医学论文：重组人骨形成蛋白2和重组人神经生长因子β在三度根分叉缺损修复过程作用研究

医学论文：重组人骨形成蛋白2和重组人神经生长因子β在三度根分叉缺损修复过程作用研究 重组人骨形成蛋白2和重组人神经生长因子β在三度 根分叉缺损修复过程作用研究 山东大学博士学位论文 分类号: 单位代码: 密级:公开 学 号: 厶茹只孥 博士学位论文 论文题目:重组人骨形成蛋白和重组人神经生长 因子旦在三度根分叉缺损修复过程的作用 研究 ..专 业 指导教师姓名日 年月山东大学博士学位论文 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文 不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出 重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的 法律责 任由本人承担。 、妒 一 论文作者签名:噼日期:上型互二型 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被 查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 导师签名:.旌兰』日期:坌应:二乡力山东大学博士学位论文 目 录 中文摘要英文摘要缩略语表前 言日 舌第一部分重组人骨形成蛋白和重组人神经生长因子在三度根分叉缺损修复过程的 作用研究材料方法 结 果 讨仑 参考文献 第二部分犬前磨牙再生牙周韧带中神经组织的形态和分布? 材料方法 结 果 讨仑 参考文献 英文论文致 谓发表论文学位论文评阅及答辩情况表山东大学博士学位论文??‘山东大学博士学位论文 重组人骨形成蛋白和重组人神经生长因子在三度根分叉缺损修复 过程的作用研究 专 业口腔临床医学 作者姓名闫香珍 指导老师杨丕山 中文摘要 背景和目的 通过炎症,创伤或肿瘤造成的牙周支持组织的水平缺损的重建在临床上依然是一个 难题。用组织学方法促进牙槽骨再生修复牙周疾病引起的牙周组织缺损是近年来的 研究热点。骨组织工程主要的瓶颈是形成的组织工程骨与天然的生理骨仍有很大差距。 可能的主要原因是没有实现组织工程骨的神经化。 生长因子在骨形成过程起很重要的作用,这主要是通过刺激间充质干细胞向硬组织 方向的分化。在过去的几年里,多种生长因子具有骨再生潜力,包括成纤维细胞生长因 子,血小板衍生因子,胰岛素样生长因子,转化生长因子,血管内皮细胞生长因子,和 骨形成蛋白。在这些因子中,重组人骨形成蛋白曲是促进牙周组织 再生的最具潜力的因子。除了它可以促进再生骨的量之外,它还可以安全的应用到病人 身上,在处理的区域可以形成正常的骨。但是形成的骨的质量并不那 么完美。最主要的缺陷是刺激再生的骨具有比较低的临床愈合能力,机械性能 比较差,还有异位成骨。这些异常阻碍了它对大的骨缺损的临床应用。因此找到新的方 法来改善再生骨的质及量非常必要。 越来越多的证据表明神经系统和骨的形成,修复和改建密切相关。正常骨组织中有 广泛的肽能神经分布,尤其在成骨活动活跃区域,新生骨组织中神经支配的现象更为显 著。在人长骨不连患者中,发现在局部组织中存在神经纤维缺失的现象,并认为失神经山东大学博士学位论文 支配可能是影响骨折正常愈合的原因之一。在截瘫和颅脑外伤伴有四肢骨折的患者中, 往往发现骨折骨痂异常增大,甚至出现关节周围异位骨化现象,然而在动物失神经实验 研究中,虽然证实骨痂形成加快且明显增大,但骨痂密度不规则,骨痂力学强度明显减 弱。在下牙槽神经切断的大鼠中,牙槽骨的改建活动被抑制。而再生的骨和这 些具有神经损伤的病人或实验动物具有相似的表现。我们的假说是能够调节神经系统的 神经来源的生长因子可能也会影响骨的改建。 神经生长因子是一种重要的神经营养蛋白,可以促进神经的生长分化,最 近也被报道它可以促进骨的改建活动,并且在骨折愈合过程起重要作用。另外,它还可 以促进人牙周韧带细胞骨及牙骨质相关蛋白,骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达,并且它还 调节血管内皮细胞和牙周韧带细胞的增殖和分化,这表明它在体 内促进牙周组织再生的 潜力。综上所述,这些之前的研究表明在促进新骨生成及改建方面可能有效。 因此,本研究将和局部联合应用到比格犬三度根分叉缺损处,观察 再生骨的质与量,并观察再生牙周组织中神经纤维的形态和分布。 方法 第一部分:本实验在六条比格犬的下颌,,前磨牙建立个炎性三度根分叉缺损 模型。和 一通过可吸收的凝胶局部应用到牙周缺损处。按拉丁方将 颗实验牙分为组,分别为:空白对照组作为对照组,空白凝胶组作为对照组, 凝胶.% /一,凝胶% /,凝胶.%?/ 一% 上/,凝胶.% /一% /。 八周后处死动物,再生牙周组织的质和量通过扫描电镜,钙磷比例及组织学测量进行观 测。 第二部分:本实验动物手术部分同第一部分。标本处理采用冰冻 切片,通过一. 免疫组织化学染色方法观察比格犬下颌前磨牙三度根分叉缺损再生牙周膜中神经的量, 形态及分布情况。 结果山东大学博士学位论文 第一部分:实验结果证明骨形成蛋白单独应用就可以促进再生骨的量。单独应 用组可以观察到更多的新骨生成伴随更高的钙磷比值。另外,扫描电镜观察显示在这一 组中新生的组织中胶原束的直径比对照组中的高。骨形成蛋白和神经生长因子联合应 用的两组比两个对照组可以观察到更高的钙磷比值,并且伴有胶原纤维表明的更多的钙 化物。另外,两种生长因子的联合应用比任何一种因子的单独应用促进更多面积的骨生 成和更多的牙骨质,两种生长因子对牙周组织再生存在协同作用。 第二部分:。免疫组织化学染色阳性的纤维可以在所有再生牙周膜中观察到。 但是它们的数目比较少而且大部分分布比较分散。再生牙周膜中切迹区域.阳性区 域对此区域的牙周膜面积除去牙齿,牙槽骨和血管的百分比为. ?.%, 明显低于正常对照.?.%。再生的鲁菲尼小体仅仅在个标本中的个观测到。 与正常牙周膜中的鲁菲尼小体相比,再生牙周膜中的具有更少的分支。细的自由神经末 梢在再生牙周膜中占主导地位。它们大多数外形平滑,末端逐渐变细不形成任何末梢。 另外,再生的牙周膜中牙周韧带在牙槽骨和牙骨质的附着比较松散。大多数再生的神经 纤维和血管相邻,有些是沿牙周胶原纤维排列。有时在牙周组织改建活跃的区域可以看 到神经的生长。 结论 局部应用和 一可能会促进比格犬的三度炎性根分叉缺损再生骨的质 和量。鲁菲尼小体在再生牙周膜中较少观察到,神经组织可能参与到牙周组织的改建。 关键词牙周病;再生;骨形成蛋白;神经生长因子山东大学博士学位论文 一 . ,,,, . . .? . ., , , , , , , , . 一.,一 ,.. , 一 山东大学博士学位论文., .. ... , ., , , , . , . . ,, .. , ,. . , , /, ., , ., . .山东大学博士学位论文: , , .: : ,:,:.% :.% :%:.%% %. , , . // ,:,. ,,... .. /.,. 一 /,.. , . . : .一山东大学博士学位论文.. . , . .士.%士.., . .士.%. .. .? , . . 一; ;; 山东大学博士学位论文 缩略语表 缩略语 英文名 中文名 乙二胺四乙酸 成纤维细胞生长因子引导组织再生术 苏木素一伊红染色 磷酸盐缓冲液血小板衍生因子 胰岛素样生长因子 转化生长因子血管内皮细胞生长因子 牙周膜 扫描电镜 棚 / 钙磷比 神经生长因子 . .蛋白基因产物. ‘ 肿瘤坏死因子 微型电脑断层扫描 山东大学博士学位论文 ‘‘?一 刖吾 用组织工程学方法促进牙槽骨再生修复牙周疾病引起的牙周组 织缺损是近 年来的研究热点。骨组织工程是用少量的组织细胞,经体外培养 扩增后修复大块 骨组织缺损,同时可依据缺损情况任意塑型,达到理想的形态修 复,最终实现 真正意义上的功能重建。但是,该项技术发展到今天,沿着传统的 思路来构建活 体组织工程骨的研究遇到了挑战。本文试图从骨组织工程技术中存在的问题作为 切入点,初步探讨其可能的原因,以探索骨组织工程技术研究的创新之路。 细胞培养 .存在问题 培养的细胞在功能和行为上与体内的细胞有很大差异。这可以被概括为:? 培养的成骨细胞不能有组织的分泌胶原纤维,形成板层骨结构,不能以体内所见 的方式沉积具有天然骨特征的骨矿物【】。?从体内到体外环境时细胞会发生行 为变异与转型,即培养休克。这些细胞培养通常维持仅三代表型漂移就变得很明 显】。?长期培养的成骨细胞会丧失向骨面分泌骨基质的分泌极性,跨越细胞 孔壁生长,阻碍支架内外代谢产物和营养物质的交换,造成组织在支架分布不均 。?培养的骨髓基质干细胞逐渐失去增殖潜力】。?随着培养时间的延长, 细胞的生长速度放缓。形态从纺锤状到扁平较大的形态,并显示 端粒长度的下降, 所有的迹象都显示老龄化问题。延长的体外扩增也影响骨髓基质干细胞的分化潜 能【。?培养的间充质干细胞存活率降低】。 .原因 影响培养细胞的因素除大家熟知的生物学微环境如植入物的营养供给及诱 导种子细胞增殖和定向分化的生物信息外,力学和电学因素也会对其造成影响。 ..力学微环境 成骨细胞、骨细胞等是力学敏感细胞。骨组织丧失重力负荷或肌肉收缩的刺 激会使骨组织产生变形或微损害,骨代谢遭受破坏。等对鼠牙周组织成骨 细胞施加载荷,加载小时后,碱性磷酸酶较对照组增长了倍,并在加载 天后依然维持这一水平,天后出现类骨质的沉积,得出载荷首先使成骨细胞发 山东大学博士学位论文 生分化,进而诱导骨基质沉积的结论。由于人体细胞是处于机体提供的微动力学 环境中生长的,在体外采用传统的细胞培养方式和条件很难满足 立体组织器官的 细胞生长要求,细胞经常发生去分化现象,失去正常的形态与功能。目前应力对 分泌纤维成分的含量、分布与排列即组织形成的影响研究尚少,而这恰好是自体 组织形成的必要前提。因此,研究模拟体内生理条件下组织生长的微动力学培养 环境、应力与生长的关系对组织工程有着非常重要的意义。 ..电学微环境 骨组织亦有电生理特性,其代谢活动和机械形变能够产生直流电和交变电 场;外来电场也可以影响骨骼的生长与改建。外来电场的负极能诱导成骨细胞的 形成与分化,可以缩短骨不连、骨折患者的愈合时间。破骨细胞同样也受到电磁 场的影响。张加理等】研究发现牙体硬组织表面电位可影响骨改建:荷正电的 牙釉质面促进骨的吸收破坏,荷负电的牙骨质面促进成骨,加快细胞外基质的合 成分泌,促进骨的形成与成熟。脉冲电磁场、高频率电刺激均会对骨细胞的成骨 功能产生影响。在脉冲电磁场作用下,人体躯干、髋部骨骼等表 面或内部将产生 生物物理刺激电磁场效应,提高骨密度。 成骨能力及方式 .存在问题 等】研究表明细胞在支架上的分布影响移植后的最终成骨能力,种 子细胞限制在支架最外层比高浓度分布在整个种植体内的成骨能力强。等【 组织学表明,骨形成首先是在周边的支架,其次是比较有限的矿物沉积在支 架内部。而在生理骨发育过程中,成骨细胞在骨小梁表面不断增长加粗形成松质 骨,松质骨的外侧部分逐步改建为密质骨。骨外膜中骨祖细胞分化为成骨细胞, 在骨干表面添加骨组织使骨干变粗。而在骨干的内表面,破骨细胞吸收骨小梁使 骨髓腔横向扩大。可见生理骨的形成是由内向外逐步生长改建的,而组织工程骨 与之相反。 .原因分析 ..组织工程骨的血管化 山东大学博士学位论文 植入支架内部细胞的氧气与营养的供应是值得深入研究的问题。种子细 胞在缺乏足够的营养时,其代谢受到影响甚至死亡,造成成骨能力下降。充足的 血供能将成骨前体细胞、相关信号分子、营养物质等大量携带到局部微环境中, 并带走局部代谢产生的废物及坏死分解产物。此外等】发现血管化可能有 助于微环境稳态,并增加间质前体细胞在病灶临近的募集。大块组织工程骨如上 下颌骨常有一定的直径和长度,植入体内后,脱离了正常骨组织中血供提供的丰 富营养,也脱离了体外可控的培养条件,依靠周围组织的血管长入存在速度慢和 血供不足的问题。因此构建具有血管化的组织工程骨对支架内部的成骨能力具有 十分重要的意义。 ..骨膜的构建 骨膜中含有成骨细胞、破骨细胞、问充质干细胞及血管内皮细胞,是骨生成 与改建的主要细胞来源及骨膜成骨的基础。骨膜血管丰富,同时还合成转化生长 因子、胰岛素样生长因子及骨形成蛋白等重要生长因子。构建带有骨膜的复 杂组织工程骨会使其成骨能力及方式有很大改进,但此项技术无疑还有很长的路 要走。 组织工程化骨 .存在问题 形成的组织工程骨与天然的生理骨有很大差距:?组织工程骨比自体移植骨 的痊愈能力低。?功能性整合的出现被继续保留的缓慢降解的支架材料与诱 导成骨的信号的剂量或传递所限制【】。不可吸收材料在试验最后阶段仍保留在 骨缺损缝隙内,虽然能行使功能,但这种生物材料和骨的混合体不能完全重新建 立骨整合。?组织工程骨不能完全替代病损的功能,特别是负重部位的功能 替换,涉及生物力学,移植效果尚难确定。?没有证据表明组织工程骨具有感觉 功能。?组织工程骨的自我改建能力低。 .原因分析 ..破骨细胞的引入山东大学博士学位论文 骨是~种动态性组织,它通过不断形成和吸收以起到塑形和维持形态等作 用。骨的改建是从骨吸收开始而后骨形成。破骨细胞是骨吸收的必要条件,它必 须通过征集及激活两个过程才能产生骨吸收作用,对骨的改建起作用。研究表明, 破骨细胞的缺乏会导致骨发育过程中骨基质排列紊乱、矿化缺陷、成骨细胞减少 以及成骨细胞行为异常.成骨细胞在骨形成表面的层状排列以及向骨表面方向沉 积骨基质的能力丧失。等研究发现当把缺陷鼠的骨原基移植进正常鼠的 肾包囊下并形成了嵌合体,由于有正常鼠向缺陷鼠骨原基提供破骨细胞,经过一 段时间植入后,缺陷鼠的骨原基形成了正常的骨组织结构。他们提出破骨细胞对 成骨细胞调节的缺乏是破骨细胞缺乏动物产生明显骨缺陷的原因;破骨细胞在骨 发育中对成骨细胞骨形成具有重要的调节作用。等】研究发现,经过对 骨片表面天的破骨细胞预处理,形成的骨钙、转化生长因子、等比 塑料和未经处理的骨片显著增加。目前尚没有组织工程骨引入破骨细胞的报道, 它的引入可能会解决组织工程骨中存在的许多问题】。 ..组织工程骨的神经化 骨有复杂的自主神经和感觉神经支配,骨骼细胞中有某些神经肽的受体,如 神经肽、降钙素基因相关肽、血管活性肽及物质。细的有髓神经纤维和无髓 神经纤维与营养血管伴行进入骨和骨髓,并位于哈弗氏管中的血管周围间隙内。 正常骨组织中有广泛的肽能神经分布,尤其在成骨活动活跃区域,新生骨组织中 神经支配的现象更为显著。神经生长因子除营养神经外,还参与骨折愈合 的过程。研究发现在正常骨组织和骨折骨痂中有及其受体的表达,同时局 部给予外源性对骨折愈合具有促进作用。而在人长骨不连患者中,发现在 局部组织中存在神经纤维缺失的现象,并认为失神经支配可能是影响骨折正常愈 合的原因之一。在截瘫和颅脑外伤伴有四肢骨折的患者中,往往发现骨折骨痂异 常增大,甚至出现关节周围异位骨化现象,然而在动物失神经实验研究中,虽然 证实骨痂形成加快且明显增大,但骨痂密度不规则,骨痂力学强度明显减弱。有 研究证实,肽能神经具有抑制破骨细胞活性的作用,神经切断可导致抑制作用的 减低,从而引起破骨细胞活性的增高,并导致骨质疏松的发生】。破骨细胞的 山东大学博士学位论文 过度活跃导致骨小梁结构的改变。由于松质骨力学强度由骨量和骨结构共同决 定,因此认为切神经后所致破骨细胞活性的增强是导致骨密度不均匀、力学强度 下降的原因。还有研究在成年大鼠的不同部位造成神经损伤,通过在骨骼肌中放 置冻干皮质骨,比较异位成骨情况。结果发现,颅脑损伤组呈最典型的成骨加速 表现,脊髓损伤组则表现为间充质细胞活性下降、成骨延迟,周围神经损伤组也 表现为成骨加速。这个现象说明神经系统对骨形成的影响是复杂的,推测皮层神 经元对成骨有双向调节作用,而脊髓层次的神经元的过度活动可 以刺激成骨。 等【认为下丘脑及其控制的自主神经系统是调节骨动态平衡的关键。 神经系统与骨生长发育、修复、重塑关系密切,但目前尚无组织工程化骨组织中 神经重建的研究报道。 小结 随着骨组织工程研究的深入,模仿体内各种生物、物理和化学条件,构建与 生理骨相似的能实现同步血管化与神经化的复合组织工程骨,并能进行自我改建 使之符合仿生学观点,是未来研究的方向。山东大学博士学位论文 参考文献, , ,, , , ., / . : .;:?. .” 】 , , ” :. ...;: 【】 , , ., ..;:.. , 【】 , , , .. ? . .;: . , .: . . ;: 】 , , , . , , . : . .; , 【】 , .. .. .;:】 , , . , ,.: . .; , , , . , 山东大学博士学位论文 . :. .;: ., 【 ,..;: .. .。 ,互乃 : .: ?. .; . , , , , ,:一. .;:.. , 【 ,, , : . :..; . , , , , , , 【 . : : . .; , ...;:?. , , ,几. 【 ?一,一, . : : . .;山东大学博士学位论文., .: ;:. 山东大学博士学位论文 第一部分重组人骨形成蛋白和重组人神经生长因子在三度 根分叉缺损修复过程的作用研究 通过炎症,创伤或肿瘤造成的牙周支持组织的水平缺损的重建在 临床上依然 是一个难题,生长因子在骨形成过程起很重要的作用,这主要是 通过刺激间充质 干细胞向硬组织方向的分化。在过去的几年里,多种生长因子具 有骨再生潜力, 包括成纤维细胞生长因子,血小板衍生因子,胰岛素样生长因子,转化生长因子, 血管内皮细胞生长因子,和骨形成蛋白】。在这些因子中,重组人骨 形成蛋白是促进牙周组织再生的最具潜力的因子,】。除了它可 以促进再生骨的量之外,它还可以安全的应用到病人身上,在处理的区 域可以形成正常的骨】。但是有几个在人及动物上的研究表明形成的 骨的质量并不那么完美.】。最主要的缺陷是刺激再生的骨具有比较低 的临床愈合能力【】,机械性能比较差,还有异位成骨】。这些异常阻碍了它 对大的骨缺损的临床应用。不幸的是,并没有多少研究致力于改善再生骨的质。 因此找到新的方法来改善再生骨的质及量非常必要。 越来越多的证据表明神经系统和骨的形成,修复和改建密切相关,】。肽 能神经广泛分布与正常的骨组织,尤其是新生的骨组织【】。另外,具有神经损 伤的病人也表现有更高的骨折率和异位成骨,】。具有神经病变的猫的骨的 质及量均下降。另外,在去除神经的大鼠可以发现骨折愈合的改变和更弱的 骨痂【】,在下牙槽神经切断的大鼠中,牙槽骨的改建活动被抑。而 再生的骨和这些具有神经损伤的病人或实验动物具有相似的表现。我们的假说是 能够调节神经系统的神经来源的生长因子可能也会影响骨的改建。 神经生长因子是一种重要的神经营养蛋白】,可以促进神经的生 长分化,最近也被报道它可以促进骨的改建活动】,并且在骨折愈合过程起重 要作用【】。另外,它还可以促进人牙周韧带细胞骨及牙骨质相关蛋白,骨桥蛋 白和碱性磷酸酶的表达,并且它还调节血管内皮细胞和牙周韧带细胞的增殖和分 化,这表明它在体内促进牙周组织再生的潜力.。综上所述,这些之前的研 究表明在促进新骨生成及改建方面可能有效。山东大学博士学位论文 因此,本研究将和局部联合应用到比格犬三度根分叉缺损处, 观察再生骨的质与量。 材料与方法 实验材料 .主要试剂 重组人骨形态发生蛋白一公司,美国; 重组人神经生长因子公司,美国; 藻酸盐凝胶山东大学威海国际生物技术研发中心研制,吉爱国教 授惠赠 戊巴比妥钠中国医药上海化学试剂公司; %多卡因,青霉素钠,生理盐水购自山东大学口腔医院药房; 多聚甲醛/津市广成化学试剂有限公司; 乙二胺四乙酸二钠天津市广成化学试剂有限公司;培养基 ,公司, 美国; 盐酸天津市广成化学试剂有限公司; 氢氧化钠天津市广成化学试剂有限公司; 无水乙醇天津市广成化学试剂有限公司; 梯度乙醇%一% 十二水磷酸氢二钠天津市广成化学试剂有限公司; 二水磷酸二氢钠天津市广成化学试剂有限公司; 氯化钠济南试剂总厂; 多聚赖氨酸公司,美国 二甲苯烟台三和化学试剂有限公司; 苏木素,伊红上海蓝季科技发展有限公司; .试剂的配制山东大学博士学位论文 的配制:氯化钠、十二水磷酸 氢二钠、.二水磷酸二氢钠溶于适量蒸馏水中,待完全溶解后,加 蒸馏水至 。 %多聚甲醛/. ..的配制:多聚甲醛溶于 溶液中,加温至。左右,不断搅拌,成为乳白色液体。滴加数滴/ 的至溶液澄清,并加调值至.。 %乙二胺四乙酸二钠 脱钙液:乙二胺四乙酸二钠 , /盐酸调至 缓冲液 . ,加氢氧化钠磁力搅拌溶解后,用 . .主要仪器 扫描电镜 ;,东京,日本 线能谱仪 : 超低温冰箱日本三洋; 超纯水及除菌系统法国; 组织切片机德国; 海尔电冰箱一; 光学显微镜及照相系统日本?; 电热恒温干燥箱一,上海精宏实验设备有限公司; 电热恒温水槽一,上海精宏实验设备厂; 电热恒温培养箱. 型,天津中环实验电炉有限公司; 体式显微镜及配带数码相机,日本 ? .图像分析软件美国; 电子天平日本 ,一 定时恒温磁力搅拌器?型,上海沪西分析仪器厂 慢速台钻美国 ; 眼科剪眼科镊组织剪牙周探针锄形洁治器; 各种型号管、吸头江苏三和申华公司; 一次性滤器公司;山东大学博士学位论文 微量移液器公司; 厌氧菌培养箱:英国 麦氏比浊仪:美国公司 ??型净化工作台苏州净化设备公司; 蒸汽消毒器山东新华医疗器械厂; .玻片处理 将载玻片在洗衣粉水中浸泡约,去除表面可见污渍流水冲净,干 燥后 置于浓酸中浸泡过夜,取出后置于流水下冲洗?;%乙醇溶液浸泡 约 后,绸布擦干。在干净塑料器皿中用蒸馏水:稀释多聚赖氨酸,将 上述洗 净干燥的载玻片室温下浸没于盛有多聚赖氨酸: 稀释的塑料器皿中 后,捞出后放于玻片架上,超净工作台中自然晾干,清洁纸包装后置于 ?冰箱备用。 实验方法 .实验动物与实验设计 条雌性健康纯种比格犬,?个月,体重~,,平均体重., 购买自广州医药工业研究所。每只下颌双侧的第二三四前磨牙,总共颗为实 验牙。按拉丁方设计将颗实验牙分为组,分别为:空白对照组作为对照 组,空白凝胶组作为对照组,凝胶.% /一,凝胶% /,凝胶.% /一% /,凝 胶.% /% /。试剂剂量根据以往的实验 研究选择确定,。选择藻酸盐凝胶的原因是因为它已广泛用于组织工程领 域神经化,血管化及骨化诱导因子的载体?。每组个牙位,观察时间为 周。无菌藻酸盐凝胶为山东大学威海国际生物技术研发中心研制,吉爱国教授 惠赠。将重组入骨形态发生蛋白一公司,美国与重组人神经生长因子 公司,美国分别按照分组剂量浓度与无菌藻酸盐凝胶在超净工作台下混 合置于?冰箱后备用。山东大学博士学位论文 .厌氧菌的培养 山东大学口腔医院牙周科门诊慢性牙周炎一例,选择探诊深度一的两个 位点,用无菌刮匙仔细去除龈上菌斑后,棉卷隔湿,吹干,用刮治器插入龈 沟底采集龈下菌斑,放入厌氧转送液中,室温下涡旋震荡器 分散菌斑。分散的 稀释液接种于 细菌溶液倍梯度稀释,取 液体培养基,。厌氧培 /左右,以备接 养~ 。培养后用参照麦氏比浊管稀释至. 种使用。 。术前准备 高压消毒实验用各种器械,术前小时禁食,动物称重后,术前半小时注 射%戊巴比妥钠用生理盐水配制,按 /的剂量,经犬小隐静脉注射,速 度 /,注射时观察犬的反应情况,根据麻醉效果于术中追加适量加以维持。 .炎性牙周组织缺损模型的建立 %戊巴比妥钠全麻下将狗固定于手术台上,碘酊消毒口内、口外,铺无菌 巾,并以%利多卡因与/,肾上腺素局部注射术区,于第一前磨牙远中至 第四前磨牙远中颊测作沟内切口,翻开粘骨膜瓣至前庭沟处,充分暴露骨壁。以 每只犬下颌两侧的第、、前磨牙、、作为实验牙,制备人工牙周 ?度根分叉病变,其缺损范围:根分叉垂直向高度降低约为 用牙周探针 测量,图。缺损只限于根分叉区以及颊测并不涉及两牙之间牙槽骨。缺损制 备时边用生理盐水冲洗边用低速手机和球钻和裂钻小心制备。整个手术过程中注 意时刻注意动物的呼吸和心跳。在暴露的根分叉内放置高压消毒的棉球,并注入 含厌氧菌的培养基,以诱导炎性牙周缺损形成图。组织瓣完全 复位,用号线缝合,术后软食一周,周后形成炎性牙周组织缺损实验模型。 山东大学博士学位论文 .炎性牙周组织缺损的治疗 术后两周从根分叉中取出厌氧菌棉球,用双氧水和生理盐水大量冲洗洗,菌 斑控制两周.%氯己定擦洗每天一次。两周后行第二次手术,按拉丁方设计 将颗实验牙分为组,分别为:空白对照组作为对照组,空白凝胶组 作为对照组,凝胶.%.一,凝胶% 咖心, 凝胶.%.%.,凝皎.% ‖“ .% /。常规%戊巴比妥钠全麻、固定于手术台上,碘 酊消毒口内、口外,铺无菌巾,于第一前磨牙远中至第四前磨牙远中颊测作沟内 切口,翻开粘骨膜瓣至前庭沟处,,平整根面,去除残留肉芽组织,并在缺损区 根面上用球钻作平齐于牙槽骨嵴的切迹,作为组织学观察的标志点。生理盐水冲 洗缺损区,无菌棉球吸干,然后根据分组结果相对应地植入含不同生长因子的凝 胶或空白对照图,组织瓣冠向复位,用.号线缝合。 图.炎性三度根分叉缺损制作和治疗的手术过程山东大学博士学位论文 在下颌第二三四前磨牙制作毫米深的三度根分叉缺损 将浸有厌氧菌的棉球放入所有的根分叉缺损中 棉球放入两周后,炎性根分叉缺损形成,伴有明显的炎症和肿胀 治疗手术当天手术前的下颌前磨牙区的大体观察 一被放入根分叉缺 可降解的藻酸盐凝胶单独或加有或/和 损中 手术八周后,术区伤口愈合情况,没有感染化脓 .术后处理 术后 连续肌注×单位的青霉素预防感染,软食一周防止咬合力对 术区影响,.%氯己定擦洗每天一次以控制菌斑。 .组织标本的制备 术后周,,常规%戊巴比妥钠全麻,将狗固定于手术台上,经双侧 颈总动脉插管灌注新鲜配置%多聚甲醛循环内固定处死动物,直至牙龈变硬, 颜色变白停止灌注%多聚甲醛,每只用量约毫升。取下颌骨,标本分切, 常规%多聚甲醛。固定。 .扫描电镜及线能谱仪观测 固定过夜后,颊测沿牙齿表面做沟内切口,翻开粘骨膜瓣,暴露新生牙槽骨, 用锄形洁治器于颊侧最高点取少许新生骨组织,经生理盐水和反复冲洗, 干燥。真空中喷碳喷金后,作扫描电镜观察.同时用线能谱仪测定新骨各个 微区、元素含量。 .组织学观测 剩余标本在流水冲洗下用装有钻石轮的打磨机将标本分切成以每牙为单位山东大学博士学位论文 的标本,%多聚甲醛。继续固定两天,取出,流水冲洗时。修整下颌骨, . ./ 去除近、远中多余结构。% 脱钙,每周更换 两次脱钙液。随着时间的进行,将周围多余组织以锐利的刀片切下,最终制备成 毫米左右厚的牙周组织标本,用探针轻刺能刺入时即为脱钙适宜,脱钙完成后 月左右,流水冲洗去除表面的酸液,每牙分成颊侧大半及舌侧小半两半, 颊测标本梯度酒精脱水%;%;%;%过夜;% ;% ;% ;% ,透明二甲苯透明两道,每道约,浸蜡 ?浸石蜡 ,浸石蜡 ,,石蜡包埋,组织切片,常规染色,封片。 ..石蜡切片 连续切片,。 取石蜡块, 切片机上制备近远中向 中展片,多聚赖氨酸包被的玻片捞片,烤箱中烤 片小时以上。 .. 染色 二甲苯 脱蜡各 ;% ;% ;% ;% 梯度酒精水化,% :过%、%、%后入水; 将玻片置于苏木素染色 %盐酸酒精分色 流水返蓝 伊红染色 梯度乙醇上行脱水,每缸 二甲苯透明×次 中性树胶封片 光学显微镜下观察并照相。山东大学博士学位论文 。 观察和测量 每组颗牙,每个标本选择个微区进行扫描电镜线能谱/原子个 数比测定,结果以、元素的原子个数的百分含量表示,并进行扫描 电镜形 态学观察。染色每标本分别取张切片观察,在普通光学显微镜下观察新生 牙周组织生长情况,包括新生牙槽骨,牙骨质及牙周膜的情况,有无异位骨形成 及牙周膜纤维的排列。用体式显微镜白带数码相机拍照,在图像分析软件 .下对其进行组织学测量。测量指标包括图: .图. 组织学测量示意图 :骨缺损高度;:新生牙槽骨面积百分比;:新生骨小梁面积百分 比;:新生牙骨质长度百分比;:切迹;:根分叉穹窿山东大学博士学位论文 骨缺损高度,:根分叉穹窿到根部切迹 的距离新生牙槽骨面积百分比 ,:即新生牙槽骨的面积与骨缺损面积之比。新生骨小梁面积百分比 ,:即新生骨小梁的面积与骨 缺损面积之比。 新生牙骨质长度百分比 ,:即新生牙骨质的总长度与骨缺损表面近中切迹到远中 切迹的长度之比。 .统计学处理 每个标本的张切片测量值取平均数,作为这个标本的测量值,所有数据输 入计算机用统计学软件 .,计量资料以均数?标准差表示,因实验动物 数目过少,未行统计学检验分析。 结果 临床观察 术后各组动物均无死亡。第一次手术两周后,我们成功的在条比格犬中制 作了个炎性三度根分叉缺损,伴有重度炎症和肿胀图,随后在愈合的 八周内,各组动物术后进食及精神状态均良好,伤口愈合正常,没有感染化脓现 象图 。治疗性手术后一周,牙龈炎症较明显,局部充血,有轻度肿胀。之 后炎症逐渐减轻,术后两周时基本恢复正常。术后八周,各组牙龈色、形、质正 常,牙周愈合良好,实验牙部位均未见明显的牙石和软垢。口腔内无新的病变出 现。 扫描电镜观察与钙磷比值分析 扫描电镜线能谱/原子个数比值测定的结果见表。术后周两种生 长因子联合应用组即第五组第六组新骨/比值高于两个对照组,应用.% %的第五组的/比值最高,为.?.。扫描电 镜观察与钙磷比值分析结果一致。扫描电镜显示两个对照组的新生骨组织胶原纤 维排列疏松图,,伴有球状钙化沉积图。而其它四个实验组的新山东大学博士学位论文 生骨组织结构致密,并伴有层状骨沉积图,图。在两个对照组中,网状排 列的胶原纤维束疏松的排列,其间可以看到许多空隙图。第五组即.% % ?应用组的新生组织表面基本全被层状钙化组织覆盖图 ,。并且神经生长因子应用部位的胶原纤维束第,,组比其它组 第,,组的要粗一些。 图.不同处理组八周后再生骨表面的代表性扫描电镜图片 对照组,对照组,.%,% 一,.% % 一,和.%% 一. 山东大学博士学位论文 两个对照组的新生骨组织胶原纤维排列疏松,,而其它四个实验组的 新生骨组织结构致密,并伴有层状骨沉积。第五组即.%% 应用组的新生组织表面基本全被层状钙化组织覆盖。神经生长因子应用部 位,,的胶原纤维束箭头比其它组,,的要粗一些并且有更多 的钙化沉积。方框中的更高放大倍数图像见图。 图.图方框内的更高倍数图像 在两个对照组中,网状排列的胶原纤维束疏松的排列,其间可以看到许多空 隙。新生组织表面基本全被层状钙化组织覆盖。 组织学观察 染色组织学观察结果显示,愈合后的根分叉缺损部位由上皮,结缔组织, 新形成的牙槽骨,细胞性牙骨质和牙周韧带组成。没有标本观测到异位骨化和无 细胞牙骨质的新生。根分叉的冠方有长结合上皮的长入,轻到中度的炎性浸润和 一 结缔组织附着图,图。只有第五组也就是.%% 应用组的个标本中的个标本观察到了近乎完全的牙周组织再生,并且再生骨 组织的结构与正常牙槽骨比较接近。新生牙槽骨具有良好的骨小梁结构,骨髓腔山东大学博士学位论文 壁表面可见成骨细胞,骨髓腔内有许多新生血管。然而在两个对 照组中,只观测 到很少的牙槽骨再生图。,、 、. ,‘,图.八周后,不同处理组的三度根分叉缺损的近远中向切片染色图片 对照组,对照组,.%,%.% %和.%%.箭头示切迹;在四个 实验组中,,,可观测到牙周组织再生,包括新生的牙槽骨,牙周韧带和牙 方框中的更高放大 骨质,然而在两个对照组和中,只有很少量的骨再生。 。 倍数图像见图。放大倍数,’ ;,,和 在四个实验组中,愈合区域的牙本质壁的大部分被新生的细胞性牙骨质覆盖 图.。在有些保留有旧牙骨质的区域周围,可以观测到排列规则的较厚的 细胞性牙骨质层图。这些新生的细胞性牙骨质一般与根面牙本质直接接触, 有时表面可以看到骨吸收陷窝图。两个对照组中也有牙骨质再生但是一般 局限于缺损的切迹根方附近图。牙周韧带的再生情况在实验组和对照组中山东大学博士学位论文 差异较大。在四个实验组中,我们可以观测到斜形排列的胶原纤维束图, 排列不规则的纤维结缔组织图,新生牙周韧带的有些区域可以观测到大量 的新生血管图,而这些都与实验处理因素无关。在没有新生牙骨质的根面, 牙周膜纤维排列一般较疏松,与牙根面和新生牙槽骨的结合不紧密,有些区域可 见空隙。而在两个对照组中,可以观测到位于新生牙槽骨和牙根表面问的排列相 对疏松的纤维结缔组织图,。 ‘, ? . 图.图方框内的更高倍数图像 图和显示根分叉缺损的冠方部分有长上皮的长入,轻到中度的炎性浸 润和结缔组织附着,在新生的牙槽骨和根面之间可以观查到相对疏松排列的纤维 方框中的更 结缔组织;图,,,显示在四个实验组中有更多的新骨形成。 高放大倍数图像见图。.山东大学博士学位论文 ’..。蕊露 『:一 ..霪谬:‘ 图.图方框内的更高倍数图像 在四个实验组中,愈合区域的牙本质壁的大部分被新生的细胞性牙骨质覆盖 .,有些区域还可以观测到大量的血管,斜形丰的胶原纤维束, 排列不规则的纤维结缔组织。在有些保留有旧牙骨质的区域周围,可以观 测到排列规则的厚的牙骨质层。这些新生的细胞性牙骨质与根面牙本质直 接接触,有时表面可以看到骨吸收陷窝。两个对照组中也有牙骨质再生但 是一般局限于缺损切迹附近,在新生牙周韧带的区域被疏松的胶原纤维充 满。。 组织学测量山东大学博士学位论文 组织学测量的结果见表。六组之间的骨缺损高度相差不大。第三组即.% 衄单独应用组新生牙槽骨面积百分比和新生骨小梁面积百分比明显高于第 二组即空白凝胶对照组。第五组和第六组即两种生长因子联合应用组的新生牙槽 骨面积百分比,新生骨小梁面积百分比,和新生牙骨质长度百分比都明显高于两 个对照组。另外,第五组即.%%.联合应用组促进牙周组 织再生的能力最强,新生牙槽骨面积百分比,新生骨小梁面积百分比,和新生牙 骨质长度百分比在所有六个组中的平均数最高。两个对照组中仅有少量的牙周组 织包括新生的牙槽骨,牙周韧带和牙骨质再生,而空白凝胶对照组再生的牙 周组织量最少。 表八周后,经过不同处理的根分叉缺损的钙磷比值和组织学测量结果均数 ?标准差 一样本数目::骨缺损高度;新生牙槽骨面积百分比;: 新生骨小梁面积百分比;:新生牙骨质长度百分比 讨论山东大学博士学位论文 本文的研究目的是将和.应用到比格犬的炎性三度根分叉 缺损并评价其联合应用的再生能力。我们的假说是两种生长因子的联合应用可以 改善再生骨的质和量。再生骨的质通过扫描电镜观察再生骨的表面形貌并对其钙 牙周组织再生的 磷比值进行分析。钙磷比值可以作为判定骨质量的标准】。 如 量通过一系列的组织学观察和测量来评价,这些观测在之前已有报道】。 表所示,可以增加再生骨的量,并且两种生长因子的联合应用可能会 促进牙周组织再生中骨的质和量。 本研究中,我们成功的用一种新的方法建立了炎性牙周组织缺损。在手术建 立三度根分叉模型后,我们在缺损处放入了浸有厌氧菌的棉球来诱导炎性反应。 两周后,伴有严重炎性反应和肿胀的炎性牙周组织缺损成功建立。这种炎性牙周 组织缺损在两周就可以建立,比其他用印模材料的方法到周短,】。 另外这种方法是应用了混合细菌而不是单株细菌如牙龈卟啉单胞菌,这更能 模拟自然的牙周炎症。 能通过诱导成骨前体细胞向成骨细胞分化而促进骨生成。我们的实 验结果证明单独应用就可以促进再生骨的量。的这种促进成骨 能力和之前的研究结果类似】。这些结果进一步证实了的促成骨 能力。 但是之前有关于有时候会出现异位骨化的问题,这会阻碍牙周新附着的 形成,。有趣的是在本研究中并没有发现这种现象,也也和之前有些另外相 对时间较长的观察结果一致,。这可能说明异位骨化在牙周愈合的晚期可 以重新被吸收。另外,我们的数据表明虽然单独应用组的平均值 比两个对照组的高,但这种差别并不明显。通过单独应用我们并不能得 到期望中的牙骨质再生,而在之前的研究报道中可以显著促进牙骨质再 生,】。这可能是由于本研究应用的动物数目较少,或者如其它研究中报道的 那样促进牙骨质再生的能力有限,】。为了清楚何种原因,更多数目 的动物需要纳入到后面的研究中。山东大学博士学位论文 在单独应用组可以观察到更多的新骨生成伴随更高的钙磷比值。另外, 扫描电镜观察显示在这一组中新生的组织中胶原束的直径比对照组中的高。这些 结果表明局部单独应用可以改善再生骨的质并可以微弱的促进 再生骨 的量。但是对.影响骨生成和改建的原理我们并不清楚。为了更好的理 解我们结果,下面进行几种可能机理的讨论:首先是.对成骨的间接作 用。神经生长因子可以刺激降钙素基因相关肽的释放】,而这种肽已经被证明 可以调节成骨细胞和破骨细胞的功~匕.。降钙素基因相关肽可以抑制成骨细 胞肿瘤坏死因子但是刺激白介素和胰岛素样生长因子.的生成,】,并且 还能破骨细胞来源的骨吸收。另外,神经生长因子是一个促进血管化的因子 【,,而血管化和骨的形成和改建密切相关,,因为血管可以运输循环 中的成骨细胞系细胞到骨改建的区域】。第二种可能的机制是直接作用。神经 生长因子及其受体在骨形成细胞表达并且可以通过自分泌和旁分泌的形式来调 节骨形成.。之前的研究表明神经生长因子能够促进牙周韧带细胞系的增值 并能够作为抗凋亡因子促进成骨细胞的成活,】。未来需要更多的 实验来阐 明神经生长因子促进骨生成的具体机制。 骨形成蛋白和神经生长因子联合应用的两组比两个对照组可以观察到更 高的钙磷比值,并且伴有胶原纤维表明的更多的钙化物。另外,两种生长因子的 联合应用比任何一种因子的单独应用促进更多面积的骨生成和更多的牙骨质,这 表明两种生长因子对牙周组织再生存在协同作用。我们的数据表明两种生长因子 的联合应用在改善新生骨的质和量方面和剂量有关。这种改善和其它关于大于等 于两种生长因子联合应用的报道相似【,。这些发现表明不同生长因子的联 合应用倾向于比单独因子的应用促进更多的骨修复。然而骨形成蛋白和神经生长 因子之间的作用仍然不明了,未来需要更多关于二者相互作用的研究。 三度根分叉缺损。因此引导性组织再生和生长因子的联合应用可能会达 到更多的牙周组织再生。山东大学博士学位论文 本研究的缺陷包括动物数目较少,观察时间较短,和在电镜标本 的收集只是 一侧标本并且具有破坏性。通过不具破坏性的方法如微型电脑断 层扫描可匕是更 好的评价骨再生质量的方法。为了评价这种治疗的安全和有效, 将有必要在灵长 类动物进行实验,也需要纳入更多动物数目更长的观察时间。 总之,我们的结果表明局部应用和可能会促进比格犬的 三度炎性根分叉缺损再生骨的质和量。 参考文献 . . 【 , ?. .;:. , , , , , 】 : ;:. . .. . , , , , . ?. ;: . ., , , 一 . : . .;: , , , . 】 ,