从酶的专一性看植酸酶与酸性磷酸酶的关系

从酶的专一性看植酸酶与酸性磷酸酶的关系 摘 要:迄今为止的资料表明,大多数植酸酶与酸性磷酸酶的关系密切。通过测定Km,即可判断只有以植酸(盐)为最适底物的酶(包括酸性磷酸酶)才是严格意义上的植酸酶。 关键词:酶的专一性;植酸酶;酸性磷酸酶 Discussion on relationship between phytase and acid phosphatase by specificity of enzyme Abstracts:It is proved that the close relationship between phytase and acid phosphatase. By detection ofKm of the enzymes, the phytase can be distinguished strictly from the enzymes ( including acid phosphatase) using phytic acid or salts ofphytic acid as the op- timum substrate only. Keywords:specificity of enzyme; phytase; acid phosphatase 迄今为止,除了从极个别生物中发现了中性植酸 酶[1-2]和碱性植酸酶[3]外,因生产需要而发现的其余 的植酸酶均为在酸性条件下起作用的植酸酶,而且主 要是微生物来源的植酸酶[3-4]。 目前,世界公认的植酸酶主要是3-植酸酶(EC. 3111318)和6-植酸酶(EC. 31113126)。真菌和大多数 细菌的植酸酶属于3-植酸酶,而大肠杆菌的属于6-植 酸酶。这两种植酸酶降解六磷酸肌醇的方式不同[5]。 从目前的情况看,微生物来源的植酸酶的最适pH值 范围较宽,一般在pH值215~610之间[3]。随着研究 的深入,不同的学者发现,有的植酸酶具有酸性磷酸酶 活性,有的酸性磷酸酶具有植酸酶活性,有的则说植酸 酶是一类特殊的酸性磷酸酶[6]。但是前人已经较广泛 地研究了酸性磷酸酶,它在酶表中的位置编号是 EC3111312[7],我们可以看出它显然与植酸酶是有所不 同的!那么,在这些意见中哪个更加妥当?在这里如 何准确判断一种酶是叫植酸酶还是酸性磷酸酶为宜 呢? 1测定Km可以帮助判断一个酶是植酸酶还是酸性 磷酸酶 生化基础理论告诉我们[8],酶的催化作用显出高 度专一性。当酶只能催化一种底物发生一定的反应 时,显出绝对专一性,而当酶催化某一类物质发生一定 的反应时,则显出相对专一性。在这里酶对其底物及 所催化的反应性质或类型都是有所要求的。当酶有若 干种物质可作为其底物时,酶对它们的亲和力一般是 有所不同的。这时可在一定反应条件下测定酶在分别 催化这些底物反应时的Km,确定Km最小的物质为其 天然底物或最适底物。一般讲,酶的命名以其最适底 物来命名是最为妥当的。 我们来一下植酸酶的研究过程中的几个例 子。 69 第27卷第3期 2010年6月 生物学杂志 JOURNALOF BIOLOGY Vol127 No13 Jun, 2010日本的Nagai和Funahash[9]于1962年报道在麦麸 中发现纯化了的植酸酶。在其文章所列数据中,以肌 醇六磷酸(即植酸)为基准,测得该植酸酶对不同底物 的相对活性的大小顺序为焦磷酸(460%,注,指相对活 性,下同)>ATP(350% )>酚基磷酸(250% )>ADP (220% )>果糖二磷酸(130% )>肌醇六磷酸(100% ) >NADP+(90% )=A-磷酸甘油(90% )>B-磷酸甘油 (65% )>6-磷酸葡萄糖(50% )>AMP(40% ),至于以 二酚基磷酸、NAD+、酵母RNA、1-磷酸葡萄糖为底物 时,则根本未测出活性。在文中该酶以焦磷酸、B-磷酸 甘油、酚基磷酸及植酸为底物所测Km中,植酸的的确 最小,但作者并未报道酶对以上其它底物的Km,因而 该酶难以称得上是真正意义上的植酸酶。可能因为这 个原因,Nagai和Funahash本人也于文中承认该酶不 是一个对植酸特异性的植酸酶。 而李明刚等[10]在研究所纯化的番茄植酸酶时,比 较了该酶分别作用于植酸钠、P1-对硝基苯酚磷酸、果 糖-6-磷酸、ATP、焦磷酸、2-甘油磷酸时的Km,表明该 酶作用于植酸钠时的Km最小。因而称该酶为植酸酶 就要严谨一些,尽管它对上述其它物质也同样存在一 定的催化作用。 可见,通过Km的测定,可以弄清楚一个酶是一个 以植酸(盐)作为最适底物的植酸酶,还是一个只对植 酸(盐)有一定作用的广谱的酸性磷酸酶。 2除极少数情况外,植酸酶往往与酸性磷酸酶关系 密切 研究表明,许多植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶家 族。Maugenest等[11]从玉米中分离得到的6-植酸酶基因 后,发现其氨基酸序列含有RHGXRXP(X为任意氨基 酸)。Ehrilic等[12]从Aspergillus niger (funigatus)中分 离得到的phyB基因序列中含有编码RHGXRXP的区 域。Hartingsveldt等从Aspergillus (ficuum) Alko243中 分离得到phyA基因,其氨基酸序列含有RHGXRXP。 Pasamontes等从A. funigatus分离得到phyA基因,其氨 基酸序列含有RHGXRXP。Berka等[15]从thermomyces lanuginosus中分离到phyA基因,其氨基酸序列含有RH- GXRXP。Mitchell等从Myceliophthora thermophila中分 离得到phyA,其氨基酸序列也含有RHGXRXP。此RH- GXRXP序列是组氨酸酸性磷酸酶的特有序列。但是 Kerovuo等[1]在细菌中克隆的植酸酶基因表明,它不属 于组氨酸酸性磷酸酶家族。这说明这些植酸酶多属于 酸性磷酸酶家族(尤其是组氨酸酸性磷酸酶家族)。 此外,Zamudio等人的工作表明,Lactobacillus plan- tarum中的非特异性酸性磷酸酶也可表现出一定的植 酸酶活性,姚斌的论文中也有一些例子。Dassa等人在 大肠杆菌中克隆了编码酸性磷酸酶的基因appA,发现 该基因与编码葡萄糖-1-磷酸酶的基因同源性较大。而 Golovan等则在大肠杆菌中表达了appA基因,并证实 编码的酶不仅表现出酸性磷酸酶活性而且表现出植酸 酶活性。 这些情况表明,植酸酶和酸性磷酸酶的关系是十 分密切的。大多数的植酸酶属于酸性磷酸酶的家族成 员,也有的是酸性磷酸酶显示出可以催化水解植酸盐 的能力。按照前述理论知识可知,一个酶只有在其最 适底物是植酸(盐)的情况下才适宜被称为植酸酶。 因此,在实际工作中我们应当分析判断所研究的具有 降解植酸(盐)功能的酶是最适底物为植酸(盐)的酸 性磷酸酶(即严格意义上的植酸酶),还是最适底物并 非植酸(盐)的酸性磷酸酶(即非严格意义上的植酸 酶),而这就要靠测定Km来实现。 3生物体内对植酸的彻底降解似应由包括植酸酶在 内的酸性磷酸酶群(或组)的协同作用来完成 以往的资料认为,植酸酶催化水解植酸发生水解 的终产物为肌醇和无机磷酸或大部分为单磷酸肌醇和 无机磷酸。但是程海娜等的综述表明,不同来源的植 酸酶降解植酸产生的最终产物并无肌醇出现,而只有 诸如肌醇-2-磷酸,肌醇-1, 2, 3-三磷酸或肌醇-1, 3, 5-三 磷酸出现。这就意味着,若要将植酸彻底降解为肌醇 和磷酸,必定还必须有新的植酸酶出现,或是依靠已有 或未知的一些酸性磷酸酶的作用。也许正是因为这个 原因,有的学者认为植酸酶除了3-植酸酶和6-植酸酶 外,还应包括一种非特异性的正磷酸盐单酯磷酸水解 酶。也就是说,生物体内对植酸的彻底降解似应由包 括植酸酶在内的酸性磷酸酶群(或组)的相同作用来 完成。 笔者认为,既然从前面的分析可以看到植酸酶和 酸性磷酸酶的关系如此密切,那么在实际工作中无论 是发现新的植酸酶,亦或是发掘现有的或未知的酸性 磷酸酶的降解植酸的作用,对理论研究与生产应用都 是有着重要意义的。具有酸性磷酸酶活性的植酸酶和 具有植酸酶活性的酸性磷酸酶都应重视。 参考文献: [1]Kerovuo J,LauraeusM,Nurminen P,et a.l Isolation,characteriza- tion,molecular gene cloning and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis[J]. Appl EnviromentMicrobiol,1998,64(6): 2079-2085.(下转100页) 70 第27卷第3期 2010年6月 生物学杂志 JOURNALOF BIOLOGY Vol127 No13 Jun, 2010习的积极性,顺利实施实习,提高实习质量,我们 对野外实习考核进行了改革,建立实习成绩评价指标 体系,综合评价学生素质,并将野外实习作为1门课程 成绩计入总学分。 成绩评价体系由3个方面构成: (1)平时成绩。包 括遵守纪律情况、实习过程中野外和室内工作表现,小 组成员之间团结协作表现、实习预习报告和实习 完成情况等,由全体带队教师分别给分取平均值,权重 为30%。(2)专业技能水平。包括学生掌握野外实习 基本技能的水平、标本采集和制作水平、使用实习仪器 的熟练程度和撰写实习报告的水平等,由至少两位相 关教师给课题小组打分,取平均值记为小组成员的成 绩,权重为40%。(3)考试成绩。实习结束组织学生 笔试或口试,考试内容包括基本理论、种类识别、野外 生存常识和运用所学知识解决实际问题的能力等,权 重为30%。 通过建立实习成绩评价指标体系和制定评价标 准,并进行量化管理,可更好地促进学生完成培养能 力,掌握知识和提高综合素质的实习要求。 3 小结 311 实施植物学野外实习教学改革的条件 我校植物学野外实习改革模式是基于师范院校的 教学目标、学校面临的问题与困难而提出,经过数年的 实践,取得了较好的教学效果。要实现此种模式的改 革,需要有一定的前提条件,一是校园附近有丰富的物 种和不同类型的典型植被。二是交通便利。如我校与 寸金公园仅一墙之隔,红树林、野生荔枝林以及南亚热 带植物园也在20~50公里范围内,车程短,既节约时 间又缓解了经费不足的问题。三是学生应有一定数量 的参考书和实习工具,便于自学。四是教师要有较高 的野外实习教学工作素质,对当地的植被及植物种类 充分了解,能够为学生提供细致的辅导。 312 实施植物学野外实习教学改革需注意的问题 植物野外实习教学改革的目的是要提高师范生的 自学能力、独立工作能力和创新思维能力等综合素质, 因此,整个实习要重过程轻结果,因为知识需要积累和 沉淀,短短2周的实习时间不可能要求学生做到十全 十美。例如我们在指导学生对天然植被进行调查时, 物种数较少的红树林就进行全面调查,而群落结构复 杂的季雨林只进行样方调查等。 参考文献: [1]魏学智.植物学野外实习指导[M].北京:科学出版社,2008,1 -2. [2]马纯艳,卜 军,付 亮,等.植物学野外实习的模式探索[J].沈 阳师范大学学报(自然科学版),2007,25(2):286-288. [3]陈 忠.师范院校生物教育实习现状调查与思考[J].生物学杂 志,2005,22(3):54-56. [4]晃 志.药用植物学野外实习基地的选择[J].山西医科大学学 273. 报(基础医学教育版),2006, (3):271-[5]吾玛尔#阿布力孜,吴 旭.动物生物学实践教学改进的探讨 [J].生物学杂志,2005,22(6):52-54. [6]蒋功成,潘正军.提倡一种生物学野外实习的新方式[J].生物学 通报,2004,39(2):26-27. [7]陈模舜,李钧敏.植物学野外实习教学改革实践与探讨[J].生 物学杂志,2003,20(3):43-45. (上接70页) [2]王亚茹,姚 斌,曾虹,等.枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和 酶学性质[J].微生物学报,2001,41(2):198-203. [3]刘 梅,王林云,史挺.植酸酶的研究进展[J].辽宁畜牧兽医, 2003, (2):35-37. [4]刘生峰,彭远义.植酸酶基因研究进展[J].生命科学研究, 2003,7(2,suppl):30-33. [5]汪世华,吕茂洲,孙长春,等.植酸酶的现状及其研究进展[J].广 州食品工业科技,2002,18(1):54-57. [6]杜丽敏,段相林.植酸酶的来源与应用[J].安徽农业科学,2007, 35(16):4727-4728. [7]曾鹏,孙虎山,王宜艳,等.虾夷扇贝胚胎及早期幼虫酸性磷酸 酶和碱性磷酸酶的组织化学研究[J].水产科学,2007,26(1):35 -38. [8]王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学(,第三版)[M].北京:高 等教育出版社,2002,380-467. [9]NagaiY,FunahashiS. Phytase(myoinosito-l hexaphosphate phospho- hydrolase)from wheatbran[J]. AgrBiolChem,1962,26(12):794 -803. [10]李明刚,郝亚桓,但野利秋.番茄植酸酶分离提纯及其特性研究 [J].烟台大学学报(自然科学与工程版),1998,11(4):258- 266. [11]MaugenestS,Martinez I,LescureAM.Cloning and characterization ofa cDNA encoding amaize seeding phytase[J]. Biochem J,1997, 322(2):511-517. [12]EhrlichK C,Montalbano B G,Mullaney E J,et a.l Identification and cloning of a second phytase gene(phyB)fromAspergillus niger (ficuum)[J]. Biochem BiophysRes Commun,1993,195(1):53 -57. 100 第27卷第3期 2010年6月 生物学杂志 JOURNALOF BIOLOGY Vol127 No13 Jun, 2010