深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的影响

深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的影响 深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的 影响 现代医学(ModemMedk'alJourna1),2004年6月,第32卷第3期?l87? ? 论着? 深低温停循环对大脑皮层神经细胞凋亡的影响 陶运明,莫绪明,彭卫,戚继荣,钱龙宝,顾海涛 (南京医科大学附属南京JL童院心胸外科,江苏南京210008) [摘要]目的观察深低温停循环对大脑皮层神经细胞捌亡的影响一方法取sD大鼠 30只,随机分为3组:深低 温对照(DHC)组,常温对照(YFC)组和深低温停循环组(DHC,)组,录用大鼠深低温 双侧颈总动脉阻断后再灌注模型,在 2l?时将双侧颈总动脉阻断60min,再灌注24h后取大脯皮层细胞制成细胞悬液, 流式细胞仪分析细胞凋亡改变,电镜观 察细胞超微结构的变化,对实验数据进行统计分析结果NTC小有5只死亡DHC 组,NTC组和DHCA组的大脑皮层 细胞凋亡率分别为(2,20?0.43)%,(19,23?1.01)%和(4.72?1.01)%,差异仃显着意 义(P<0.001).结论深低温停 循环能增强大脑细胞对缺氧的耐受性,降低和抑制缺血诱发的恼细胞捌亡: [关键词]大鼠;深低温停循环;凋亡;流式细胞仪;冲经细胞;大恼皮层 [中图分类号]R363;R654.1[文献标识码]A[文章编号]167卜7562(2004)03-0187-03 Effectofdeephypothermiccirculatoryarrestoncortexneuron apoptosisofrats TAOYun—ming,MOXu—ming,PENGWei,QIJi--rong,QIANLong--bao,GUHai-.tao (DepartmentofCardiothoracicSm'gery,A.ffiliatedNanfingChiMrenHospital,,Iledical,A g210008,China) Abstract:Obj,lectiveToobservetheeffec'tof~teephyt~)thelanicciI'cula[o15arrest(DHCA )oncortexneuIDn apoptosisaftercerebralisehemia/reperfusioninjmyinrats.MethodsThirt. ySDPdtSweredMdedrandomly. into threegroups:deephypothenniccontrol(DHC)group,110111131temperaturecontrol(NTC)groupanddeeph}~othermie circulatoryarrest(DHCA)group.Modelofcerebralischelllia/l'eperftlsioninju1. 'ywerepreparedby60minocclusion followed24hofreperfusionofbilateralconllnoncarotidm-telw. hithedeephypothernlic(21?)rats.Cerebralcortex.- eswereremovedandthendissociated,nleasuredwithflowcytolnetlyana|yzecellat~)ptosis.Themorphologicalchange wereexaminedbyelectronnfiemseope.Datawereanal,'zedI)softwareSPSS11.5.ResultsFiveratsoftheNTC groupdiedduringtheexperimentation,therateofapoptosisof'DHCDoup,NTCgroupandDHCAgroupwere (2.20?0.43)%,(19.23?1.01)%and(4.72? 1.02)%respecti~rel,'(P<0.001).ConclusionThedecrease oftherateofneuronapoptosisafterdeephypothemfieeirculatmxartiestillratsllla. Vbecluedtodecreasedandinhib— itedcellapoptosisaftercerebraisehemia/repeffusioniUl3. Keywords:rat;deephypothermieeireulato~-arrest;avoptosis;flowcytonletry;neuron;cerebralcortex (ModemMedica~fJo,P///71a,f,21304,32:l87一l89) 自Lewis和Taufil于1953年在深低温停循环下手 术治愈l例5岁心脏房间隔缺损患儿以来,深低温停 循环(DHCA)已在心脏外科得到广泛应用.但DHCA 暂时或永久的神经系统并发症却高达4%,25%,而 且其安全时限为45,60min,限制了其在临床上的应 用.后来研究发现,这些迟发性的神经系统并发症与 脑缺血诱发脑细胞的凋亡!有关.研究深低温脑缺 血60min后神经细胞调亡的情况对深低温在临床上应 [作者简介]陶运明(1972一),男,安徽安庆人,主治医师,医学硕_L 用有很大的指导意义.本实验采用大鼠深低温颈总动 脉阻断模型,应用流式细胞仪和电镜技术观察深低温 脑缺血对神经细胞调亡的影响. 1材料与方法 1.1实验动物 选择健康雄性SD大鼠30只(南京医科大学动物 实验中心提供),体重180,230g,随机分为3组,即深 ? 188?现代医学(ModemMe~hc'alJourna1),2004年6月,第32卷第3期 低温对照(DHC)组,常温对照(NTC)组和深低温停循 环(DHCA)组,每组lO只: 1.2大鼠DHCA模型制作 大鼠用阿托品0.02mg?kg肌肉注射,30min后按 100mg?kg..腹腔注射氯胺酮麻醉?完全麻醉后固定 大鼠,在导丝引导下气管插管并固定,联接小动物呼吸 机,将呼吸机呼吸频率调为120次?min,,压强调到 0.02—0.05kPa,吸呼比为l:3.剃除颈部鼠毛,碘附 消毒皮肤,酒精脱碘.先用剪刀纵行剪开颈部皮肤,打 开右侧颈部筋膜,从正中打开颈外肌层,分别向左右沿 颈外斜肌间隙分离筋膜,找到颈总动脉,从伴行的神经 旁游离出动脉并套上丝线.用涂有石蜡油的温度计插 入肛门5cm,探测大鼠的体温(大鼠的肛温和脑部的基 本近似,通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温 度):当体温降至22?时停止降温,用动脉夹阻断两 侧颈总动脉,使体温维持在(21?1)?,60nfin后恢复 颈总动脉血流.用电热吹风机给大鼠复温,每分钟体 温恢复不能超过0.5?,大约在30min内将体温恢复 到32?,取动脉血作血气分析,将大鼠放入35?早产 儿培育箱复温,在2h内将体温恢复到38.5?,维持正 常体温4h后放置室温下正常饲养. 1.3其他模型制作 NTC组在不降温的情况下进行以上操作过程制 模,而DHC组的操作同深低温停循环组.但不阻断两 侧颈总动脉 1.4标本的处理 24h后将大鼠断头处死,迅速开颅,取脑皮层组织 50—100mg,40O目尼龙网研磨,PBS冲洗过滤,研磨后 组织放入离心管中用PBS稀释为lOflll,反复吹打,制 成单细胞悬液,l000r?min离心5nli11,PBS洗2次,再 加体积分数为70%的乙醇固定,4?过夜,次日4?离 心去上清,加200RNase(RNA酶)(1g?L),37?水 浴30min,再加500lPI(碘化吡啶)(25mg?L)染色 液,4?避光条件下染色30min.应用FCM记录氩离 子激发光波长488nIn处红色荧光,每个样本计数 10000个细胞,经FACSCCalibur流式细胞仪检测,Mod. tLT2.0软件绘制细胞数和凋亡细胞分布图. 同时取lITlInxlITlInxlITlIn的脑皮层组织,用5% 戊二醛固定4h以上送电镜检测,观察细胞超微结构 的变化. 1.5大鼠神经功能评分 采用Longa的5级评分标准.0级:无体征;l级: 动物不能完全伸其前肢;2级:动物肢体瘫痪,出现追 尾现象;3级:动物不能站立,打滚;4级:无自主活动, 有意识障碍 1.6统计学处理 采用SPSS11.5统计软件(Kmska1.Wallistest)分 析,数据进行1检验? 2结果 2.1实验大鼠存活情况 在实验过程中,NTC组大鼠有5只因脑缺血死亡, DHC组及DHCA组大鼠无死亡,经检验,3组之间有显 着性差异(1=12.0,P<0.05). 存活的大鼠中,NTC组在运动灵活性方面也较 DHCA组及DHC组差,4h后作Longa5级评分发现3 组之间神经系统损伤情况存在显着性差异(1= 25.49.P<0.01)(1) 表l3组大鼠神经系统功能损害情况只 2.2大脑皮层神经细胞的凋亡率 DHC组,NTC组和DHCA组的神经细胞凋亡率分 男1为(2.20?0.43)%,(19.23?1.O1)%,(4.72? 1.o2)%,经检验,3组间有显着性差异(1=17.31, P<0.001)? 2.3电镜观察结果 在透射电镜下可以观察到凋亡小体(图1),NTC 组出现凋亡小体较其他两组明显增多. 图l大鼠脑皮层细胞凋亡小体×1500 现代医学(ModemMedicalJourna1),2004年6月,第32卷第3期?l89? 3讨论 随着体温的降低,机体的代谢也随之降低.脑部 温度的降低可以降低脑细胞的代谢,提高脑细胞对缺 氧的耐受,故低温是脑保护的最基本技术.通常按体 温的高低将其分为:超深低温(4,16?),深低温 (17,28?),中低温(29,33?),轻低温(34,36?), 将中低温和轻低温统称为亚低温.据文献报道,机体 在l8,37?范围内体温降低与脑血流减少存在直线 关系,而与脑氧代谢下降呈指数关系.,体温从37? 降至27?,脑细胞代谢降低至正常的50%,体温降至 l7?,其代谢低至正常的8%. 大鼠的大脑供血主要是颈总动脉和椎动脉,两支 颈内动脉与两支椎动脉在大脑的基底部形成大脑动脉 环向大脑供血,而颈内动脉占脑总供血量的大部分,椎 动脉(主要为小脑,延髓,脊髓等生命中枢供血)仅占脑 总供血量的小部分.在常温下阻断颈总动脉,由于脑 部尚有椎动脉供血,故仍有部分大鼠得以存活,但由于 供血量明显不足,故引起脑细胞的坏死和凋亡.在本 实验中有5只大鼠在阻断颈总动脉过程中死亡,主要 原因是常温脑缺血引起脑细胞的大量急性坏死.NTC 组存活大鼠神经系统的损伤较重也与大鼠脑细胞坏死 和凋亡有关. 深低温停循环模型是在Sheng等的两血管阻断 法的基础上进行了改进.在大鼠的体温降到 l7,28?时将大鼠的颈总动脉阻断,虽然此时大鼠的 心脏仍有搏动,但深低温时大鼠的心率,血压都只有正 常时的1/5左右,心输出量显着下降,心脏泵血量只有 正常时的1/5,1/10.在本模型中虽然还有椎动脉对 大脑供血,但此时的椎动脉供血只有正常情况下的1/8 左右,而且血供主要集中在小脑,脑干,延髓和脊髓等 椎动脉供血区,大脑皮层的血供是通过椎动脉与大脑 动脉环间的非常细小的侧支来供给,可见在阻断双侧 颈总动脉时脑皮层的供血供氧量极低,基本可以忽略. 故这种脑缺血低流量模型可以作为大鼠深低温停循环 脑缺血缺氧模型来研究,特别是大脑皮质深低温脑缺 血的研究. 细胞凋亡是由于外来因素触发了细胞内预存的死 亡程序而发生的细胞自杀过程,是由特定基因控制的 细胞自主的,有序的死亡,又称程序性细胞死亡.细胞 凋亡是生命的基本特征之一,与细胞增殖共同维持机 体正常生长发育和内环境稳定.在多种应激因素如氧 化剂,毒素,Ca超载,缺氧以及其他促凋亡活性蛋白作 用下,线粒体释放出细胞色素C,在Apaf-1,d—ATP和 ATP存在下活化Caspase一9,导致细胞凋亡的激活:激活 凋亡特异性核酸酶能水解DNA,降解细胞骨架蛋白, 裂解DNA修复的关键酶——多聚ADP核糖多聚酶 等,导致细胞凋亡的发生.通过流式细胞仪检测细胞 断裂的DNA是现在常用的检测细胞凋亡的重要方法: 以往的主要集中在亚低温脑缺血一再灌 注后脑神经细胞的凋亡,在深低温条件下的脑缺血一再 灌注后脑细胞凋亡尚未见报道.很多资料研究显示, 细胞凋亡表达的最高峰时间是24h,可以持续1周 左右,故本实验检测大鼠脑缺血一再灌注引起脑神经元 凋亡的时间选择在再灌注24h.脑皮层和海马区是脑 缺血敏感区,缺血缺氧后脑细胞容易坏死和凋亡.由 于大鼠的海马区比较小,细胞数很少,为了能够满足流 式细胞仪的检测所需细胞数的要求,我们选用大鼠的 脑皮层作为研究对象.本实验研究发现:DHCA组凋 亡细胞百分率均明显低于NTC组,提示深低温停循环 能够增强脑细胞对缺氧的耐受性,延长对缺氧的耐受 时间,减轻脑细胞的损伤及因缺氧而造成的脑细胞的 凋亡;但深低温停循环大鼠脑缺血一再灌注后凋亡细胞 百分率比深低温对照组要高,提示深低温停循环虽然 可以降低脑细胞的代谢提高脑细胞对缺氧的耐受,但 不能完全逆转缺血引起的脑细胞凋亡. [参考文献] [1吴国祥,李承晏,李涛,等.亚低温对大鼠脑缺血一再灌注损 伤后Bcl-2,Bax和C—fos蛋白表达及损伤神经细胞凋亡的影 响[J.中华物理医学与康复杂志,2002_,24(10):605—607. [2]江朝光,齐弘炜,周春喜,等.深低温停循环时不同脑保护方 法对海马区神经元凋亡的影响[J].中华胸心血管外科杂 志,2003,19(2):100-102. [3:左连富.流式细胞术与生物医学[M:.沈阳:辽宁科学技术出 版社.1996.240. [4]IG.M~IT,HOSHINOS,IWAYAF,eta1.Cerebralbloodflowand oxygenmetabolismduringcardiopulmonarybypass【hmoderate h)3~othermicselectivecerebralperfusion【J].Cal~ovascSurg,1999, 7:106-II1. [5]SHENGH,LASKOWHZDT,PEARKS3EINRD,eta1.Character. izationofarecoveryglo"balcerebralischemiamodelinthemouse 【J].JNeurosciMethods,1999,88(1):103—109. [6]陈施艳,张志坚,许国英,等.亚低温对大鼠短暂全脑缺血后 神经元凋亡的影响[J].临床神经病学杂志,2003,15(2):129一 l31. [收稿日期]2003—12-26