发酵技术原理

发酵技术原理 第一章 发酵概述 第一节:发酵工程的概念 一、发酵的定义 传统概念:发酵(fermentation)最初来自拉丁语“发泡”(fervere)这个词，是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生co2的现象。巴斯德研究了酒精发酵的生理意义，认为发酵是酵母在无氧条件下的呼吸过程，是“生物获得能量的一种形式”。也就是说，发酵是在厌氧条件下，糖在酵母菌等生物细胞的作用下进行分解代谢，向菌体提供能量，从而得到产物酒精和co2的过程。然而，发酵对不同的对象具有不同意义。对生物化学家来说，关于发酵的定义是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物释放能量的过程。 现代概念:生物学家把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。 二、发酵工程的概念及特点 ,、发酵工程的概念 发酵工程是利用微生物特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。即发酵工程渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。由于发酵工程主要利用的是微生物发酵过程来生产产品，故也可称为微生物工程。 发酵工程包括从投入原料到获得最终产品的整个过程，基本本上可分为发酵和提取两大部分，发酵部分是微生物反应过程，提取部分也称为后处理或下游加工过程。发酵工程是研究和解决整个过程的工艺和设备问题，将实验室和中试成果迅速扩大到工业化生产中。 发酵工程组成:由上游工程、发酵工程和下游工程三部分组成 上游工程与发酵工程 发酵工程与下游工程 2、微生物工业发酵的基本过程 原料 菌体 预处理 活化 (粗选、除杂、粉碎、分析或水解、加工(斜面) 等) 发酵培养基的配制 扩大培养 (添加水、无机盐、其他营养物、调,与,比、(摇瓶或茄子瓶) pH等) 灭菌 接种 大型发酵 进一步扩大培养 (测量和控制发酵温度、pH、溶解氧等) 代谢产物和细胞的分离 (过滤、离心、沉淀等) 细胞的加工 代谢产物的分离 副产品或废品处理 (萃取、蒸馏等) 产品 代谢产物的纯化或加工 产品 (离子交换、层析、结晶、蒸馏 ,、发酵工程技术的特点 等) (1)发酵工程主体微生物的特点 种类多、繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株; 产生酶的种类多，能催化各种生物化学反应; 能够利用无机物、有机物等各种营养源; 可以用简易的设备来生产多种多样的产品; 不受气候、季节等自然条件的限制等优点。 (2)发酵工程技术的特点 与传统酿造技术相比，源于酒类、酱类、醋类等酿造技术的发酵工程技术发展非常迅速，并具有以下特点: 发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成; 反应通常在常温常压下进行，条件温和，消耗少，设备较简单; 原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再利用资源(植物秸秆等)，微生物本身能有选择地摄取所需的物质; 容易产生复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去处等反应; 发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌、空气需要过滤等。 (3)发酵工程反应过程的特点 与化学工程相比，发酵工程反应过程有以下特点: 生物化学反应，通常在温和的条件(如常温、常压、弱酸、弱碱等)下进行; 原料来源广泛，通常以糖、淀粉等碳水化合物为主; 反应以生命体的自动调节方式进行，若干个反应过程能够像单个反应一样，在单一反应器内很容易地进行; 发酵产品大多为小分子产品，但也能很容易地生产出复杂的高分子化合物，如酶、核苷酸的生产等; 由于生命体特有的反应机制，能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的氧化、还原、官能团导入等反应; 生产发酵产物的微生物菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质。除特殊情况外，发酵液一般对生物体无害; 要特别注意防止发酵生产操作中的杂菌污染，一旦发生杂菌污染，一般都会遭受损失; 通过微生物菌种的改良，能够利用原有设备较大幅度地提高生产水平。 三、发酵工程的产品类型 最初，微生物的应用仅限于食品与酿酒发酵。 随着近代微生物工程或发酵工程的发展，应用领域逐渐扩展到医药、轻工、化工、能源、环境保护及冶金等多个行业。 特别是基因工程和细胞工程等现代生物技术的发展和结合，人们通过细胞水平和分子水平改良或创建微生物新的菌体，使发酵工程的发酵水平大幅度提高，发酵产品的种类和范围不断增加，其中包括许多动、植物细胞产品。 发酵工程16种常见产品类型: 酿酒[发酵酒(葡萄酒、啤酒、果酒、黄酒和青酒等)和蒸馏酒(白酒、白兰地、威士忌酒、俄德克、金酒、老姆酒等)] 发酵食品[发酵主食品(面包、馒头、包子、发面饼等)、发酵副食品(火腿、发酵香肠、豆腐乳、泡菜、咸菜等)、发酵调味品(酱、酱油、食醋等)、发酵乳制品(奶酒、干酪、酸奶等)] 有机酸(柠檬酸等) 醇及有机溶剂(丁醇等) 酶制剂(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶等) 氨基酸 核酸类物质 抗生素 生理活性物质(ATP、维生素、激素等) 微生物菌体产品(活性干酵母等) 生物农药及生物增产剂 生物能(甲烷等) 环境净化 微生物冶炼 转基因产品 其他(多糖、高果糖浆、甜味胎等) 第二节:发酵工程的发展简史 一、传统发酵时期 大约在9000年前，就已经开始了原始的啤酒生产;公元前6000年左右，在黑海与里海的外高加索地区，就开始种植葡萄和酿制葡萄酒;公元前25世纪古巴尔干人就开始制作酸奶;公元前17世纪古西班牙人曾用类似目前细菌浸取铜矿的方法获取铜。 从文字记载可知，我国酿酒在公元前2200~2600年，已经有4000多年历史;从考古表明，我国酿酒在4000多年，甚至5000~6000年以前。 微生物与发酵的关系不清楚，只是依靠口传心授，一代一代的传授发酵的工艺，属于自然发酵时期。随着17世纪下半叶显微镜的发明，人们才逐渐认识到了微生物的存在。19世纪中叶，法国生物学家巴斯德发现酒精发酵是由活的酵母引起，其他的发酵过程也是各种微生物作用的结果，从而揭示了微生物与发酵之间的关系，这样人们对发酵的认识就发生了质的飞跃。 二、近代发酵工程时期 (一)近代发酵工程建立初期 从1590年开始的200年间，显微镜发明及其不断改进。 19世纪60年代，巴斯德揭示了发酵的秘密。 19世纪末以后，建立了纯培养技术，促进了近代发酵工业的建立。 (二)近代发酵工程全面发展时期 该时期为20世纪40年代初到20世纪70年代末。 1、青霉素的发现及其开发 2、人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术建立 3、发酵动力学、发酵的连续化自动化工程技术建立 4、微生物酶反应生物合成和化学合成反应相结合工程技术建立 三、现代发酵工程时期 现代发酵工程时期是指利用现代分子生物技术即DNA重组技术所获得的“工程菌”、细胞融合所得的“杂交”细胞以及动植物细胞或固定化活细胞等，使发酵工程的范畴突破了利用天然微生物的传统发酵，逐步建立起新型的发酵体系，生产天然微生物或人体及其他动植物所不能产生或产量很少的特殊产物。 最主要的产品就是基因工程药品。 所用的发酵设备是各种类型的新型生物反应器，甚至直接用转基因动植物作生物反应器。 发酵工程或微生物培养技术的发展，主要表现为: 从少量培养发展到大规模培养; 从浅层培养发展到厚层(固体)或深层(液体)培养; 从以固体培养技术为主发展到液体培养技术为主; 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养; 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养; 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团; 从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动植物细胞; 从单菌发酵发展到混菌发酵; 从利用野生菌体发酵发展到利用变异株以及“工程菌”的发酵等。 第三节:发酵工程的基本内容 一、发酵工程的一般特征 发酵工程是有微生物参与的反应过程，这种反应过程是指由生长繁殖的生物物质所引起的生物反应过程。这些过程既有利用原有微生物特性获得某种产物的过程，又有利用微生物消除某些物质(废水、废物的处理)的过程，但是它们都是活的微生物的反应过程。因此，其产物可以是代谢过程的中间或终点时的代谢产物，也可以是有机物质的降解物或微生物自身的细胞。 发酵工程与化学工程非常接近，化学工程中许多单元操作在发酵工程中得到应用，但发酵工程还有它的特殊性。例如，空气除菌系统、培养基灭菌系统等都是发酵工程工业中所特有的。故发酵工程就是化学工程中各有关单元操作结合了微生物特性的一门技术性学科。 1、发酵工程的一般特征 与化学工程相比，发酵工程中微生物反应具有以下特点: (1)作为生物化学反应，通常在常温常压下进行，无爆炸的危险，各种设备都不必考虑防爆问题，还有可能使一种设备具有多种用途。 (2)原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，加入少量的各种有机或无机氮源，只要无毒，一般无精制的必要，微生物本身就有选择地摄取所需物质。 (3)反应以生命体的自动调节方式进行，因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在称为发酵罐的单一设备内很容易地进行。 (4)能够容易地生产复杂的高分子化合物，是发酵工程最有特色的领域。 (5)由于生命体特有的反应机制，能高度选择地进行复杂化合物在特定部位的氧化、还原、官能团导入等反应。 (6)生产发酵产物的生物物质菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质，因此，发酵液等一般对生物体无害。 (7)发酵生产在操作上最需要注意的是防止杂菌污染。进行设备的冲洗、灭菌、空气过滤等，使全过程在无菌状态下运转，是非常重要的。一旦失败，就要遭受重大损失。特别是噬菌体对发酵的危害更大。 (8)通过微生物的菌种改良，能够利用原有生产设备使生产飞跃上升。 2、存在的问题 (1)底物不可能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，造成提取和精制困难，这是目前发酵行业下游操作落后的原因之一; (2)微生物的反应是活细胞的反应，产物的获得受外环境和细胞内因素的影响，并且菌体易发生变异，实际控制相当困难; (3)原料是价廉的农副产品，但质量和价格波动较大; (4)生产前准备工作量大，花费高，与化学反应相比，反应器效率低; (5)与化工相比，过高的底物或产物浓度常导致酶的抑制或细胞不能耐受过高的渗透压而失活; (6)发酵废液常具有较高的COD(Chemical Oxygen Demand)和BOD(Biochemical Oxygen Demand)。COD为化学需氧量——在一定的条件下，采用一定的强氧化剂处理水时，所消耗的氧化剂量，它是表示水中还原性物质多少的一个指标;BOD——有机污染物经过微生物分解所消耗溶解氧的量。在发酵过程中常常需要对这两个重要的条件进行调节控制。 二、发酵工程菌种的特点 工业化生产对发酵工程的菌种有下列要求(即菌种具备特点): (1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，产量高; (2)可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需的酶活力高; (3)生长速度和反应速度较快，发酵周期短; (4)根据代谢控制的要求，选择单产量高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株; (5)选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体; (6)菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性; (7)菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。 三、发酵工程中常见发酵罐的类型 发酵罐是指为特定一种或多种微生物所进行的生长代谢过程提供良好环境的容器。它是整个发酵工业的心脏，可能是一个密闭容器，也可能是一个开口容器等。 (一)工业发酵常用设备发展史 发酵罐伴随微生物发酵工业的发展已经历了近300年的历史。英国学者Stanbury(1984)把工业发酵的发展过程分为5个阶段，而发酵罐的发展同样经历了这些阶段。 ?1900年以前，为木制容器，带有简单的温度和热交换仪器; ?1900~1940年，小体积(20 m2)钢制发酵罐，空气分布器和机械搅拌开始在发酵罐中使用; ?1940~1960年，较大容体(54 m2)，机械搅拌，计算机控制;发酵产品分离和纯化设备逐步实现商品化。 ?1960~1979年，大容体(80~150 m2)，机械搅拌通风，具有压力循环和压力喷射，计算机广泛利用; ?1979年以后，大规模细胞培养发酵罐出现，发酵罐更加趋向大型化和自动化方向发展。 (二)发酵罐的类型和特点 (1)按微生物生长代谢需要分为好氧和厌氧发酵罐。抗生素、酶制剂、酵母、维生素等产品在好氧发酵罐中进行，通过强烈搅拌通风提供氧气;酒精、啤酒、乳酸等在厌氧发酵罐中进行。 (2)按照发酵罐设备特点分为机械搅拌通风和非机械搅拌通风发酵罐。机械搅拌通风发酵罐包括循环式、非循环式的通风发酵罐和自吸式发酵罐;非机械搅拌通风发酵罐包括循环式的气升式、塔式发酵罐，以及非循环式的排管式和喷射式发酵罐。 (3)按照容积大小分为实验室(1~50 L)、中试(50~5000 L)和生产规模(5000 L以上)发酵罐。 (4)按照微生物生长环境分为悬浮生长系统和支持生长系统发酵罐。在悬浮系统中微生物是浸没在培养液中，并伴随培养液一起流动。一般来说，大多数发酵罐都含有这两种系统。在支持生长系统中，微生物细胞生长在与培养液接触的界面上，形成一层薄膜。然而，实际上悬浮生长系统的容器内壁上和上部的罐壁上也会生长一层菌体膜;在支持生长系统中也有菌体分散在培养液之中。 (5)按照操作方式分为分批和连续发酵。要特别注意的是，不是所有的发酵罐都可以同时适用于这两种发酵系 统。分批发酵时，发酵工艺条件随着营养液的消耗和产物的形成而变化。每批发酵过程结束后，要放罐、清洗和重新灭菌，再开始新一轮的发酵。分批发酵系统是非稳定态的过程。连续发酵时，新鲜营养液连续流加入发酵罐内，同时，产物连续地流出发酵罐。分批发酵的主要优点是污染杂菌的比例小，操作灵活性强，可用来进行几种不同产品的生产;其缺点是发酵罐的非生产停留时间所占比重大，非稳定态工艺过程的设计和操作困难。连续发酵的主要优点是可连续运行几个月的时间，非生产时间短;缺点是容易污染。 (6)其他类型。一种新型的超过滤发酵罐已开始在工业发酵中得到应用，在运行时，成熟的发酵液通过一个超滤膜使产物能渗过膜进行提取，酶可以通过管道返回发酵罐继续发酵，新鲜的底物可源源不断地加入罐内。 2、发酵罐的基本特征 发酵罐是现代发酵工程中重要的设备，是微生物进行发酵的重要场所。发酵罐应具有: 适宜的径高比(罐身较长，氧的利用率较高); 能承受一定的压力; 搅拌通风装置能使气液充分混合; 没有死角、保证灭菌彻底、防止染菌; 有足够冷却面积; 搅拌器轴封严密、减少泄漏。 3、发酵罐设计原理 发酵罐的主要功能是为菌体生长，或为某一特定的微生物混合发酵剂提供一个便于控制的环境，从而获得人们所期的产物。设计和制造的发酵罐应具备: (1)在无菌条件下长时间工作数天保持稳定; (2)通风和充分搅拌，满足微生物代谢需要，不损伤菌体; (3)低功率消耗; (4)具备温度和pH检测系统及采样装备系统; (5)罐内蒸发损失不应太大; (6)在放料、清洗和维修等操作过程劳动力消耗低; (7)用途广，适应不同生产厂家需要; (8)内表面光滑; (9)中试与生产规模的几何形状相同; (10)制造原料便宜，配备其他设备。 发酵罐结构图示 温度传感器、耐高温pH和溶氧传感器 (三)常见的工业发酵罐类型 1、机械搅拌通气发酵罐 1)机械搅拌通气发酵罐 原理和部件:机械搅拌通气发酵罐，又叫通用式发酵罐，它是利用机械搅拌的作用使通入的无菌空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，满足微生物生长繁殖和发酵所需要的氧气，同时强化热量的传递。主要部件包括罐体、搅拌器、挡板、轴封、空气分布器、传动装置、冷却装置、消泡器、视镜等。 用途:多用于抗生素、维生素、氨基酸、酶类的生产。 存在不足:泡沫占据罐内有效容积，需要增加消泡剂用量;搅拌消耗动力大，带来搅拌结构功能、轴封的严密程度等一系列问题;内部结构复杂，洗净难度大，增加了杂菌污染的机会;搅拌的剪切作用容易损伤放线菌、霉菌的菌体，有可能降低产率。 2)自吸式发酵罐 自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机提供无菌空气，而是通过高速旋转的转子产生的真空或液体吸气装置吸入空气的发酵罐。主要结构是吸气搅拌叶轮及导轮。 优点:设备结构简单;可省去空气净化系统的空气压缩机及其附属设备，节省了设备投资，减少厂房占地面积;氧利用率高，能源消耗低。 不足:依靠负压吸入空气，罐内空气处于负压状态，增加了染菌的机会;搅拌转速高，菌丝切断可能性大，菌体细胞可能不能正常生长。 用途:多在食醋、酵母培养生产中使用。 常用类型有:文氏管发酵罐(喷射式自吸式发酵罐)、弗盖布氏发酵罐(回转翼片自吸式发酵罐)。 2、气升式环流发酵罐 借助气体上升的动力来搅拌的发酵罐。这种流体的上升是通过一种特殊装置导流筒内外流体重度的差异，再加上气流喷出时的动能，使流体自导流筒上升，形成向周围环境下降的循环流动。 优点:气体从罐体的下部通入，可带动流体在整个发酵罐内循环流动，使反应器内的溶液容易混合均匀;没有机械搅拌桨，省去了密封装置，减少了杂菌污染机会，降低了机械剪切作用对细胞的伤害;由于液体循环速度较快，反应器内的供氧及传热较好，节约能源。 不足:不适合在黏度大或含有大量固体的培养液中应用。 用途:酵母、细胞培养及酶制剂、有机酸等发酵生产;废水生化处理。 3、塔式发酵罐 一种类似塔式发酵器的发酵罐。它的H/D值约为7左右。罐内装有若干块筛板，压缩空气由罐底导入，经过筛板逐渐上升，气泡在上升的过程中带动发酵液同时上升，上升后的发酵液又通过筛板上带有液封作用的降液管下降而形成循环。省去了机械搅拌装置。生产抗生素、单细胞蛋白等。 塔式非均匀混合连续发酵 四、发酵过程的优化 1、定义:发酵过程的优化是指最佳控制发酵过程的或发酵过程中主要控制的项目和方法。 2、目的:使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器之间复杂的相互关系简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使特定发酵过程以最适进行。 3、研究内容，包括四个方面的研究内容: 微生物细胞生长过程:微生物从培养基中摄取营养物质情况和营养物质在代谢中转化去向;在不同条件下微生物代谢分布。 微生物反应的化学计量:微生物利用底物进行生长，同时合成代谢产物。运用基于化学计算关系的代谢通量分析方法，可提出微生物代谢途径的可能改善方法，为过程优化奠定良好的基础。 生物反应动力学:生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容，主要研究生物反应速度及其影响因素，在此基础上建立动力学模型，进而确定发酵过程的最佳生产条件。 生物反应器工程:包括生物反应过程的参数检测与控制。生物反应器的形式、结构、操作方式、物料的流动与混合状态、传递过程特征等是影响生物反应器宏观动力学的主要因素。在工程设计中，化学计量式、微生物反应和传递现象都是需要解决的问题。参数检测与控制是发酵过程优化最基本的手段，只有及时检测各种反应组分浓度的变化，才有可能对发酵过程进行优化，使微生物发酵工程在最佳状态进行。 五、发酵工业的逐步放大 1、定义:由实验室小型设备到试验工厂小规模的试验发酵，再转为大规模设备的工业发酵生产，这个过程称为发酵的逐级放大。 2、阶段 小试:采用实验室的小型设备。对培养基的成分和比例、pH、培养温度、通气量的大小等发酵条件进行大量试验。初步评价出所发酵的产物是否具有效益和生产的可能性。 中试:采用试验工厂或发酵车间的小规模设备。对小试发酵条件进行放大试验，初步核算成本，进行功能性、安全性、质量分析鉴定等，获得有法律效力的新产品等文件。确定发酵产物是否能进行大试。 大试(试验性生产或工程性试验研究):用工业性大规模设备进行试验性生产。对中试发酵条件进行验证、改进，生产出质量合格具有经济价值的商业性产品，核算成本，制定生产规程，获得有法律效力的生产许可证等有关证书。确定发酵产物是否能进行工业化大规模生产。 第四节:发酵工程常见的主要发酵类型 工业发酵方式，可根据微生物需氧或不需氧(好和厌氧发酵)、培养基形态(液和固态发酵)、发酵位置(表面和深层发酵)、间歇或连续(分批和连续发酵)、菌体是否固定(游离和固定发酵)、菌种种数(单一纯种和混合发酵)。 一、液体与固体发酵 (一)液体发酵 液体发酵(液体培养)是指将微生物接种到液体培养基中进行的培养的过程。对好氧菌来讲，生长的限制因子几乎总是与氧有关。 提高氧量的方法:浅层液体发酵、摇床三角瓶震荡培养、深层培养、机械搅拌、提高罐压等。 实验室常用试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养、台式发酵罐等发酵方式;工业生产上常用浅盘培养和发酵罐深层培养等方式。 (二)固体发酵 固体发酵(固体培养、固态发酵或表面培养)是指利用固体培养基进行微生物的繁殖。其用于微生物鉴定、计数、纯化和保藏等。 一般属于开放的形式，无菌要求不高;设备简单，生产成本低;但pH、温度等不易控制，占地面积大，容易污染，生产规模难扩大。 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养;在生产中常用较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等设备进行固体培养。 二、厌氧与好氧发酵 厌氧发酵(静止培养)是利用厌氧微生物进行的发酵，设备一般比较简单;用于丙酮、丁醇、乳酸、乙醇的生产。 好氧发酵是利用需氧微生物进行的发酵，通过通气、通气搅拌或表层培养等方法，在发酵过程中不断地供给氧气(空气)。 三、分批与连续发酵 (一)分批发酵 1、分批发酵 (1)定义: 分批发酵(分批培养)是指将所有的物料(除空气、消沫剂、调节pH的酸碱物外)一次加入发酵罐，然后灭菌、接种、培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收;清罐结束后，重新开始新的装料发酵的发酵方式。 (2)特点: 细胞和培养液一次性装入反应器，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间后，将整个反应物取出。操作简单，易于掌握。发酵系统属于封闭系统，发酵过程是一种非稳定的培养过程，不能使细胞自始至终处于最优条件，生长周期表现出典型的过程，即通过迟滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 2、补料分批发酵 (1)定义: 在中期代谢活动期，向发酵罐间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式，维持较高的发酵产物的增长幅度，又叫半连续培养或半连续发酵。 (2)特点: 补料分批发酵介于分批和连续发酵之间的微生物细胞的培养方式，兼有两者优点。 补料分批培养的优点 与分批培养方式比较 与连续培养方式比较 解除底物抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。 不需要严格的无菌条件。 对耗氧过程，避免一次性投糖过多造成细胞大量生长、不会产生微生物菌种老化和变异。 耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况。 最终产物浓度较高，有利于产物的分细胞可被控制在一系列过渡态阶段，可来控制细胞的质离。 量;并可重复某个时期细胞培养的过渡态，可用于理论使用范围广。 研究。 (3)补料分批类型 补料方式:连续、不连续和多周期补料。 每次补料:快速、恒速、指数速度、变速补料。 发酵体积:变体积和恒体积补料。 反应器数量:单级和多级补料。 补加培养基成分:单一和多组分补料。 重复补料分批发酵:在培养过程中，每间隔一定的时间，取出一定体积的培养液，又在同一时间间隔内加入等体积的培养基，如此反复进行的培养方式。代谢参数发生周期性的变化。 (二)连续发酵 1、定义:连续发酵(连续培养):以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵培养方式。 2、特点:与封闭系统中的分批发酵培养方式相反。在连续发酵过程中，微生物细胞所处的环境条件可以自始至终基本保持不变，使微生物细胞的生长速率、产物代谢均处于恒定状态。优点:发酵周期短，设备利用率高，人力和物力消耗少，生产效率高。不足:长时间运转，菌种多退化，容易污染;多用高浓度的营养组分，培养基利用率低于分批发酵;工艺中的变量较分批复杂，较难控制和扩大;在有抗生素次生产物中，次生产物代谢产物所需最佳条件与生产菌种的不一致，难以利用连续发酵。 3、类型:菌体再循环或不循环的单罐连续发酵、菌体再循环或不循环的多罐连续发酵。 4、应用:已被广泛用于大规模生产酒精、丙醇、丁醇、乳酸、食用、酵母、饲用酵母、单细胞蛋白、浮游生物的生物量和石油脱蜡及污水处理等发酵工程。 四、单一纯种与混合发酵 (一)单一纯种发酵 某种纯的微生物接种到灭菌的培养基上进行培养或发酵。把各种微生物彼此分开并培养成纯种微生物的技术，在微生物学上叫分离和纯种培养技术，也叫单一纯种发酵。 (二)混合发酵 1、混合发酵(混合培养物发酵或混合培养)定义:多种微生物混合在一起共用一种培养基进行发酵。 2、特点:(1)三少一多:生产人员少，原材料和能源消耗少，设备和器材少，生产效益高或产品种类多; (2)混合发酵能够获得一些独特的产品，而纯种发酵是很难做到的(茅台酒); (3)混合的多种菌种，增加了发酵中许多基因的功能，通过不同代谢能力的组合，完成单一菌种难以完成的复杂的代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌来进行复杂的多种代谢反应，或促进生长代谢，提高生产效率。 五、固定化发酵技术 固定化酶是将水溶性酶制剂，通过物理或化学方法使之不溶于水，而仍然保持酶催化能力的制剂。它的作用特点是用固相的酶作用于液相的底物。 固定化酶仍具有酶的高度专一性、高催化效率和温和条件作用的特点等;而且使用寿命延长;通过过滤或离心回收后反复利用;做成的酶柱使生产管道化、连续化和自动化;去杂容易无污染;产品提纯简单、收率高、酶损耗少。 固定化完整细胞甚至固定化活细胞，潜力更大。不需要提取和纯化酶;回收率更高、稳定性更好、成本更低。 第五节:发酵工程的后处理 发酵工程的后处理(发酵工程的下游技术或下游工程)是指大规模发酵后直到产品形成的整个工艺过程，即发酵产物的分离、提取和精制。其决定发酵产品的质量和安全性，关系到产品的收率和成本。一般来讲，占60%左右成本。 一、发酵工程后处理技术的特点 目标成分在原料中含量较低 发酵液属于复杂的多相体系 目标成分的稳定性较差 产品的纯度要求高 二、发酵液的特点 (1)发酵液大多部分为水，产物浓度较低; (2)菌体和蛋白质形成的悬浮固形物使发酵液黏度增加，不利于过滤，增加了提取和精制后工序的操作难度; (3)残留成分中的无机盐、非蛋白质大分子杂质及降解产物，影响提取和精制; (4)代谢副产品，特别是与产物相似的物质，给分离提纯操作带来困难; (5)色素、热原质、毒性物质等有机杂质，需要除去，对提取影响相当大。 三、下游工程产品特点 (1)常为活的有机体或具有生理活性的有机化合物，易变性失活; (2)一般分子量较大; (3)浓度低，但成品纯度要求高; (4)制剂含丰富营养成分，易被微生物污染和分解; (5)成分复杂，需要用常规和分子检测方法进行分析; (6)许多功能因子参与人体精细调节，发生任何性质或数量上的偏差，可能造成严重的危害，此类产品质量要求很高。 四、发酵产品提取精制的基本流程 不同的产物具有不同的分离提取路线。 分离路线取决于目标成分性质和细胞位置。 整个分离提取路线一般可分为预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化、成品加工等5个主要步骤。 每个步骤又通过若干个单元操作来完成。 一般说来，发酵工程下游过程可分4个阶段。 五、发酵产物提取的基本方法 (一)发酵液的预处理、固液分离和细胞破碎 预处理:在活性物质稳定性的范围内，通过酸化、加热，降低黏度;或加入絮凝剂，是细胞或溶解大分子聚结成大颗粒。这些方法得目的是改变发酵液的性质，便于固液分离。 固液分离:通过过滤、离心等方法进行分离。 细胞破碎:通过机械、生物和化学法进行细胞破碎。 (二)初步纯化(提取-浓缩) 1、吸附法:主要用于抗生素等小分子物质的提取，有浓缩和纯化作用。利用吸附剂(活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂)与抗生素之间分子引力将抗生素吸附在吸附剂上。 2、离子交换法:主要用于小分子提取。利用离子交换树脂和生物物质之间的化学亲和力，有选择地将生物物质吸附上去，再以较少量的洗脱剂将其洗下来。 3、沉淀法:广泛用于蛋白质的提取，主要起到浓缩作用。加入高浓度盐(盐析)、有机溶剂、非离子型聚合物(PEG)、聚电解质(聚丙乙烯)或调节等电点(pH)等方法。 4、萃取法:利用产品在互不相溶的二相溶剂中有不同的溶解度来进行。溶剂萃取法、两水相萃取法、超临界液体萃取法、逆胶束萃取法。 5、膜过滤法: 分为超滤、微滤、纳滤和反渗透。 (三)高度纯化(精制) 1、色谱分离:大分子精制。操作在柱中进行，包含固定相和移动相，物质在固定相和移动相间分配情况不同，运动速度不同，获得分离。色谱方法有凝胶、离子交换 、聚焦 、疏水和亲和色谱等。 2、结晶:小分子精制。通过加入某种物质(调pH)或冷却或加热蒸发溶剂等方法，使物质结晶。 (四)成品加工和废液排放 发酵液经提取和精制后，根据实际情况需要进行浓缩、干燥、除菌等处理。达到产品使用的要求。 发酵废液量很大，BOD值较高，经过生物处理后才能排放;通过无菌过滤器后，气体和空气才可排放到系统外的大气中。 本章复习思考题 发酵的传统概念与现代意义上的概念是指什么, 发酵工程的概念是什么, 试述微生物工业发酵的基本过程, 与传统酿造、化学工程相比，发酵工程有哪些特点, 分析发酵工程的一般特点，同时存在哪些不足, 发酵工业中使用的发酵罐有哪些特点, 发酵过程的优化概念、目的、内容分别是什么, 工业发酵常见的发酵方式有哪些，特点、优点和缺点是什么, 什么是发酵工程的后处理,发酵工程后处理技术有什么要求,发酵液的特点是什么, 下游工程中的目的产物有什么特点, 第二章 发酵机制与发酵动力学 概况 发酵机制是指微生物通过其代谢活动，利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。 发酵机制研究的内容:研究微生物的生理代谢规律，就是细胞合成各种代谢产物的途径和代谢调节机制，环境因素对代谢方向的影响以及改变微生物代谢方向的措施。 代谢控制发酵:许多产物是生理正常的微生物不能过量积累的，必须是具有特异的生理特性的微生物才能积累，人为的改变微生物的代谢调控机制，使有用中间代谢产物过量积累，这种发酵称为代谢控制发酵。 发酵动力学:研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 发酵动力学研究的内容:微生物生长过程中的质量和能量平衡，发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速度和产物生成速度的相互关系。为发酵工艺条件控制提供依据，使生产最优化。 第一节 发酵工程微生物的基本代谢及产物 一、微生物初级代谢及产物 初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和 能量的过程。 这一过程的产物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸以及由这些化合物聚合而成的高分子化合物(如多糖、蛋白质、脂类和核酸等)，即为初级代谢产物。 二、微生物次级代谢及产物 微生物次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。 此过程的产物称为次级代谢产物，大多为分子结构复杂的化合物，包括抗生素、毒素、激素、色素等。 抗生素:由某些微生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，是能抑制其他微生物生长或将其致死的化合物。主要是通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或将其致死。 毒素:有些微生物在代谢过程中，能产生某些对人和动物有毒害的物质。 激素:某些微生物能产生刺激动物生长或性器官发育的物质。 解偶联剂:DNP 氧化磷酸化抑制剂:寡霉素 离子载体抑制剂:结氨霉素 第二节 微生物代谢调控机制 微生物具有稳定的个体遗传组成，但能够改变 细胞组成和代谢作用，来适应环境的变化。微 生物体内成千上万种酶和其他物质组成了一 套完整的代谢调节机构。形成的多酶体系，反 应链的总速度决定于限速酶的步骤，往往第一 步是限速步骤。 通过酶的诱导生成、酶生成的阻遏或活性的抑 制，是代谢按照自身的需要进行或改变。细胞 膜的渗透屏障使细胞保留某些代谢物和各种 细胞组成物质，并选择性地吸收必要的营养 物。人为控制代谢物的合成和分泌，就可以使 发酵工业得到增产。 一、微生物初级代谢的调节 (一)酶活性的调节 已存在酶活性的改变，速度快。依靠酶分子结构的改变而实现，主要方式有反馈抑制和酶的共价修饰两种。包括酶活性的激活和抑制两个方面。 1、酶活性的激活 常见于分解代谢，即后面的反应被该途径较前面的一个产物所促进，属于前提激活。 2、酶活性的抑制 常见于合成代谢，即合成途径的终产物过量时对前段的某一个酶活性的抑制现象，通常抑制反应途径的第一个酶。具有直接、快速、终产物含量降低后重新解除等特点，属于变构抑制。 有直线反馈抑制和分支反馈抑制两种，后者又包括同工酶调节、协同反馈抑制、累积反馈抑制、顺序反馈抑制。 直线代谢途径中的反馈抑制 分支代谢途径中的反馈抑制 顺序反馈抑制:当E过多时，可抑制C?D，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了C?F，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A?B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制。 (二)酶合成的调节 数量和种类的调节，属于缓慢调节。包括酶生成的诱导和代谢产物对酶生成的阻遏。 1、诱导:凡能促进酶生物合成的现象就称为诱导。根据酶的生成与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，酶可以划分为组成酶和诱导酶两类。组成酶是细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行的，它不因分解底物或其结构类似物的存在而受影响。诱导酶是指细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 2、阻遏:凡能阻碍酶生物合成的现象就称为阻遏。包括末端产物反馈阻遏和分解代谢物阻遏两种类型。末端产物反馈阻遏是指由某代谢途径末端产物的过量积累而引起的反馈阻遏;分解代谢物阻遏是指细胞内同时存在两种碳源(或氮源两种)时，利用快的那种碳源(氮源)会阻遏利用慢的那种碳源(氮源)的有关酶合成的现象。 两种调节的对比 酶合成的调节酶活性的调节 通过酶量的变化控制酶活性，不涉调节对象控制代谢速率及酶量变化 不 同调节效果相对缓慢快速、精细点 基因水平调节，代谢调节，它调节调节机制调节控制酶合成酶活性 相同细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准 点确控制代谢的正常进行。 (三)能量负荷调节 对利用ATP的合成代谢途径的酶活性或形成ATP的分解代谢途径的酶活性的调节，于是ATP含量的变化将 引起与这些合成酶、分解酶相关的代谢反应的变化，由此调节某些产物的生物合成。 二、微生物次级代谢的调节 (一)初级代谢对次级代谢的调节 次级代谢与次级代谢类似。受到酶活性的激活和抑制及酶合成的诱导和阻遏。 (二)分解代谢产物的调节控制 菌体生长阶段，快速利用碳源的分解物阻遏了次级代谢酶系的合成;当碳源被消耗完后，解除了阻遏作用，次级代谢产物才能合成。 (三)诱导作用及终产物的反馈抑制 次级代谢终产物的过量积累也能像初级代谢那样，反馈抑制其酶的活性。此外，培养基中的磷酸盐、溶解氧、金属离子及细胞膜透性也会对次级代谢产物存在一定程度影响。 三、微生物发酵中的代谢调控 概念:人为地打破微生物细胞内的自动代谢调节机制，使代谢朝人们所希望的方向进行，这就称为代谢调控。 微生物发酵控制常用的方法有控制发酵条件、改变细胞膜透性和改变微生物遗传特性等。 (一)改变细胞膜的通透性 细胞膜的通透性具有选择性，细胞内的代谢产物不能随意通过细胞膜而分泌到细胞外;细胞内过量的代谢产物就会通过反馈抑制作用而控制代谢产物的进一步合成;改变细胞膜透性，使产物不断地分泌到细胞外，就能解除终产物的反馈抑制作用，增加发酵产量。 (二)改变微生物的遗传特性 1、利用营养缺陷菌株:氨基酸发酵生产中，利用了许多营养缺陷型菌株。 应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节:在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。但在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。 2、选育抗反馈调节的突变株:选育抗反馈调节的突变株，解除微生物的代谢控制，使发酵产物，这种突变株叫抗代谢类似物变异株。 第三节 糖代谢产物的发酵机制 一、厌氧发酵代谢产物发酵机制 葡萄糖在微生物细胞中进行厌氧发酵时，通过EMP(糖酵解)、HMP(磷酸己糖途径)等途径形成多种中间代谢物;在不同微生物细胞和环境下，进一步形成各种不同的发酵产物。依据产物不同，发酵分为乙醇、乳酸(同型和异型)、丙酮-丁醇、混合发酵等。 二、好氧发酵代谢产物发酵机制 微生物好氧发酵糖类物质可生成许多有机酸，其中柠檬酸是最常见的一种。 第四节 氨基酸和核酸发酵机制 一、氨基酸发酵机制 微生物生长所需要的氨基酸可以直接从培养基 中吸收; 或通过氨基转移酶催化的转氨基作用合成其他 的氨基酸; 或微生物经氨化作用或经固氮作用生成的氨可 以通过特定的反应来吸收，生成新的氨基酸; 还可以从糖分解代谢过程中产生的中间体碳架 物质通过一系列生物化学合成机体所需要的各 种氨基酸(主要有谷氨酸的发酵途径、天冬氨酸 族氨基酸生物合成途径、酵母和霉菌的赖氨酸生 物合成途径、分支链氨基酸发酵机制、鸟氨酸、 瓜氨酸和精氨酸的发酵机制)。 二、核苷酸发酵机制 涉及嘧啶核苷酸的生物合成和嘌呤核苷酸的生物合成。 核苷酸由碱基、戊糖和磷酸三部分组成，核苷酸在生物体内不是由三部分直接聚合而成，而是由糖代谢过程中的中间体，通过一系列反应步骤逐步合成的。 第五节 抗生素发酵机制 抗生素的生物合成都是以初级代谢产物为前体，进入次级代谢产物合成途径后，经过前体聚合、结构修饰、不同组成装配等三个步骤，合成不同类型的抗生素。 一、抗生素的发酵机制 (一)糖或糖代谢产物为前体的合成途径:由葡萄糖、预苯酸、磷酸戊糖等合成次级代谢产物。 (二)与脂肪酸代谢有关的合成途径:由脂肪酸或丙酮酸合成。 (三)与萜烯和甾体化合物有关的合成途径:主要由霉菌产生，如烟曲霉素、赤霉素、梭链孢酸及胡罗卜素等。 (四)与TCA环有关的合成途径:一类从TCA环得到的中间产物进一步合成次级产物，另一类由乙酸得到的有机酸与TCA环上的中间产物缩合生成次级产物。 (五)与氨基酸代谢有关的合成途径:由单一、两个或三个氨基酸形成的次级代谢产物。 二、几种抗生素的生物合成 (一)青霉素、头孢菌素的生物合成 三肽抗生素。 (二)链霉素生物合成 由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-氨基葡萄糖组成的三糖。 (三)四环素类抗生素生物合成 (四)红霉素生物合成 第六节 微生物发酵的动力学 ~生物反应 一种是使底物在酶(游离酶或固定化酶)的作用下进行反应，如淀粉的液化、异构糖的生产、无侧链青霉素(6-APA)的制造等。 另一种是通过细胞的培养，利用细胞中的酶系，把培养基中的物质通过复杂的生物反应转化成新的细胞及其代谢产物。(重点) 生物反应动力学的研究内容: 研究反应速度及其影响因素并建立 反应速度与影响因素的关联 ? 反应动力学模型? 反应器的操作模型? 操作条件与反应结果的关系，定量地控制反应过程 反应器特性 一、生物反应动力学描述 发酵过程反应的描述 X S(底物) ?? X(菌体) ， P(产物) 生物过程反应速度(率)的描述 菌体生长速率/菌体比生长速率 基质消耗速率/基质比消耗速率 产物形成速率/产物比形成速率 dX,,,,, ;时间，Xth(一)、菌体生长速率 xdt 菌体生长速率 /();,,菌体生长速率，gLh,x比生长速率 1dX,, 微生物浓度X, Xdt 比生长速率除受细胞自身遗传信息支配外，还受环境因素的影响。 微生物细胞比生长速率和倍增时间因受遗传特性和生长条件的控制，有很大的差异。 微生物的比生长速率与倍增时间的关系 1dX由可知，与倍增时间的关系为:,,, (doubling time) t dXdt ln20.693　　　　　　　　　,, ,ttdd (二)、基质消耗速率 以菌体得率系数为媒介，可确定基质的消耗速率与生长速率之间的关系。 ,X基质的消耗速率 Y/,,—菌体得率系数，gg,/SXSY/XS ,,S基质的比消耗速率, -,,XYX/S 1基质的消耗速率 mX,,，,,,当基质既是能源又是碳源时碳源总消耗速率 SXYG 用于生长的消耗速率，用于维持代谢的消耗速率 m/(,)—基质维持代谢系数，菌体molgh, /(),—碳源总消耗速率，,molLh,S:菌体得率 /()—菌体生长速率，gLh,,X定义:消耗单位基质量ΔS(每克或每摩尔)与生成的干菌 Y/—菌体生长得率系数，gmolG体ΔX(g)之间的比值定义为菌体得率(YX/S)[消耗1g基质生成细胞的克数] 。 两边同除则，,XY=-?X/?S(g/g或g/mol) X/S 1 ,,，m,,Y G 通常，菌体X以干重表示;基质S是培养液中某一限制性底物。 (三)、代谢产物的生成速率 ,发酵过程反应速度的描述 代谢产物的生成速率 P ,X P代谢产物的比生长速率 Q,S(底物) ?? X(菌体) ， P(产物) cX()菌体的生长比速: 的值，常表示为COQQ 2CO2 呼吸商(RQ):好氧微生物中CO相对于氧的消耗。2 ,Q,cCO()COCO222, RQ,,,cO(),Q2OO22 二、生物反应模式与发酵方法 (一)、生物反应模式 根据产物生成速率与细胞生成速率的关系分类 (1)类型?(偶联型模型) 产物的形成与细胞生长呈相关的过程。产物是细胞能量代谢的结果，此时产物通常是基质的分解代谢产物。例如乙醇、乳酸发酵。 其动力学方程可表示为: (2)类型?(非偶联型) 产物的形成与细胞生长不相关或无直接关系，其特点是细胞生长期基本无产物合成，细胞停止生长产物则大量合成。属于这类的产物是次级代谢产物。例如青霉素、链霉素等抗生素发酵。 其动力学方程可表示为: (3)类型?(混合型) 产物的形成与细胞生长部分相关或具有间接关系，例如柠檬酸、谷氨酸发酵等。 其动力学方程可表示为: 说明:代谢产物得率(收率) 定义:生成的代谢产物量ΔP对底物的消耗量ΔS(g)之比定义为代谢产物收率(YP/S)。 假如完全没有菌体生成，则理论代谢产物收率可达到最大值。 得率(系数)及其估算 得率系数消耗单位营养物所生产的细胞或产物数量。用生长得率系数(YX/S)表示营养物消耗量和细胞生成量的关系;用产物得率系数(YP/S)表示营养物消耗量与产物生成量的关系。得率系数的大小取决于生物学参数(细胞浓度、比生长速率)和化学参数(溶解氧量、碳氮比、磷量等)。在对数生长期内，生长得率系数为常数。 常用的生长得率系数有三种: (1)消耗每克营养物(YX/S)、每克分子氧(YS/O2)、每千卡能量所生成的细胞克数(Yx/kcal); (2)消耗每克碳(YX/C)、每克磷(YX/P)、每克氮(YX/N)、每个有效电子(YX/Ave-)生成的细胞克数; (3)消耗每克分子的ATP (YX/ATP)生成的细胞克数。 常用的产物得率系数主要有YP/S、YCO2/S、YATP/S、YCO2/O2分别表示消耗每克营养物(S)或每克分子氧(O2)生成的产物(P)或ATP和CO2的克数。 营养物转化成细胞的关系或生长速率与营养物消耗速率的关系如下: dX/dt=- YX/S(dS/dt)， X-X0= YX/S (S0-S) YX/S = (X-X0) /(S0-S)=?X/?S， YP/S = (P-P0) /(S0-S)=?P/?S (二)、发酵操作方法 1、分批发酵法 定义:每一个分批发酵过程都经历接种，生长繁殖，菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。 特点:微生物所处的环境是不断变化的，可进行少量多品种的发酵生产，发生杂菌污染能够很容易终止操作，当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策，对原料组成要求较粗放等。 2、补料分批发酵法 定义:所谓分批补料培养技术，是指在分批培养过程中，间歇或连续的添加新鲜培养基的方法。 特点:与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。 低基质浓度的优点为:?可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾。?避免培养基积累有毒代谢物。 补料分批培养适合于以下条件 ?生长非偶联型产物的生产 ?高密度培养 ?产物合成受代谢物阻遏控制 ?利用营养缺陷型菌株合成产物 ?补料分批培养还适用于底物对微生物具有抑制作用等情况。 ?此外，如果产物黏度过高或水分蒸发过大使传质受到影响时，可以补加水分降低发酵液黏度或浓度。 3、连续发酵法 所谓连续培养，就是在发酵过程中一边补入新鲜料液，一边以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。 连续培养器 连续发酵类型 三、微生物发酵动力学 生物反应动力学是研究生物反应过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 研究内容包括发酵过程菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互联系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速率的条件。 (一)、 微生物分批发酵动力学 1、分批发酵的不同阶段: (1) 迟滞期/停滞期/延迟期 停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。 接种物的生理状态和浓度影响停滞期的长短。 解决途径: 一是尽量选择处于指数生长期的种子。 二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。 (2)对数生长期 处于对数生长期的微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数目或质量的增加维持稳定，并达到最大值。 此时，如以细胞数目或生物质量的对数值对培养时图，将得一直线，该直线的斜率就等于μ。 微生物的最大比生长速率在工业上的意义 为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。 最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关。 限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度，而是营养物质进入细胞的速度。 (3)稳定期 在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。 处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本不变;但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。 由于细胞的自溶作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢生长。(二次或隐性生长) 微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。 (4)死亡期 在死亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞开始死亡。 在发酵工业生产中，在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。 2、微生物分批培养的生长动力学方程 微生物的生长速度: μ,f(s,p,T,pH,„„,) 在一定条件下(基质限制): μ,f(S) 1942年，Monod提出了在特定温度、pH值、营养物质类型、营养物浓度等条件下，微生物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在着一个关系式。 KS越大，表示微生物对营养物质的吸引亲和力越小，反之越大。对于许多微生物来说，KS值是很小的，一般为0.1~120mg/l或0.01~3.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。 微生物比生长速率与底物之间有一定的关系 线段a表示一样物质浓度很低时。 线段b为符合Monod方程段。 线段c表示营养物质浓度很高时。 Monod方程的参数求解(双倒数法): 将Monod方程取倒数可得:或 这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。 例:在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据: S(mg/l) 6 33 64 153 221 μ(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70 求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，Ks和td? S/μ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221 μmax，,1.11 (h-1); Ks,97.6 mg/L td,ln2/ μmax,0.64 h 3、分批培养时基质的消耗速率 得率系数: 生成的细胞或产物与消耗的营养物质之间的关系。 细胞得率系数YX/S、产物得率系数YP/S:分别定义为消耗1g营养物质生成的细胞的质量和生成产物的质量，单位均为克。 4、分批培养时产物的形成速率 产物形成与细胞生长的关系 5、分批发酵过程的生产率 生产率是个综合指标，在讨论分批培养时，必须考虑所有的因素。 在计算时间时，不仅包括发酵时间，还包括放罐、清洗、装料和消毒时间以及迟滞所消耗时间。 发酵总时间为: 式中:tc——放罐清洗时间; tf——装料消毒时间; t1——迟滞时间; X0和Xt分别为细胞最初和最终浓度 生产率 通过方程可以估算发酵过程中各种因素的变化对平均生产率的影响。接种量大，X0大，发酵时间短，减少 tc和tf，也能缩短发酵周期。对于短发酵周期(18~70h)而言，如谷氨酸发酵，tc和tf非常重要，而对长发酵 周期(3d以上)，如抗生素生产，tc和tf就不太重要了。迄今为止，分批培养是常用的培养方法，广泛用于各 种发酵过程。 (二)、补料分批发酵动力学 1、补料分批发酵的类型 2、补料分批培养的动力学 (1)、单一补料分批培养 特点:补料一直到培养液达到额定值为止，培养过程不取出培养液。 在某一瞬间培养液中微生物细胞浓度 (2)、重复补料分批培养 定义:是在培养过程中，每隔一段时间，取出一定体积的培养液，同时又在同一时间间隔内加入相等体积 的培养基，如此反复进行的培养方式。 连续补料和分批补料发酵的比较 (三)、连续发酵动力学 细胞的物料平衡 流入的细胞,流出的细胞，生长的细胞,死去的细胞,积累的细胞 即: 在一定范围内，人为调节培养基的流加速率，可以使细胞按所希望的比生长速率来生长。 四、微生物生长代谢过程中的质量平衡 碳源+氮源+氧=菌体+有机产物+CO2+H2O 思考题 1、比生长速率、基质比消耗速率、产物比生成速率, 2、生物发酵反应动力学的分类, 3、各种得率系数的含义, 4、呼吸商, 5、在分批培养中，微生物的生长过程分几个过程，有何特点, 6、试述微生物代谢调节机制。 第三章 发酵工业微生物的菌种 第一节 菌种的来源 一、工业发酵常见微生物种类 发酵工业上常用微生物有细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类等类群。 (一)、细菌 1、细菌的结构 2、细菌的繁殖 细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖 3、细菌的菌落 定义:单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群 体，叫做群落。 特征:大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。 功能:每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。 举例:如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。 (二)、放线菌 1、放线菌的形态 2、放线菌的结构 3、放线菌的分布 放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。 4、放线菌的繁殖 放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性孢子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。 二、工业微生物来源 收集和筛选途径: (1)向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。有些大型的发酵工厂也有菌种保藏室。 (2)从自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。有时为了获取适合的微生物，必须去特定的生态环境中分离。 (3)从一些发酵品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。 三、微生物菌种的选择性分离 菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。 (一)微生物样品的采集 自然界的土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，其中土壤样品的含菌量最多。微生物生理特性不同，其分布也有差异，根据需要选取不同地点取样。 采用取样铲采取土样，将表层5cm左右浮土除去，取5~25 cm处的土样10~25g，装入塑料袋内扎好，或将土样撒到试管斜面培养基上，并进行相关数据记载和标记。一般样品取回后马上分离，以免微生物死亡。 (二)微生物样品的富集培养 采用平板划线或平板稀释法从混杂的微生物样品中进行纯种分离。人为控制生长环境和营养条件，使其利于所需微生物生长，使其它种类微生物的生长不利，以达到目的菌种数量占优势而得以快速分离纯化，该方法叫施加选择性压力分离法。一般可从以下几个方面来进行富集。 1、控制培养基的营养成分:微生物种类分布与营养物类型有关。在分离某类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入某种响应的底物作唯一碳源或氮源，促进某种菌株生长繁殖，而其它不能分解该物质的受到生长抑制。当然，能在该培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。 2、控制培养条件:不同微生物菌种对pH、温度、通气量等条件要求不同，可以利用这些环境条件改变，来达到某种菌种的富集。 3、抑制不需要的菌类:除了控制营养和培养条件外，通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的效果。 (三)目的菌种的分离 采用不同培养基养分、pH、温度和加入的选择性抑制剂等方法，分离菌种。 (四)目的菌的筛选 经过分离培养，在平板上出现许多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面进行纯培养。进一步的筛选可采用涂布法和影印平板法进行。 四、重要工业微生物菌种的分离 筛选菌株的重要指标: 菌的营养特性:廉价的培养基或来源丰富的原料; 菌的生长温度:高于40?的菌种，大规模发酵的冷却成本; 菌对所采用的设备和生产过程的适应性; 菌的稳定性; 菌的产物得率和产物在培养液中的浓度; 容易从培养液中回收产物。 抗生素产生菌的筛选:抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等。 产生药理活性化合物菌株的筛选:一种化合物如果能在体外抑制某种代谢关键酶，它可能在体内也具有相同的药理作用。如将体外筛选的活性化合物，再用于动物实验，便可以筛选出新的药理活性化合物，便可以筛选出能形成新的药理活性物质的菌株。 生长因子产生菌的筛选:生长因子如氨基酸和核苷酸的生长不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检出产生菌。通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。 多糖产生菌的筛选:可从各种环境中分离出多糖产生菌，尤其在制糖工业污水中含有很多这类菌种。 第二节 发酵高产菌种选育 发酵工业菌种是发酵工业的核心，优良的菌种是提高发酵产物质量和产量的首要条件。自然筛选和菌种改良是两种获取优良的发酵菌种的途径。 一、自然选育 不经过人工处理，利用菌种的自然突变，选育出优良菌种的过程，叫自然选择。自然突变可能原因:一种是菌种衰退，生产性能下降;一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。自然突变的频率较低，出现优良性状的可能性较低，需要时间长。 二、诱变育种 利用物理或化学诱变剂处理均一分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究。利用广泛。 三、杂交育种 人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。该方法复杂，工作进度慢，没有诱变育种应用广泛。 四、原生质体融合 通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又叫细胞融合。 原生质体融合技术主要步骤:选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。 五、基因工程育种 (一)传统基因工程技术 基因工程技术又叫定位育种技术。利用人为的方法，将所需的某一供体生物的遗传物质DAN分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的育种技术。 (二)重组工程技术 重组工程技术是利用噬菌体重组酶介导的体内短同源序列重组的遗传工程技术，是完全不依赖宿主体内的Rec A重组体系，而利用一个独立噬菌体重组系统，仅使用长度40~60bp的同源序列就能高效催化在宿主体内发生同源重组。重组工程系统是将噬菌体的重组基因整合到大肠杆菌染色体上或质粒上的噬菌体重组系统，包括缺陷型λ噬菌体的Red和RAC噬菌体的Rec ET重组系统。 第三节 菌种退化和菌种保藏 一、菌种退化 定义:菌种退化是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状(发酵力、抗噬菌体能力)和形态特性(分生孢子减少、菌落颜色改变)逐渐减退或消失的现象。 可能原因:基因突变、连续传代、其他因素(温度、湿度、培养基成分、培养条件)。 菌种的复壮:狭义菌种复壮指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的;而广义的菌种复壮在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。 防止退化的措施:合理育种、合适培养基、良好培养条件、控制传代次数、利用不同类型细胞进行移种传代、进行有效菌种保藏方法。 二、微生物菌种保藏 意义:在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏， 对于一成功的工业发酵过程极为重要。 理想保存条件:经长期保藏后菌种存活健在;保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 微生物保藏基本原理:采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等，是微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境中。 常用方法:蒸馏水悬浮或斜面传代保藏、干燥载体保藏或冷冻干燥保藏、超低温或在液氮中冷冻保藏、真空冻干保藏、寄主保藏等。 第四节 微生物菌种的扩大培养 扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物叫种子。种子必须满足:菌种细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短;生理状态稳定;菌种总量和浓度能满足大容量发酵罐要求;无杂菌污染;生产能力保持稳定。 种子制备过程:分为实验室种子制备阶段和生产车间制备阶段。实验室种子制备一般采用孢子的制备和液体种子制备两种方式。 种子质量影响因素:培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等影响孢子质量，孢子质量、培养基、培养条件、种龄、接种量等影响种子质量。 种子质量控制措施:菌种稳定性和无杂菌检查。 种子质量:细胞或菌体、生化指标、产物生成量、酶活力。 本章复习思考题 1、如何进行微生物样品的富集培养, 2、什么叫施加选择性压力分离法, 3、简述筛选菌株的指标。 4、发酵高产菌种选育方法有哪些,各自特点、优缺点是什么, 5、菌种退化和复壮的含义,简述菌种退化原因和对策。 6、简述菌种保藏意义、原理和方法 7、简述菌种的扩大培养。 第四章 发酵工业培养基与原料处理 培养基是指利用人工方法配制的供微生物、植物和动物细胞生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质的混合体。 主要用于微生物等的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等。 培养基有三种分类方法:按原料的化学纯度不同分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基;按物理状态不同分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基;按用途不同分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 第一节 发酵营养基质的组成 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶(将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。 培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。在发酵中使用的培养基中，有的还有某些前提、产物促进剂和抑制剂等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。 一、碳源营养 凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，都称为碳源。碳在细胞的干物质中约占50%，微生物对碳的需要最大。 作为微生物营养的碳源物质种类很多。根据碳素来源不同分为无机和有机碳源物质。无机碳源物质有co2和碳酸盐等，有机碳源物质有糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等。 发酵中使用的碳源物质通常是各种有机碳源物质。 二、氮源营养 氮元素是微生物细胞蛋白质和核酸的主要成分。微生物利用氮元素在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质和核酸等细胞成分、以及含氮的代谢物质。 除极少数具有固氮能力的微生物(自生固氮菌和根瘤菌)能利用大气中的氮以外，微生物的氮源都来自自然界 中的无机氮或有机氮物质。 常见的无机氮源主要包括氨水、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等，利用速度快，又叫速效氮源;有机氮源主要是各种工农业下脚料，如各种豆粉、玉米粉、棉籽饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、某些发酵的废菌丝体粉、酿酒工业的酒糟以及实验室常用的牛肉膏、蛋白胨等。 三、无机盐及微量元素 无机盐及微量元素是指除碳、氮元素以外其他各种重要元素及其供体。 凡微生物生长所需浓度在10-4~10-3mol/L范围内的元素称为大量元素，主要是P、S、K、Mg、Ca和Fe等;微生物生长所需浓度为10-8~10-6mol/L范围内的元素称为微量元素，主要是Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。 无机盐的用量虽然不如碳氮源的用量大，但对于微生物却具有重要生理作用，如构成菌体成分、作为酶的组成部分或其激活剂、抑制剂，调节渗透压、菌体内部pH及氧化还原电位等。但高浓度无机盐尤其微量元素对微生物的生长和产物合成有明显抑制作用，低浓度一般有促进作用。 大量元素一般以盐的形式(硫酸盐、磷酸盐、氯化物)加入，培养基中某些成分内已经有足够的微量元素，即微量元素一般不需要再单独加入。 四、水 水是所有生物体的重要组成部分，有重要作用: (1) 水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的; (2) 渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的; (3) 水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位; (4) 水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升; (5) 水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。 根据要求，可能需要去离子水、蒸馏水、自来水等。 五、生长因子、前体物质、产物促进剂和抑制剂 用量极少，但在发酵工业中能够明显提高发酵产物生成率。 生长因子:一般为小分子有机物，广义的生长因子包括维生素、碱基、卟啉及其衍生物和某些氨基酸等;狭义的生长因子一般仅指维生素。一般不需要单独添加。 前体物质:一些添加到培养基中的物质，他们并不促进微生物的生长，但能直接通过微生物的生物合成过程结合到产物分子上去，自身结构基本不变，而产物产量却因此有较大提高。前体物质可以看作产物生物合成反应的底物，可能来源细胞本身的代谢，也可以外源人为添加。 产物促进剂:不是营养物质，也不是前体物质，但能提高产量的物质。可能机制:在酶制剂中，是酶的诱导剂;发酵过程中对微生物有某种益处，如增强了菌的抗自溶能力;在某种程度上起了稳定发酵产物的作用;可能是表面活化剂，如增加传氧效率，同时增加了产物的溶解和分散程度。 产物抑制剂:对生产菌代谢途径有某种调节能力的物质。 第二节 工业发酵中营养基质的种类 按原料的化学纯度不同分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基;按物理状态不同分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基;按用途不同分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 一、不同原料纯度的培养基 按原料的化学纯度不同分为三种。 天然培养基:采用一些化学成分不清楚或化学成分不恒定的物质作为培养基的原料，主要是一些动、植物组织或微生物的侵出物、水解液等。优点:取材方便、营养丰富、价格低廉，适用范围广;缺点:原料质量不稳定，不利于发酵控制。 合成培养基:用各种成分明确、稳定的化学试剂配制的培养基。优点:培养基各成分含量比例完全清楚，便于发酵控制、重复性强;缺点是营养单一、价格较高、适用范围较窄。一般用于实验室的研究和检验工作。 半合成培养基:既含天然成分，又含有纯化学试剂的培养基。发酵中多使用此类培养基。 二、物理状态不同的培养基 按物理状态不同分为三种: 固体培养基:外形呈固体的培养基。发酵工业上主要用于:实验室的菌种分离、纯化、鉴别、鉴定、保藏等;由各种天然固体基质制成的固体培养基，用在各种固体发酵上;由血清或硅胶配制成的特殊培养基，用于培养专门的微生物，一旦凝固就不能再融化;滤膜培养基，用于实验室的分离计数。 液体培养基:外形呈液体的培养基。有利营养成分溶解，便于搅拌和管道运输，有利于传质，有利于发酵产物 的分离和提取，也便于操作和管理等，广泛应用。 半固体培养基:外形呈半固体的培养基。主要用于实验室的微生物运动性观察、噬菌体效价测定以及某些厌氧菌的保藏等工作。 三、工业发酵中用途不同的培养基 (一)实验室常用的培养基 选择培养基:根据某种微生物的特殊营养要求或其对某种物理化学因素的抗性而设计的培养基，目的是使混合样品中的劣势菌群变成优势菌群，从而提高该菌的筛选效率。 鉴别培养基:在培养基中加入一种与待测菌的某种无色代谢物发生显色反应的指示剂，从而在适当的培养后用肉眼即可分辨出待测菌。 (二)发酵生产常用的培养基 孢子培养基:供菌种繁殖孢子用的培养基。目的是发酵菌种在不发生变异的前提下尽可能多的繁殖孢子，一般要求营养不宜太丰富，否则不易产孢子。 种子培养基:直接为发酵提供种子的培养基。比孢子培养基丰富、氮源含量要高些，含有机和无机氮源，成分配比接近发酵培养基。 发酵培养基:供菌种生长繁殖和合成发酵产物的培养基。含发酵菌种正常生长所必须营养元素，也含前体、产物促进剂和抑制剂、消泡剂等物质。 固体培养基 固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。 第三节 工业发酵中营养基质的选择 一、营养基质的选择 营养基质的种类:选择依据:培养的微生物种类，实验研究还是发酵车间，产品、工艺和设备。 营养基质原材料的质量问题:不同产地原料成分存在差异，会影响发酵产品质量。 营养基质选择的经济原则:价格低廉、来源丰富、运输方便。 二、培养基成分用量的确定 参照微生物细胞内元素的比例确定:不同种类的微生物内某种成分含量比较稳定，培养基最终会被微生物吸收利用，故其成分比例可参照该微生物的成分比例，至少可以作为一个重要依据。 参照碳氮比确定:不同微生物不同生理时期对碳氮比要求不同。 其他因素:微量元素、生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂、各种理化条件也要适宜。 第四节 工业发酵中营养基质的配制方法 一、淀粉质原料制糖工艺及培养基的配制方法 二、糖蜜原料培养基的制备过程 一、淀粉质原料制糖工艺及培养基的配制方法 (一)淀粉的组成和特点 (二)淀粉水解原理 (三)淀粉酸水解制糖工艺 (四)淀粉酶水解制糖工艺 (五)水解糖液质量要求 (一)淀粉的组成和特点 淀粉的本质是碳水化合物，由葡萄糖脱水聚合而成，因葡萄糖数量和结构差异而不同;分为直链和支链。 没有还原性，也没有甜味，不溶于冷水，也不溶于酒精、乙醚等有机溶剂。在热水中能够糊化，不同类型糊化温度不同。 淀粉质原料含杂质，需要精制。通过过筛、沉淀、离心等方法进行纯化精制。 (二)淀粉水解原理 微生物分解淀粉必须有相应的胞外淀粉酶，大多数微生物不能直接分解利用淀粉，需要将其人为水解，制成水解糖后才能被微生物利用。 在工业生产上把淀粉通过一定的方法水解为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化”过程，所制得的糖液称为淀粉水解糖液。水解的方法有酸法、酶法和酸酶结合法等。淀粉水解过程可能发生: 淀粉的水解反应:淀粉?糊精?低聚糖?葡萄糖;为主要反应。 葡萄糖的复合反应:在淀粉水解过程中，一部分葡萄糖在热和酸的作用下可以发生聚合反应，生成一些二糖等低糖，这就是淀粉水解过程中的葡萄糖的复合反应。通过α-1,6-糖苷键聚合成异麦芽糖，通过β-1,6-糖苷键聚合成龙胆二糖等。此反应是可逆的，将水解糖液适当稀释，并加酸再水解一次，然后通过中和、脱色、过滤再作为发酵培养基碳源，以提高葡萄糖的利用率。 葡萄糖的分解反应:在淀粉水解过程中，葡萄糖发生弱的脱水反应，生成5-羟甲基糠醛，进一步分解成乙酰丙酸、甲酸等，这些物质相互聚合，或与氨基酸聚合，生成有色物质。 (三)淀粉酸水解制糖工艺 1、淀粉水解糖制备方法概况 2、淀粉酸解法工艺流程 3、淀粉水解速度的影响因素 4、淀粉水解糖液的中和、脱色和压滤 1、淀粉水解糖制备方法概况 酸解法:以无机酸(现在也用有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。优点——工艺简单，水解时间短，设备生产能力大，目前广泛利用;缺点——高温高压以及酸的腐蚀对设备有一定要求;副反应多，影响水解糖液的质量;对原料要求高，原料淀粉颗粒必须大小均匀，否则造成水解不均一不彻底。 酶解法:用专一性很强的淀粉酶将原料淀粉水解为糊精和低聚糖，再用糖化酶继续水解为葡萄糖的制糖工艺。酶解法一般分两步进行(双酶水解法)，第一步是利用α-淀粉酶将淀粉水解为糊精和低聚糖，这步使淀粉的溶解性增加，故称液化;第二步是用糖化酶将糊精和低聚糖进一步水解为葡萄糖，称为糖化。优点——条件温和，设备要求低;酶专一性强，副反应少;淀粉液初始浓度较高，要求较低;糖液颜色浅，较纯净;缺点——生产周期长，需要专门的设备，过滤困难。 结合法:分为酸酶法——先将葡萄糖用酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺;酶酸法——先用α-淀粉酶将原料淀粉水解到一定程度，过滤除去杂质后，再用酸完全水解的工艺。 总体来讲，酶法较酸法更好，酸酶结合法各项指标介于二者之间。 2、淀粉酸解法工艺流程 水解一般以盐酸作为催化剂，产物为糖液即可，不需要精制成葡萄糖。 工艺流程为:淀粉?调浆?过滤?加酸?进料?糖化?放料?冷却?中和?脱色?过滤?糖液。 技术条件一般选择:淀粉乳浓度18%~21%;盐酸用量为干淀粉的0.5%~0.8%，使淀粉乳pH达到1.5左右;进料压力0.02~0.03MPa;水解压力0.28MPa;水解时间一般15min;一般用无水酒精检查无白色反应为止，作为水解终点检查。 3、淀粉水解速度的影响因素 淀粉水解的各种条件，如淀粉乳浓度的高低、酸的种类和浓度、水解温度和压力、糖化设备等会影响糖液的质量。 4、淀粉水解糖液的中和、脱色和压滤 淀粉水解糖液在进入发酵罐前必须通过预处理，即中和、脱色和压滤。 中和:从糖化锅出来的糖化液是酸性的，必须中和，将pH调到4.6~4.8;同时中和后可以通过沉淀除去蛋白质、氨基酸等杂质。中和时温度非常重要，一般为70~80?，中和温度过高，影响下步脱色效果;过低黏度大，影响过滤。 脱色:糖液内有色物质对发酵过程和发酵产品的色泽都有不利影响，需要在发酵前除去。主要利用活性炭脱色法、离子交换树脂脱色法和新型磺化煤脱色法。 压滤:脱色后进行压滤。需要注意温度、及时清理和更换滤布，防止滤布堵塞。 (四)淀粉酶水解制糖工艺 1、液化 通过α-淀粉酶的催化作用水解原料淀粉，使淀粉液黏度不断下降，流动性增强，称为液化。 液化过程中，底物状态、pH、温度、Ca2+、酶用量等影响酶作用。 液化工艺主要有:一次升温液化法、连续进出料液化法、喷射液化法和分段液化法。 液化后，升温100?10min灭菌，压滤去渣，降温进行糖化。 2、糖化 利用糖化酶进行糖化。pH、温度酶用量等影响酶作用。 糖化后，升温100?5min灭菌，降温、过滤进入贮藏罐准备发酵。 (五)水解糖液质量要求 色泽:浅色; 透光率:?60%; 糊精反应:无; 还原糖含量:18%左右; DE值:?90%; pH:4.6~4.8; 无杂菌、不变质、蛋白质等杂质含量合格。 二、糖蜜原料培养基的制备过程 (一)糖蜜原料的性质和组成 糖蜜是制糖工业的废液，一种黑褐色、黏稠的液体，pH5.5左右。可以作为碳源用于发酵。 (二)糖蜜原料的预处理 糖蜜原料的预处理主要包括澄清处理和脱钙处理。 澄清处理目的是除去其中的灰分和胶体物质。糖蜜中含较多钙盐，通过加入钙离子的沉淀剂除去，叫脱钙处理。 复习思考题 1、什么是培养基、生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂, 2、发酵培养基营养基质的选择原则是什么, 3、简述淀粉酸法水解的步骤以及水解过程的影响因素。 4、水解糖液质量有何基本要求, 5、按照化学纯度或物理状态，发酵培养基分别可以分哪几种类型, 6、简述发酵培养基基质的组成。