此树脂对 有很好的吸附作用,其动态吸附量达到.?溶剂溶胀;模拟 ?~。 涂料浓度.~.?~,其残留浓度为? 聚苯乙烯支载井冈霉素微球对葛根异黄酮吸附性能研究 .研究了聚苯乙烯支载井冈霉素微球对葛根异黄酮在不同温度下的 吸附等温线,利用热力学函数关系计算出了该吸附过程中的焓变、自 由能和熵变。结果表明该树脂对葛根异黄酮的吸附得率为%。 关键词:井冈霉素,生产工艺,井冈霉素微球,应用开发 , , , .. ? . ,,/ ... , . .? :.~. %. : , ,.,& , , ., : :... .~ .%. .%~.%, .% .%. .. , , ,, . ?. ? .% .% , , ? . 、、 ..,曲%. , ?, ., . , . . , ,. . ? , ..,.. ... : . ,‘叫 ; 一, .?. ?嵋~. . .: %.:, , ?湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下, 独立进行研究工作所取得的成果.除文中已经注明引用的内容外, 本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 年月日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大 学。同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论文被查阅和借阅.本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 、保密口,在 年解密后适用本授权书. 、不保密。 请在以上相应方框内打“寸’ 作者签名: 日期:年月日 导师签名: 日期:年月日井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 文献综述 .井冈霉素的性质 井冈霉素【】是采用微生物发酵法生产的~种含井冈霉素各组分的 抗生素图.,其有效成分为、、、、、、,其中成 分大于%,成分占%左右【”。纯品易溶于水和甲醇,微溶于乙 醇和丙酮,不溶于乙醚、苯等有机溶剂,分解点?,吸潮性强, 呈弱碱性,常温下在中性及弱酸弱碱介质中稳定,在较强酸性或 碱性 介质中易分解。对人、畜、鱼、蚕等无毒,动物口服井冈霉素可 被肠 内细菌分解成葡萄糖和井冈胺,后者不被肠道吸收,可全部排出 体外。 纯品小自鼠毒性实验 一。& 氏?? ?.. ?? .. 、 ??,??? .. ?? ??: 井冈霉素分子结构式 .. 博士学位论文 .井冈霉素的生产工艺 在七十年代初,水稻纹枯病俗称稻瘟病危害十分严重,染菌 水稻几乎是颗粒无收,没有好的防治农药。年,上海农药研究所 组织有关专家,参照日本防治稻瘟病的农药产品一有效霉素 ,分别从江西井冈山地区和杭州植物园的土壤中定向筛 选,得到了一种菌株吸水链霉菌井冈变种.. ,】,通过对这一菌种的多次筛选,采用微生物发酵 方法,合成了一种抗生素农药一井冈霉素。其有效成份与日本生 产 的有效霉素或百里达新相同【,.。 井冈霉素从研究开发三十多年以来,一直是我国治疗水稻纹枯病 的首选农用抗生素,已成为我国农民家喻户晓的理想生物农药,它的 生产可分为以下几个工艺阶段: 菌种孢子制备种子制备发酵一发酵液预处理提取及精制 成品检验成品包装 ..菌种 在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种 筛选的过程,叫做菌种的自然选育或自然分离。 菌种选育的目的是改良已知菌种或生产菌株的特性,使其符合工业 生产的要求。根据菌种自然变异而进行的自然选育,用人工方法引起菌 种变异或形成新的杂种,再按照工业微生物学的要求进行筛选 来获得新的变株或杂种,这就是当前菌种选育的基本内容。.井冈霉素生产。:艺改进及其功能化树脂研究 菌种选育在抗生素工业中的地位越来越重要。抗生素产量和质量的 不断提高,是由于在菌种选育、发酵和提炼等三个方面不断取得 进展的 结果,但其中菌种选育的作用是主要的、根本的。发酵培养基成份和发 酵条件的改进,充分发挥菌种的生产潜力,提高发酵单位,但这些因素 的改进不能离开菌种本身固有的遗传特性。提炼方法的改进,可以提高 发酵产物的收得率,但是理想的最高回收率也只能以达到菌种的潜在产 量为极限,而且实际上还受到工艺和成本核算的限制。总之,抗生素的 产量、质量及其抗菌性能,主要是由菌种特性所决定的。 菌种选育有两个基本任务:一个是抗生素工业生产方面的任务;另 一个是抗生素产生菌的遗传研究方面的任务。总的来说菌种选育的任务 是随着抗生素工业的发展而发展的,也是随着菌种本身特性的改变而变 化的。 在抗生素生产中,通过菌种选育可以达到以下几项目的: ?提高发酵单位 对已经投入生产的菌种要通过菌种选育继续提高其发酵单位;对 新菌种更需要迅速提高其发酵单位,使之迅速投入工业生产。在工业 生产上所使用的菌种都是经过选育以后的变种,抗生素发酵单位的不 断提高主要是不断选育菌种的结果。 ?提高产品质量、减少多余的代谢产物 通过菌种选育,可以分离得到各种突变型菌株,其中生物合成障碍 突变型菌株的一部分酶引起遗传性阻断,积蓄了合成中间体,这样,就 有可能增添新抗生素或去除有毒或活性低的多余组分。博学位论文 自然选育以微生物的自然突变为基础。在工业生产中,抗生素产生 菌呈现出巨大的自然变异能力。这种自然变异的结果往往导致菌种的退 化,表现出生活力减弱、产孢子能力减少和生产抗生素能力降低等。菌 种退化实质上是遗传上的退化,严重的退化甚至造成菌种的死亡。但自 然变异有时也会出现生产抗生素能力提高的优良特性。因此,经常地从 大量的天然孢子群体中,淘汰衰退的菌株,保存优良的菌株,可以达到 纯化菌种、稳定生产的目的。 生产菌种在使用过程中,要在人工培养的条件下进行传代。虽然原 始斜面是由单菌落发育而来,但菌落上的许多分生孢子已经具有不同的 遗传基础,所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征。群体较纯的,传 代后变异较少;群体不纯的,传代后变异菌株将会占优势。因此,菌种 在传代过程中,很容易丧失一种或多种特性而导致退化。在抗生素生产 中,为使生产不断向前发展,要求发酵单位不断提高,需要反复对生产 菌株进行挑选。尽管生产上使用的菌种都用合理的方法保藏着,而且研 究工作者还在不断地改进保藏方法,但是菌种在保藏过程中仍不断发生 变异。 综上所述,自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、 提高产量的目的。自然选育的一般程序是把菌种制备成单孢子悬浮液, 经过适当的稀释以后,在固体平板上进行分离,然后挑选单个菌落进行 测定,从中选出优良菌落。 其选育流程如下: 出发菌株砂土???,斜面?生制成孢子悬浮液鲎划平板分离 一 出发菌株砂土???,斜面一制成孢子悬浮液二竺划平板分离井冈霉素生产.:艺改进及其功能化树脂研究 效价测定 传至三代复筛 ??挑取单菌落接种??一筛选??? ~ 或自然分离 确定菌株一砂土保藏 生产菌种制备工艺流程: 砂土管?一砂斜?孢瓶斜面?摇瓶发酵?种子罐发酵 ..孢子制备 孢子制备是发酵工序的开端,也是一个主要的环节。抗生素的产量 和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子制备有密切关系。生产用的孢 子需经过纯种和生产能力的检验,符合规定的孢子才能用来制各种子。 制备孢子时,一般是将保藏的处于休眠状态的孢子,通过严格的无 菌手续将其接种到灭菌的固体斜面培养基上,在?下培养~ 天。但这样培养出来的孢子数量还是有限的,为了获得数量更多的孢子 以供生产需要,可进一步采用有较大表面积的固体培养基如小米或麸 皮进行扩大培养。 ..‘种子制备 种子制备这一过程的目的是使孢子发芽、繁殖同时获得足够数量的 菌丝,以便接种到发酵罐中去。种子制备有的从摇瓶培养开始,再接入 种子罐进行逐级扩大培养。有的直接从种子罐开始进行逐级扩大培养。 摇瓶培养过程是否需要与种子扩大培养级数的多少有关,决定于菌种的 性质、生产规模的大小和生产工艺特点。种子制备~般在种子罐中进行,博士学位论文 扩大培养级数通常为二级。 摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基,灭菌后用无菌 操作接入孢子,放在摇床上恒温培养。种子罐培养时,在接种前有关设 备和培养基都必须经过严格灭菌消毒。孢子接入一级种子罐的方法是制 成孢子悬浮液,通过微孔差压法也可采用火焰保护法接种,如用孢 子悬浮液接种,约为~个孢瓶,具体视孢瓶内孢子丰富程度和种子 罐的大小而定;如用菌丝接种,酌情接入~瓶,相当于.~.% 以罐内发酵液体积计算,下同。二级种子罐接种量一般为%, 培养温度一般为一?,在罐内培养过程中,需要搅拌和通入无菌 空气,控制罐温和罐压,并定时取样作无菌试验,观察菌丝形态和进行 生化分析等,确保种子质量后方可移种。 ..灭菌 ...空气过滤除菌 空气的组成:氧气、二氧化碳、氮气的混合物,其中还有水 汽及悬浮的尘埃,包括各种微粒、灰尘及微生物。空气需严格除 菌,达到无菌状态,才能使用。在井冈霉素发酵工业中、,采用 过滤介质 除菌方法制备无菌空气。微生物体积 很小,空气中附着在尘埃上的微生物大小为.. 。其原理 在于空气通过过滤介质时,颗粒在离心场产生沉降,同时惯性碰 撞产生摩擦黏附,颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗 粒,颗粒接触介质表面,直接被截留。气流速度越大,惯性越大, 井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用,另外静电引力也有一 定作用。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的 微生物。 ...蒸汽灭菌 湿热灭菌效果优于干热灭菌,原因在于湿热状态下,穿透 力强,蒸汽冷凝时释放出大量能量,使蛋白质、核酸等内部的 ?~ ?, 化学键破坏、降解,导致生物体死亡。一般在 保持一段时间,可以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉,来 源方便,效果可靠,操作控制简便,因此湿热灭菌常用于培养 基和设备容器的灭菌。为了确保彻底灭菌,实际操作中往往增 加%的保险系数。灭菌过程中,高温会使营养成分受到一 定程度破坏。灭菌活化能大大高于营养物质分解活化能,因此 应尽量减少灭菌时间和温度。从微生物死亡动力学方程可以看 出,随着温度的升高,微生物的死亡速率加快,而且比营养物 质分解速率快得多,因此高温短时灭菌可达到相同灭菌效果, 而营养物质破坏大大减少。这就是高温短时灭菌的理论基础。 。 井冈霉素发酵工艺中蒸汽灭菌温度采用 ?,维持 ..发酵 这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始 前,有关设备和培养基必须先经过灭菌,后接入种子。井冈霉素接种量博十学位论文 一般为%,发酵周期为 。在整个过程中,需要不断地通入无菌空 气和搅拌,维持一定的罐温和罐压,并隔一定时间取样进行生化分析和 无菌试验,观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。在发酵过 程中往往要加入消泡剂控制泡沫,并加入酸碱控制发酵液的。发酵 中可供分析的参数主要有菌丝的浓度和形态、残糖含量、氨基氮、溶解 氧浓度、和抗生素含量。发酵过程中主要控制罐内温度、通气量、 搅拌转速以及添加酸、碱、消泡剂。每种抗生素发酵都有它自己的控制 点和最合适的参数进行控制。影响发酵的因素是错综复杂的,各种因素 相互影响,相互制约。因此抗生素发酵要得到预期的效果,需要各方面 密切配合和严格操作。 抗生素生物合成过程较为复杂,影响因素比较多。因此控制生产往 往要凭经验,随着对抗生素生物合成机理和微生物遗传学的研究,特别 是分子生物学及遗传工程的研究,对微生物生命活动的规律、代谢的控 制和调节有了进一步的了解,大大地促进了发酵工业的发展。现在有人 试图研究把产生抗生素的基因移植给发育快、易于培养的微生物例如大 肠杆菌上,以简化抗生素的生产方法。还有研究无细胞合成,亦即是运 用离析的酶合成抗生素。这些研究如果成功将会引起抗生素工业巨大变 革。 ..发酵液的预处理 通常在提取前,发酵液需先进行过滤,将菌丝和滤液分开。如抗生 素分泌在液体中,则需将滤液进行预处理,以利于以后的提取,如抗生井冈霉索生产:艺改进及其功能化树脂研究 素分泌在菌丝中,则通常先用有机溶剂萃取,井冈霉素属于前者。 发酵液的过滤和预处理是抗生素提炼的第一步操作。过滤和预处 理 的目的不仅在于分离菌丝,还着眼于将一些杂质除去和改变滤液性质, 以利于后续各步的操作。当发酵终了时,抗生素可能在溶液中,也可能 在菌丝内部或两相中同时存在。预处理时应尽可能使抗生素转入便于以 后处理的相中多数是液相中,通常可用调节至酸性或碱性的方 法来达到。 ..提取和精制 发酵液预处理后,发酵液即送去提取和精制,利用一些物理和化 学方法将抗生素提纯为合乎规定的成品。井冈霉素传统的提取方 法是采用真空浓缩的办法,将发酵液直接浓缩到一定的浓度,经检验 合格后进入包装工艺,或将浓缩到一定浓度的发酵液采用真空喷雾干 燥或真空烘烤经粉碎过筛后制成粉剂,检验合格后进入包装工艺。因 此得到的粉剂效价较低,含有残糖、蛋白质等其他物。目前对于高含 量的井冈霉素产品则采用树脂吸附提取的方法,即将井冈霉素发 酵液 预处理后得清液,通过离子交换树脂吸附、去离子水洗涤、盐酸解析、 活性炭脱色、真空浓缩得产品。郑裕国【】等采用二步离子交换法对井 冈霉素提取工艺做了研究,其收率在%,纯度%化学效价, 不含残糖、蛋白质等。 .井冈霉素的应用领域和开发前景 ..农用井冈霉素博士学位论文 水稻纹枯病是常发多发病,是我国水稻高产的主要障碍,我国水 稻种植面积达万。井冈霉素对防治水稻纹枯病具有特效,可 用于水稻稻瘟病,小麦纹枯病【,蔬菜立枯病和根腐病【】,棉花、豆 类立枯病【及水稻小粒菌核病【】,玉米大斑病【、玉米纹枯病、玉米 、 穗腐病【、稻粒黑粉病【旧、柑桔果梗炭疽病、白术根茎腐烂病 家鱼烂鳃病】的防治。多年大规模的田间使用结果充分显示其“防效 高、无药害、无污染”的环保型农药的特点,深受国内外用户欢迎。在 水稻任何生长期使用均不影响其生长。使用十分方便,施用后耐 雨水 冲刷,四小时后遇到雨水,不影响药效,持效期天。 另外井冈霉素还推广到其它作物的菌害防治上,并且对棉花、疏 菜等其它农作物的纹枯病也有很好的疗效,市场稳定潜力很大。微生 物发酵农药为当今社会经济发展的朝阳产业,是我国二十一世纪重点 开发研究的生物工程领域,中国抗菌素开发较早,水平处于世界先进 之列。井冈霉素是内吸性很强的抗菌素,被植物吸收后,接触菌体很 快被菌丝细胞吸收并在菌丝内传导,干扰和抑制菌体细胞的正常生长 反应而起治疗作用。井冈霉素是一种对人畜无害,不污染环境的无公 害农药,解决了水稻主要多发病??水稻纹枯病的防治问题。二十多 年来经久不衰,年防治使用面积达亿多亩,为我国水稻的高产稳产 做出了重要的贡献,是目前农业上无法替代的优良药剂,占全国农用 抗生素生产应用的%以上。 ...井冈霉素的复配剂 国内各大井冈霉素生产厂家和各大农药生产企业和科研院所,已井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 将井冈霉素与其它化学农药制成复配药剂,并取得了很好的结果, 例如粉锈宁、井冈霉素混用防治稻粒黑粉病;纹枯灵与担菌胺防治水 稻纹枯病;吡虫啉、杀虫单、井冈霉素协同防治水稻中后期病虫害; 纹霉清及其复配剂防治水稻纹枯病;立克秀防治小麦纹枯病【。井冈 霉素还应用在果树上【等。 江苏省农科院微生物研究所将益菌芽孢杆类一多效菌与井冈霉素 这两种生物制剂经科学研究配制而成%多效井冈霉素粉剂,试验表 明该合剂除对人畜毒性低,对水稻安全,不污染环境外,在促进水稻 健壮生长、防病和增产上均优于单一井冈霉素。主要表现在: ?合剂防治水稻纹枯病效果比单用提高.%,并对稻曲病、稻 瘟病等也有一定的兼治效果。 ?能增加水稻有效穗数、实粒数、粒重,提高单位面积产量% 左右。 ?提高经济效益,每亩每季施%多效井冈霉素粉剂两次,比 单用增收元以上。是当前水稻病虫害综合防治中较为理想的防病、 增产生物制剂。 ..‘.井冈霉素残渣利用 井冈霉素残渣全国年产约万吨。井冈霉素的残渣水分含量高、 粘性大,残余淀粉.%左右、粗蛋白.%左右、无毒性。但是其 残渣长期露置在外,其有机质会腐烂发臭,严重影响环境,因此井冈 霉素残渣的利用是亟待解决的问题。废渣固态发酵生产饲料蛋白【】是 对井冈霉素废渣资源的持续利用,具有发酵周期短、酵母产量高、工博士学位论文 艺简单、生产成本低的优势,有良好的应用前景。 ..井冈霉素后期开发与利用 ...两亲聚合物材料 离子交换与吸附树脂是一类应用广泛的吸附分离功能材料。在现 有的离子交换与吸附树脂中,由于树脂是多孔性的即使是凝胶型离 子交换树脂,也有大量因溶胀而产生的微孔,难以利用离子交换实现 体积大小不同的小分子的分离。如果一端为亲水性基团另一端为疏水 性基团的大小合适的有机分子进入到疏水/亲水性聚合物网络中,其亲 水性基团与亲水性聚合物亲合性较强,疏水性基团与疏水性聚合物亲 合性较强,从而释放出内能,对该类有机小分子表现出较强的亲合性。 井冈霉素是一种带仲胺基的多羟基化合物,基于其分子结构的特 点,设计合成两亲聚合物材料而应用于天然产物的吸附分离。 ,简称是由 两亲聚合物网络 亲水和疏水高分子链段通过共价键连接而成的既能在水中溶胀又能在 有机溶剂中溶胀的交联聚合物口。】。在中,亲水和疏水链段分别 聚集并形成微观相分离的相态结构,而且亲水和疏水链段又分别保留 了各自的物理和化学性质【,两亲网络的独特性质使得它日益受到聚 合物科学家的关注。独特的性质使其在药物控制释放、血液 相容性材料、智能高分子材料、分离材料等领域显示出广阔的应用前 兽 。 尿 在两亲吸附树脂的合成与应用方面,南京大学李爱民、张全兴、 刘福强等利用亲水的酚羟基修饰聚苯乙烯树脂,对酚类化合物的吸附井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 做了系统研究【】;王建国、刘琳、夏平对两亲性星状共聚物的合成、 结构和?.;台匕进行了研究【】;陈煜、唐焕林、刘云飞等对两亲类可聚合 型季铵盐的制备及其性能做了深入研究【】;孔壮志、罗志华、付志峰 . 等用多官能链转移剂,通过普通自由基聚合制备了两亲性杂臂星形聚 合物;郭锦勇、刘峙嵘、邹丽霞等利用型树脂,对金属铼进行 了吸附研究【】;张全兴、陈金龙、李爱民等合成了新型树脂,对化工 废水中有毒有机化合物的吸附作用机理进行了研究【】;关英、彭宇行 对两亲聚合物网络的研究进展作了综合阐述【】等等,总而言之,我国 学者在两亲吸附树脂的合成与应用方面做了大量工作。 基于井冈霉素具有独特的多羟基化学结构【蜘的特点,在合成大孔 交联疏水性聚苯乙烯聚合物微球的基础上,通过化学转化合成疏水/亲 水性大孔交联聚苯乙烯支载井冈霉素两亲聚合物网络。利用苯基的疏 水性和多羟基化合物分子的亲水性,可以用于从混合溶液中吸附分离 含亲水性基团和疏水性基团的大小合适的有机分子。例如:?在天然 产物提取方面,可提取葛根中的异黄酮等;?在天然产物分离方面, 可分离除去食用植物油中残留的黄曲霉素、、、和代乳品 中的黄曲霉素、等;?在环境保护方面,可分离去除聚氨酯类 涂料产品中游离的异氰酸酯等。 ...聚苯乙烯支载井冈霉素微球对葛根异黄酮的吸附 葛根被《中国药典》版列为药食同源的一种植物,并被国务 院列为第六大粮食作物。我国葛根资源十分丰富,长期以来,葛根只作 为提取葛根淀粉的原料加以利用,其加工方法十分原始,葛根资源遭 到严重浪费。合理开发和利用葛根资源已是十分迫切和需要。随着医博十学位论文 药科学的发展,葛根异黄酮的药理保健功能和临床治疗作用逐渐被人 们所认识。葛根异黄酮是医药和化工工业的稀缺原料,更是生物医药 的重要原料,国内国际市场对异黄酮的需求旺盛。葛根是速成植物,适 应大面积种植,是可以持续发展和利用的植物资源。葛根异黄酮提取 工艺的研究可为工业化生产葛根异黄酮提供理论依据,对提高葛根资 源的利用价值,获得较高的经济效益有重要的意义【。葛根中的主要 有效成分有:葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物,此外 还含有大量纤维素和淀粉等物质。目前,从葛根中提取异黄酮的方 法’主要有:醇回流法、醇渗滤法、浸渍法、微波辅助萃取法等。 主要是根据异黄酮类化合物与纤维素和淀粉等物质在水和乙醇等 溶剂中的溶解度不同,从而提取出葛根异黄酮类化合物的。但是从 野葛根中初步提取出来的粗提物中含有很多其他的成分,要获得较高 纯度的黄酮类化合物就要对粗提物进行分离纯化,目前主要的纯化方 法为大孔树脂吸附法:袁怀波鲫等利用大孔吸附树脂纯化葛根异黄酮 的最大静态吸附量为./;周媛们等用树脂吸附葛根异黄酮 的吸附容量为./等。 ..聚苯乙烯支载井冈霉素微球对甲苯二异氰酸酯的吸附 异氰酸酯是一种有毒的化学物质,是单异氰酸酯、二异氰酸酯和 多异氰酸酯的总称。聚氨酯涂料的涂膜综合性能优异,具有装饰性好、 硬度高、弹性好、干燥快、光泽高、耐水和耐磨性好等特点,倍受人 们青睐。其中木器家具涂料、地板涂料和防水涂料占聚氨酯涂料总量 的%以上。我国生产的聚氨酯涂料基本是芳香族溶剂型涂料,使用 的异氰酸酯通常是甲苯二异氰酸酯,异氰酸酯对人体的最大危害井冈霉素生产::艺改进及其功能化树脂研究 是它的蒸气异氰酸酯具有两个杂积累双键,非常活泼,能与人体的蛋 白质反应,生成变性蛋白。二异氰酸酯的蒸气能与眼泪中的水反 应生 成胺,刺激眼粘膜,有强烈的催泪作用,吸入后刺激呼吸系统,引起 干咳、喉痛;长期吸入二异氰酸酯会损伤肺部,引起头痛、支气管炎 和哮喘;尤其是对患有哮喘病的过敏体质者,由于异氰酸酯能与人体 的蛋白质反应生成变性蛋白,会引起过敏反应,造成呼吸困难等症状, 甚至导致死亡.】。目前聚氨酯涂料中游离异氰酸酯的含量较耐萄国 内标准.%;欧共体:大于.%应标明含有异氰酸酯,%应标明有 毒,控制标准次于欧美的%。因此各国都在寻求降低游离的 优异方法,总体来说,降低游离的技术途径可以分为物理方法 和化学方法两类。物理方法主要是基于异氰酸酯的物理性质的不 同,采用精制或者脱除等方法减少游离单体的含量,如:高真空薄 膜蒸发法聃引、分子蒸馏法雎们和溶剂萃取法渤等;化学方法主要是 根据分子差异,采用不同的催化剂或者是单体,促进反应进一步进 行,提高反应的转化率,减少生成聚氨酯过程中的游离单体,如直 接合成法晦和催化聚合法旧等。这些方法是在生产聚氨酯涂料的 过程中减少异氰酸酯的含量,每种方法都各有其优缺点,都能降低 异氰酸酯的含量,但是有些由于操作复杂、设备昂贵等应用并不广 泛,寻找一种有效的去除异氰酸酯的方法就成为各国研究者关注的 话题。 ...聚苯乙烯支载井冈霉素微球对硼酸的络舍吸附 我国是一个盐湖面积大、类型齐全的多盐湖的国家,特别是青藏 高原上许多盐湖皆富含硼,在硼工业生产过程如硼镁矿制取硼砂或卤博士学位论文 水提硼中排放出的废水中常含有一定量的硼,不仅严重污染环境,而 且造成硼资源的浪费。目前从盐湖卤水中提取硼酸的方法有很多, 如沉淀法、萃取法、酸化结晶法、浮选法和离子交换法。对于无法用 沉淀法、酸化结晶法等提取分离的低硼含量的溶液来讲,络合吸附法 被认为是最有前途的方法之一,应用树脂吸附法提取分离硼酸的机理 是:硼酸能与邻羟基化合物形成络合物,从而可以从卤水或者工 业废 水中提取硼酸,应用硼特效树脂吸附溶液中的硼已有报道【嘶。.. 等研究合成了硼酸的特效吸附树脂;,..【删 等探讨了硼酸特效树脂对硼酸的吸附能力;王美玲【】等研究. 树脂对硼酸的吸附性能,探讨了吸附的影响因素等;钱国强【】等研究 了含醚键的多羟基树脂对硼酸的吸附性能等。 .研究课题的提出及设想 由于井冈霉素具有前面所述的各种优良特征,同时生产井冈霉素 无论是从工艺方面,还是从技术方面来讲,都有值得我们进一步研究 发展的必要。 ’?井冈霉素研究开发多年了,其生产工艺还是没有大的改进 和提高,发酵效价也没有大的突破,几乎停留在.万单位左右。产 品质量与国外同类产品相比还有较大的差距。同类产品最初在日本研 制成功,其水剂清澈透明,具有清香气味加有香料,而我国的井冈 霉素水剂产品如酱油一样,时间稍长一点,一般会内有菌苔,外有霉 味;日本的粉剂产品为白色粉末,我国产品为棕黄色,含量是我国市 场产品的.倍,质量明显优于我国的产品。因此发酵生产过程中菌 井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 种选育、发酵培养基优化以及各工段的操作和设备灭菌等都有很多值 得研究的地方。就灭菌一项,如果能得到完全控制,发酵不再染菌, 那生产成本将明显下降,产品质量显著提高。 ?井冈霉素的提取还存在很大的问题,我国目前井冈霉素产品还 是发酵过滤液的全体进行真空浓缩制成水剂%、%或浓缩到高 浓度%时进行真空烘烤经粉碎过筛或真空喷雾干燥制成粉剂。 水剂产品由于发酵液的残糖未能剔除,致使水剂井冈霉素含量在% 左右,若含量超过%则变成了棕褐色的糖膏子;粉剂由于没有除杂, 糖含量过高,极易结块,含量也只能控制在%左右。进行此项研究 的目的在于如何选择优良菌株和发酵培养基,提高发酵效价,降低染 菌率,改造提取工艺,进而提高产品质量。 ?井冈霉素的应用范围目前已应用于医药中间体和生物杀虫剂, 如治疗糖尿病的瑞格列波糖和生物杀虫剂井冈羟胺;另外利用井冈 霉素带仲胺基和多邻、间羟基的特点,将其支载到智能高分子吸附材 料上,有很好的应用前景。这些都需要高纯度的井冈霉素做支持。博士学位论文 参考文献 【】徐嘉生,孙新元.浙江省井冈霉素现状与发展前景的探讨【】.浙江化:【.,:.. . 【】 , , 【】.. ,: ?. 【】自林泉,邓子新.微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新【】.中国抗生素杂志. ,:?. 【】沈寅初.农用抗生素井冈霉素开发研翘】.抗生素.,:.. 【】上海农药研究所.农用抗菌素组编井冈霉素【】.上海人民出版社.. . , . 【】 , . . ..,: , . 【】 , . .. . .. :.. 【】元英进.制药工艺学【】.化学工业出版社.. 【】郑裕国,虞炳钧,陈小龙等.离子交换法提取井冈霉素的研究【】.农药.,: . 【】顾庆红,丁旭.小麦纹枯病药剂防治试验【】.农药.,:. 【 】杨德宏.蔬菜农药的合理使用【】.河北农业科技。,:. 【】潘国占.棉花立枯病的发生特点及防治措施】.农业科技通讯,,:. 】孔芳水。稻小粒菌核病的发生及防治【】。安徽农业,,:. 【】孟昭礼,罗兰,尚坚,袁忠林,曲宝涵.人工模拟杀菌剂银泰对种植物病原菌的室内生 物测定】.莱阳农学院学报,,:.. 【】李顺德,黄业修等.井冈霉素防治玉米穗腐病【】.农药.,:.. 【】谭荫初.玉米中后期病虫害防治技术【】.植保技术与推广.,:. 【】傅龙顺,粉锈宁.井冈霉素混用防治稻粒黑粉病效果好【】.植保技术与推广.,:. 】刘斌.茶枯粉加井冈霉素防治柑桔果梗炭疽病有特效【】.中国南方果树,,:. 【】喻义东,胡琼波.白术根茎腐烂病病原分离鉴定与防治试验【】.湖南农业科学.,: . 【】林延.家鱼烂鳃病新疗法【】.内陆水产.,:.井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 【】谭萌初.水稻病虫防治的复配农药【】.中国农村科技,,:. 【】姚莉,袁雪琴,檀根甲.纹霉清及其复配剂防治水稻纹枯病试验研究【】.农药.,: .. 【】王怀训,王开运,蔡春菊,姜兴印,仪美芹.立克秀防治小麦纹枯病的药效评价【】.农药, ?. ,: 【】宋惠安.井冈霉素在果树上的应用【】.湖南农业,,:. 【】赵建国等.固态发酵井冈霉素废渣生产饲料蛋白的研究【】.粮食与饲料工业,,: ?. ,【】. ,......, : . 【】.,..,.... ...,:. 【】..妇. ?. ./....,: 【】.,.: ..,:. 【】 ,只. :,.. . ’:一. 】., 【 ,...: ..,:?. 【】 , ..仇肛. ..:. 勰【】. ... 。 .,:. 【】..,..,... ? 。. ,:.】...,., ., ? ......,, .【】. ? . 。。.,: . 【】李爱民,张全兴,刘福强等.一种亲水的酚羟基修饰聚苯乙烯树脂对酚类化合物的吸附 博十学位论文 热力学【】.离子交换与吸附.,:. 【】王国建,刘琳,夏平.两亲性星状共聚物的合成、表征和性能【】.同济人学学报., . :? 【】陈煜,唐焕林,刘云飞等.两亲类可聚合型季铵盐的制备及其性能研究【】.石油化工高等 学校学报.,:. 【】孔壮志,罗志华,付志峰等.用多官能链转移剂通过普通自由基聚合制备两亲性杂臂星 形聚合物【】.:?. 】刘峙嵘,邹丽霞,吕效磊,郭锦勇.型树脂吸附铼的研究【】.现代化工.,: .. 【】张全兴,陈金龙,李爱民等.树脂对化工废水中有毒有机化合物的吸附作用机理与技术 研究】.高分子学报.:. 【】关英,彭宇行.两亲聚合物网络的研究进展】.化学进展.,:?. 【】俞建忠,吴庆安,许丹倩.海藻糖酶抑制剂井冈羟胺的制备与表征【】.农药., :. 【】李海涛,于国萍.葛根异黄酮的提取及葛根食用产品的研究【】食品研究与开发., :?. 【】詹永,杨勇.葛根异黄酮的提取方法与应用【】.广州食品工业科技.,:. 【】郭建平,孙其荣,周全等.葛根总黄酮不同提取工艺探讨【】.中草药.,: . 】袁怀波,赵国华,李洪军,陈宗道.利用大孔吸附树脂纯化葛根异黄酮的研究【】.食品与 发酵工业.,:. 【】周嫒,程凡,罗少华.大孔树脂对葛根异黄酮的吸附及分离纯化研究【】.时珍国医国药. ,:?. 【】刘庄励.聚氨酯涂料中游离.一施工中毒的原凶【】.精细与专用化学品.:. 【】刘庄励.应重视解决聚氨酯涂料中游离的毒性问题【】.中国涂料.:. .室内装饰装修材料溶剂型木器涂料中有害物质 【】张俊智,赵玲,冯世芳等. 限量【】北京化学工业出版社. 【】虞兆年.游离和薄膜蒸发】.上海涂料.,:. 【】王建中.分子蒸馏技术在游离分离上的应用【】.中国涂料.,:. 【】赵金榜.聚氨酯涂料的发展和我国面临的挑战【】.现代涂料 与涂装.,:~. 井冈霉素生产::艺改进及其功能化树脂研究 】方旭升,张彩珍.降低涂料中游离含量的技术途径【】.涂料: 业.,:. 【】., ..加 .,:. 【】王玉梅.从硼废水中提取硼【】张家师专学报自然科学版.,: 【】王玉梅.从硼废水中提取硼】张家口师专学报自然科学版.,: /. . 【】. .,. .,. . ?【】., : . . . 【】 ., ., 耐 :. .【】., 【】雷引林,刘坐镇,邬行彦.硼酸络合法脱糖的研究【】.中国抗生素杂志., :.. ...?【..,.. ......,,, 【“】. .; ,.; .,.;/,. :. 【】 . 【】王美玲,邹从沛,刘晓珍,付道贵等..树脂对硼酸吸附性能的研究【】.核动力工程.。’ ,,: 【】钱国强,林雪,杨益忠,何炳林.含醚键的多羟基蝥合树脂的合成及对硼酸的吸附性能【. 离子交换与吸附.,: 博十学位论文 井冈霉素菌种自然选育及产素能力研究 .前言 从自然土壤中获得的能产生抗生素的微生物菌株,经过人工分离、 筛选纯化以及选育【捌后称为菌种。抗生素的生物合成可分为两个阶 段,首先是菌种的繁殖,其次是抗生素的形成。一般生产菌种经多代 繁殖往往会发生变异而退化,必须经常进行菌种选育川工作。微生物 育种技术经历了自然选割、诱变育种【‘、杂交育种、代谢控制育种 和基因工程育种【】五个阶段,各个阶段并不孤立存在,而是相互交叉, 相互联系。随着微生物学的发展,特别是在发明微生物的纯种培养 技术之后,出现了微生物纯种的自然选育,这是以基因自发突变为基 础选育优良性状菌株的一种方法。以自然分离韵方法加以纯化和育种 来提高其生产能力和产品质量。井冈霉素是我国自主研发的农用抗生 素,对防治水稻纹枯病具有特效,也可用于水稻稻瘟病,小麦纹枯病 的防治】,作者根据井冈霉素生产经验,对井冈霉素生产菌种进行自 然选育,并同时将所获菌种在湖南益阳微生物研究所直接应用生产, 取得良好的效果。 .材料与方法 ..材料井霉素生产艺改进及其功能化树脂研究 菌种:原始菌、群菌种湖南益阳生物化工有限公司提供。效价 测定方法:法【】。 斜面、平板培养基:.天门冬素.%,葡萄糖.%,琼脂.%, .%,灭菌 。 摇瓶发酵培养基:大米淀粉目以下、酵母粉目以下、 肉粉目以下、玉米粉目以下、黄豆饼粉目以下、花生 饼粉目以下、、、。 摇瓶发酵条件: 三角瓶装 培养液,层沙布;培 养温度?;?振荡器;.~.。 ..选育方法 将菌株置于天门冬素.葡萄糖琼脂斜面上,在?时培养天左右 挑菌筛选,挑选好的菌株镊入生理盐水.%中用玻璃棒捣烂制成菌 悬 浮液。悬浮液用生理盐水稀释成不同倍数每次稀释倍,即取稀释 成倍液再稀释倍,循环几次,直至单个菌株一般稀释一 倍即可。取数滴于培养皿中的培养基见表.上,用无菌推棒涂抹, 置于温箱中?培养,天左右挑菌筛选。 ..产紊能力测试 在多个 三角瓶分别装入 培养液具体配比见表., 据以往经验公共有成分选择硫酸镁.%,氯化钠 .%,磷酸二氢钾.%,调.~.,用层沙布 封口,消毒‘铂;放入.振荡器,调速 ,温度为?,发 酵时间 ,采用正交试验考察影响发酵的个因素,具体配方见表.。 表. 以碳源和有机氮源为主原料的配方表%..结果和讨论 ..井冈霉素产生菌的形态变异 群菌株在天门冬素.葡萄糖琼脂上的生长情况和平板上自然分离 的形态基本相同,但大部分菌落在菌落中心和外圈不吸水而在中 间有 井冈霉素生产丁:艺改进及其功能化树脂研究 一圈吸水呈黑色,根据斜面上的菌落特征差异,从中挑选一些菌 种, 根据形态特征和生物特征进行鉴定。在几种常用培养基上的培养 特征和原始菌种比较,如表.。 表. 撑菌种培养特性比较 . ?对井冈霉素产生菌进行多次自然分离的目的:. ?从自然分离中获得高产的变异菌株。 ?稳定自然分离的高产菌种遗传性状。 ?防止高产菌种退化。 试验证明自然分离在井冈霉素菌种选育中是一种行之有效的方 法。根据生产经验,选以天门冬素.葡萄糖斜面上培养菌株到刚出现黑 ‘左右,纯化得到的 色吸水为宜,原始菌种的产素能力为 群菌种产素能力在后面试验中有显著提高见表.。 ..有机氮源和碳源对井冈霉素产紊能力的影响 通过对有机氮源和碳源等个因素采用正交试验得到的结果,并博十学位论文 将各因素在不同水平时的效价统计如表.。 表.不同因素对产素能力的影响 . 注:大米粉%,山芋粉%;大米粉.%,山芋粉.%;大米粉%,山芋粉% 用极差分析法分别算出的各个因素对各项指标的影响见表.。 从表中数据可以看出:各因素对效价的影响程度为:肉粉玉米粉 酵母粉淀粉大米粉和山芋粉黄豆饼粉花生饼粉。肉粉、酵井冈霉素生产艺改进及其功能化树脂研究 母粉、玉米粉的加入对效价的影响比较大,且加入量升至%时效价开 始下降。 表.实验结果的计算表 出 .. 黄豆饼粉花生饼粉 酵母粉 肉粉 玉米粉 大米粉 山芋粉 硒?配。.结果表明:?黄豆饼粉可采用..%效价较高,提高到.% 时,效价有下降的趋势,采用.%左右。?花生饼粉采用..%, 对效价均无显著的影响。?酵母粉可采用.%,提高到.%以上时 效价有下降的趋势,肉粉的加入效价降低。?玉米粉的加入反而 使效 价下降,在发酵培养基中用大米淀粉来代替,采用.%效价提高。 .影响发酵的因素是多方面的,不仅和培养基的组成关系,还和培 养基的:比,培养基的固形物含量及物理性状有关,此外也和各组 份的互相组合有关,观察正交试验的各组配方中最高单位的:比 一 般为:.一:.之间,固形物含量在%左右。 .小结 菌种选育选以天门冬素.葡萄糖斜面上培养菌株到刚出现黑色吸 博十学位论文 。左右,纯化得到的撑 水为宜,原始菌种的产素能力为 菌种产素能力为 ’左右。 根据正交试验的结果,发酵单位比较高,滤液多,易过滤,滤液 清晰的配方为表。 表.培养基配方表%. 井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 参考文献 【】邹坚.井冈霉素高产菌种的选育【】.世界农药,,:. 【】陈力力,鲁迎新.微波诱变选育井冈霉素高产菌【】.生物技 术,,:.. .【】 , , 【】.. , :. . .. 【】【】. ,:. .【】 .. . ,,. 【】郑少奎,杨敏,杨清香.自然选育酵母菌对不同废水处理及资 源化研究【】.上海环境科学. , :.【】 ,., . . .,... . 】 / .,. . 【】 【】. ,:. 【】张彭湃.微生物菌种选育技术的发展与研究进展【】.生物学 教学,,:. 【】沈寅初,叶文炳,程大畏等./.井冈霉素水剂【】.北京:化学工业出版社. . 【】金世芳,邱晓力,陈继黄.井冈霉素发酵中应用有机氮源的探讨【】.浙江农业科学,, :. 【】郑裕国,汪钊,陈小龙.外循环气升式生物反应器气含率及其用于井冈霉素发酵的研究 【】.中国抗生索杂志,,:.. 【】钟世华,徐满才,陈嫒.井冈霉素发酵工艺中染菌的控.湖南师范大学学报,,: ?. 【】剐. ,【】.. . 【】中国科学院微生物所编著组.常用与常见真菌【】.北京:科学出版社,.博士学位论文 正交法优化井冈霉素发酵培养基研究 .前言 井冈霉素是我国自主开发并且大规模生产的第一个农用抗生素, 能有效抑制水稻纹枯病,已成为产量最大的生物农刻】;同时井冈霉 素还是生产阿卡波糖拜糖平和伏格列波糖倍欣两种糖尿病临床 用 药的中间原料【】,产品大量出口;井冈霉素是通过微生物发酵生 产的 一种多元混合物,主要成分是井冈霉素、、、;其中含量最多、 活性最强的是组分,其活性大致相当于组分的倍,组分的 倍,组分的倍【,。作者经过多年的生产实践总结,提出用正交 试验【对发酵培养基进行优化,获得合理配方,提高了井冈霉素产 量 和质量。 .实验部分 ..材料 试验菌种:井冈霉素产生菌湖南益阳生物化工有限公司提供。 大米淀粉目以下;山芋粉目以下;玉米粉目以下;黄豆饼 粉目以下;花生饼粉目以下;肉粉目以下;酵母粉工业 ; 试剂;工业试剂;种子发酵罐 ;工业发酵罐 工业品;消泡剂工业试剂;工业试剂;葡萄糖工 业试剂;一天门冬素工业试剂。 ..方法 ...液体种子制备 井冈霉素生产:艺改进及其功能化树脂研究 将处于休眠状态的孢子通过严格的无菌手续将其接种到灭过菌 的 .%, 固体斜面培养基.天门冬素.%,葡萄糖.%, 琼脂.%,灭菌 ,在?下培养 ;在 种子瓶中装 入 液体种子培养基玉米淀粉.%,葡萄糖.%,玉米浆.%, 酵母粉.%,蚕蛹粉.%,鱼粉.%, .%,.%, ,冷却后无菌接入活化的斜面母种,每 .,?下灭菌 瓶~块,每块约. ,于?摇床发酵 ,冷却后接入已灭菌 的 种子罐中培养约 ,再冷却后接入己灭菌的 业发酵 罐。 ...发酵条件 种子罐: 不锈钢罐,投料 ,罐内有上下二档六弯叶搅 拌,搅拌电机功率为. ,缸内都有挡板,起增加溶氧作用,采用 夹套升温。发酵罐:发酵罐容积 ,直径 , ,罐高 内设上下二档六弯叶搅拌桨,搅拌电机功率为. 。投料前仔细检 查发酵设备及其附件,采用间歇灭菌【】,于?灭菌 ,?发 酵一 ,定时取样镜检观察菌丝的生长情况。 ...正交试验 以常用碳源大米粉、山芋粉、玉米粉和氮源花生饼粉、 .%、 .%、泡敌.%,调 等个因素做正交试验。 .一一.保持一致,以发酵终点时井冈霉素效价为指标,筛选 者之间的最优配方。 ...检测方法