日本血吸虫成虫培养液中氨基酸及葡萄糖含量的动态变化

日本血吸虫成虫培养液中氨基酸及葡萄糖含量的动态变化 日本血吸虫成虫培养液中氨基酸及葡萄糖 含量的动态变化 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2o叭年2月第19卷第l期chJPa珀3;”Bi2o.l-o1.19,Not:45,.45’ 文章编号:1600.7423(2001)一Ol—0o45.? 【实验报道】 日本血吸虫成虫培养液中氨基酸 及葡萄糖含量的动态变化 范虹董惠芬蒋明森钟沁萍明珍平 【摘要】目的观察培养过程中日本血吸虫成虫细胞培养液中氨基酸(AA),葡萄糖(Gluc)及甘油三酯(1?)含 量的动态变化.方法用氨基酸自动分析仪,自动生化分析仪分别测定培养液在培养0—6d过程ynamicChangesinAminoAcidandGlucose inCultureMediumwithAdultSchistosomajaponicum FANHong,DongHui—fen,JL~.NGMing—SeU,ZHONGQin—ping,MINGZhen—ping (O~,art,ntntoi”R?咖andLaboratorySchistosomiasis,MedicalSchoolofWuhanUniversity,Wahan 430071) 【Abstract】ObjectiveToob蛐 ethedynamicchangesinthecontentsofalllJ/IOacld(AA),c(Glue)andtriglyceride(亿) theculturemediumcontainingaduhSchistosomajaponicum.MethodsThec0nk0fAA.Glueand’rGintheculture?Iedi皿duringthe incubationperiodfromdnto6dwefedetectedintimemigbtbeinfavor0fthe/nvitrocu]liva’don0f S,叩帆叫m. Keyds:adultSchistosomajaponicum,cellculture,8minoacid,e.1ucose,triglyccdde *edbyChenguangProjec:tofWulmnCity(No9757082357).NaturalSei~eeFo~andationHubeiPr0…(No97J075)andEd~’cadomdConmtteeof HubeiPro~ace Pm?dd陀:Denn口 tofMicwbiologyandPara~,imlogy,Hul~iTradionalMedicalCollege,Wuh且 廿4301~1 营养成分是影响血吸虫细胞在体外培养条件下 生存及生长繁殖的重要因素,Hobbs等…在培养曼 氏血吸虫童虫细胞时发现该种细胞在低浓度KCI及 葡萄糖(GIuc)的DMEM无血清培养基中存活时间较 长.董嘉芬等报道台成培养基TC.199分别与 10%,20%d~牛血清及RPMI1640与5%小牛血清组 成的培养基可使日本血吸虫成虫细胞存活150d以 上.陈晓蓓等以正交试验法研究日本血吸虫童虫 细胞的培养条件时发现童虫在RPMI1640,5%小牛 血清及0.85%盐水组台中存活时间最长. 本文通过测定培养过程中日本血吸虫成虫细胞 培养液中氨基酸(AA),Gluc,甘油三酯(TG)含量的 动态变化,了解培养细胞的物质代谢规律,为寻求 基金项目:*武汉市晨北计划fNo975708235)和期北省自然科学基 金【No帅J?5),胡北省教委赍助项目 作者单位:(武汉大学医学院人体寄生虫学教研室和血暇虫病研究 室,武汉43007t)**现工作单位:湖北中医学藐微生物寄生虫学 教研室.武汉430061 更台理及更完善的培养基提供有利条件. 材料与方法 1成虫的收集 取阳性钉螺(湖南省寄生虫病研究所提供), 常规逸出尾蚴.取家兔经皮感染18OO2000条尾 蚴感染后28d以灌注法冲虫,收集的成虫在含 青霉素1000IUtnfl,链霉素l000ttg/ml的PBS (一)溶液中洗涤2h备用. 2日本血吸虫成虫细胞培养 参照董惠芬等…的方法.细胞培养基为RPMI 1640和l0%小牛血清,加常量抗生素(终浓度青 霉素为100U/ml,链霉素为100m1),其pH值为 7.2,7.4.将备用的虫体剪碎,用0.25%的胰蛋 ‘ 46’中国寄生虫学寄生虫病杂志2OO1年2月第19卷第1期Chi口 JP?tDi82001-01,Vol19,No1:45,47 白酶和0.02%EDTA消化,离心.然后用培养基重 悬浮,成为细胞含量为2.5×10~/ml的细胞悬液, 接种于培养瓶中,每瓶接种1ml,置37?培养. 3培养液收集 分别于1,2,3,4,5和6d时收集细胞培养 液,每次收集样品3瓶,置一18?保存备用 4AA含?测定 细胞培养液经5%磺柳酸去蛋白质后由武汉大 学氨基酸工程中心用Hitachi835—5O型自动氨基酸 分析仪检测. 5Giuc及TG含?的测定 用Hitachi/BM747型自动生化分析仪,分别以 己糖激酶法和酶法(GPO法)测定. 结果 1AA含? 随着培养时间的延长,苏氨酸(Thr),精氨酸 (Arg),蛋氨酸(Met)和赖氨酸(s)含量明显 下降;谷氨酸(Glu),丝氨酸(Ser),组氨酸 (His),苯丙氨酸(Phe),异亮氨酸(1le)及胱氨 酸(Cys)含量有一定程度的下降;游离氨 (Amm),天门冬氨酸(Asp),丙氨酸(Ala)含量 则明显上升;甘氨酸(Gly),缬氨酸(Va1),酪氨 酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)无明显变化. 根据Thr,Arg含量作图1,由图1可见Thr及 Arg水平在do时最高,分别为21.85ms/100ml和 谣 鬟i 宝 占奢 嚣 梧 0123456 培养天数Daysofculture(d) Thr:?A坫:? 圈l不同培养时期龋胞培养j直Tar和Ar罟古量 Fig.1LevelsofArgmudThrincullm~mediumatdifferenttimes 【d】 19.29mgl00ml,此后逐渐下降,均在6d时至最低 水平,分别为8.40mgll00ml和9.86ms/100ml,降 幅在50%以上.根据Asp,Atom含量作图2,由图2 可见,Asp及Amm含量在时分别为次低及最低 水平,后逐渐上升,分别在d6及d达最高峰,为 2.3m异,10om】和4.76rag/100ml,升幅在30%以上. 根据lAIa含量作图3,由图3可见A】a在dn时为 1.39ms/100ml,d4时升至最高峰1.70ms/100ml. 此后d和d6保持较高水平. 123456 培养天数Daysofculture(d) Asp:?Atom:? 田2不同培养时期细胞培养磕A叩,bzn~a古量 Fig.2LevelsofAmadAnnaInmediumald~ermat dII.esfdl 【. 1 05 O l23456 培菲天数Daysofcultm~d) 田3不同培养时期细胞培养磕Ala古量 . 3LevelsAl|tnmediummdid?ttimes(d} 2Gluc含? Gluc含量变化见图4,由图4可知随培养时间 延长Gluc含量逐日下降.在d时最高,此后逐渐 下降,至d时达最低,其差别有高度显着性(P <0.01).对1—6d各组Giuc含量进行两两比较. 经Q检验,表明培养第1天与第2,4,5和6天之 间,第2天与第6天之间及第3天与第5和6天之 间培养液中Gluc含量的差别有显着性意义(P< 0.05).培养时间相差2d及2d以上的对比纽,除 65432lO 一一ES—5M格t翻砷, 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2001年2月第l9卷第1期 ChinJP~.dto]P~asitDis2o0l_01.Vo[.19.Nol:45,47’47 d4他组外,Gluc含量的差别均有显着性意义(P <0.05);而培养时间相差1d的对比组,除也/d3 组外,Glue含量差别均无显着性(P>0.05). 3TG含量 不同培养时期细胞培养液TG含量见图5.由 图5可知TG含量变动很小,其均值波动幅度仅 0.1mmol/L,经统计学处理其差别无显着性. 培养天数Daysof-culture(d) 囤4不同培养时期细胞培养j直Glue音量 F蟾.4Leb0fGluein~nlture~etlitmlat([Lfft~nmttimecd) (注:s=I.61.n=3经F检验F>F(63),P<0.0lNote:s=I.61F c,F>F(763),P<0O1) : 1 鞋 擅 柱 121 h 培养无数Daysofculture(d) 田5不同培养时期细胞培养j瞳TG音量 F1E.5LevelsofTGinoaltaremediumitdifferenttime(d) 注:s:0.I经F检验,F<F<e(0.4i),P>005NotS0.IF .F<F(041.P>O05 讨论 日本血吸虫成虫细胞培养液中Thr,Arg, G1110,Ile,Lys,His,Phe,Ser,bier和Cys含量随 培养时间延长而下降,其中Thr,Arg,Met和Lvs 下降明显,提示血吸虫细胞有可能从培养液中摄取 多种AA尤其是Arg和Thr供自身代谢需要.日本 血吸虫和曼氏血吸虫具有高活力精氨酸酶Arg被 虫体摄人后,可很快被转化为氨基戊醛酸,形成 谷氨酸和脯氨酸的中间代谢产物. 培养过程中细胞培养液中Asp,AIa及Amm含 量明显增加,推测可能与血吸虫向周围环境分泌 Asp,Ala等AA和Amm有关有资料表明血吸虫 可利用糖酵解产生的大量丙酮酸与氨结合形成Ala 作为氨的最终代谢产物排出体外. 血吸虫能迅速通过体壁利用外源性Gluc. Hobbs等发现曼氏血吸虫童虫细胞在含Glue的 DMEM中存活时间较长.Weller等采用1779培养 基,可在细胞水平为血吸虫细胞存活提供近似生理 需要的条件,该培养基中含有较高浓度的GIUC(12 gfL)”.本文结果提示日本血吸虫成虫细胞在生存 与生长的过程中有较强的利用GIUC的能力,培养 基中Glue含量迅速减少可导致日本血吸虫成虫细 胞能量供应不足. 脂类是构成血吸虫虫体的重要成分之一从本 文结果图5所见,细胞培养液中TG含量在1—6d 的培养期中变动幅度仅0.1nunol/L,其差别无显着 性(P>0.05),推测成虫从外界摄取TG的能力很 低. 综上所述,我们认为适量补充培养基中Gluc, Arg,r,Met和Lys等营养物质,及时更换培养 液以补充迅速消耗的营养,同时清除过量的Amm 等代谢终产物,对维持和促进血吸虫细胞生长繁殖 有重要作用. 由于GIUC,Arg,Thr,Met和Lys等营养成份 在培养第4天至第5天时下降迅速或达最低点,而 Asp,Ala和Amm也在培养第4天至第5天时上升 迅速或达最高点,因此在第3天,最迟第4天时更 换培养液有利于维持细胞生长. 参考文献 [1JHobbaDJ.FryerSE,Duimsl~aOR,a1.Odtumofcellsfromiu~’eni— w『姗日of&f山…mansoJnu邯lt0I,19H.whld0nSKTheculfit’atian/nvitroofceIlsderivedIrom uhSc/u:swsoma~m’onimethedolo~.criteriaforeuat/_邢cu]mreand developmentofrned/a.AmerJTmpMedHyg.19823I335—340. 『7陈佩惠周进龙主编医学寄生虫体外培养北京:科学出版杜, l995:390 收稿El期;2000-06-26编辑:庄兆农)