应用斑点金免疫渗滤试验测定阴道加特纳菌抗体

应用斑点金免疫渗滤试验测定阴道加特纳菌抗体 应用斑点金免疫渗滤试验测定阴道加特纳 菌抗体 现代检验医学杂志2007年3月第zz卷第2期JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.245 应用斑点金免疫渗滤试验测定阴道加特纳菌抗体 杨晓斌(永州职业技术学院附属医院检验科,湖南永州425OO6) 摘要:目的探讨金免疫测定技术在免疫学检验的临床应用,建立阴道加特纳茵抗体检测的.方法用斑点金免疫 渗滤试验.结果阴道分泌物涂片找线索细胞阳性率为21,此法对加特纳茵抗体阳性检出率为38%;检验P<O.Ol. 结论此法快捷简单,可间接测定加特纳茵的感染. 关键词:胶体金;葡萄球菌A蛋白;阴道加特纳菌;细菌性阴道病 中图分类号:R711.31R446.62文献标识码:A文章编号:1671—7414(2007)02—045—02 TheApplicationOfDIGFAintheDetectingof GardnerellaVaginalisAntibody YANGXiao—bin(DepartmentofClinicalLaboratory, Al囊liatedHospitalofYongzhouVocation—technicCollege,HunanYongzhou425006,China) Abstract:ObjectiveToexploretheclinicalapplicationofimmunogo1dtechnic,onthebasisto findamethodofdetecting theGardnerellavaginalis(GV)antibody.Methods55casesofbacterialvaginosisbydotimm unogoldfiltrationassayand withcomparedthewayofsearchingthecluecellsofvaginalsecretionstain.ResultsIntheway ofsearchingthecluecells ofvaginalsecretionstain,thepositiveratewas21,andthedetectiverateoftheGardnerellavagi nalisantibodybyDIGFA was38%.Throughtest,Pwasunder0.01.ConclusionThisrapidandsimplewaycanbeadopte dtoindirectlydetect theinfectionofGV. Keywords:colloidalgold;staphy1ococca1proteinAGardnerellavaginalis;bacterialvagin osis 阴道加特纳菌(gardnerellavaginalis,GV)是HAuC1为原料,用重蒸水配成0.01g/dl的HAu一 导致细菌性阴道病(bacterialvaginosis,BV)的一Cl溶液,新配制1g/dl柠檬酸三钠.取0.01g/d1 种重要的病原菌[1].目前对于BV的检测方法主要HAuC1水溶液100ml,放入水浴锅内加热至沸 是阴道分泌物涂片染色查找线索细胞,而对GV的腾,磁力搅拌下迅速加入1g/dl的柠檬酸三钠液 病原学检测有细菌分离培养,免疫荧光法以及聚合2.0ml,约2min后溶液呈蓝紫色,继续加热至溶 酶链反应技术(PCR)等,这些方法大多操作较为繁液变为橙红色为止. 琐,干扰因素多;我们采用斑点金免疫渗滤试验1.2.3金标记SPA的制备:用0.2mol/LKCO. (dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)对GV调节胶体金溶液pH至6.0,确定SPA最适包被浓 抗体进行检测,探讨建立一种简单快捷测定细菌度,将所需SPA量及胶体金溶液(pH一6.0),在 性阴道病抗体的方法,对GV作出间接的测定.磁力搅拌器下混合数分钟后,加入一定量聚乙烯二 1与方法醇一磷酸盐(PEG—PBS)溶液,使其最终质量浓度为 1.1阴道加特纳菌可溶性抗原制备取经鉴定后0.15g/L,得到粗制SPA一胶体金复合物. 的GV菌株,接种于5(v/v)人血琼脂培养基1.2.4SPA一胶体金复合物的纯化:将粗制的 上,放35?3,5(v/v)-氧化碳环境培养48SPA一胶体金复合物进行差速离心,除去未结合的 h后,刮取菌苔,制成约9亿/ml菌液,56?灭活,蛋白质和变性的金沉淀,制成纯化的SPA一胶体金 用超声破碎法粉碎菌体,使可溶性抗原溶出,10复合物,加适量PEG—PBS溶液,4?冰箱保存. 000r/min离心10min,取上清液分装,冰存于一201.2.5SPA一胶体金复合物应用液的浓度确定:将 ?冰箱.羊抗人IgG1tzl包被在NG膜上,取纯化的SPA一 1?2胶体金的制备胶体金复合物用PEG—PBS溶液作系列稀释,分别 1?2?1材料:氯金酸(HAuC14.HzO),上海试剂滴加在包被好的羊抗人IgG的膜上,根据显色的 一 厂;葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA,强弱程度,选择合适的浓度. SPA),卫生部上海生物制品所;柠檬酸三钠1.3膜处理及抗原包被 (Na3C6HsO7'2HzO),上海化学试剂厂;草酸钾1.3.1膜处理:用孔径为0.45m的硝酸纤维薄 (KzCO3),广州化学试剂厂.以上试剂均为纯.膜用去离子水浸泡,取出晾干,制成半径为0.5cm 1.2.2胶体金的烧制:柠檬酸还原法制备,以大小的膜. 作者简介:杨晓斌(1964一),男,本科,主管检验师,主要从事体外诊断试剂,免疫学技术研究,E-mail:xinchaoyxb@126.corn. 46现代检验医学杂志2007年3月第22卷第2期JModLabMed,March2007,Vo1.22,No.2 1.3.2抗原包被:用0.02mmol/LpH7.4PBS 适当稀释GV可溶性抗原点于膜中央,室温干燥 后,用含有0.5g/dl的牛清蛋白的PBS封闭,然后 干燥密封环境,置4?冰箱保存. 1.4加特纳茵抗体的测定将微孔滤膜置吸水垫 上,中央加一滴洗涤液(0.01mol/LPBS),以活化 滤膜的面,待完全渗入,加血清标本一滴,待渗 入,用洗涤液冲洗三遍,加入胶体金一SPA结合物 一 滴,待完全渗入,用洗涤液冲洗三遍后,观察结 果.阳性者膜中央出现红色斑点,斑点颜色的深浅 表示阳性强弱的程度. 2结果55例细菌性阴道病患者血清加特纳菌 抗体测定和阴道分泌物查找线索细胞的结果,前者 阳性率为38(21/55),后者阳性率为21(12/ 55),统计学处理,McNemar检验P<O.O1,表明 患者血清加特纳菌抗体阳性检出率高于涂片找线 索细胞检出率. 3讨论 3.1抗原的制备过程中,超声波法处理细菌悬液 时可加石英砂以缩短破碎时间,注意降温处理;同 时要有足量的蛋白质浓度,常用紫外吸收法(波长 280rim)进行测定蛋白质浓度]. 3.2胶体金的制备是试验的关键问题之一,要制 备均一的单分散系胶体金.理论认为,氯酸金的还 原反应中只要还原剂的量一定,就能得到均一粒径 的单分散系胶体金[7].但在制备过程中,得到的大 多是多分散系的胶体金.实验发现,反应的不均匀 和环境条件的变化是造成这种结果的重要原因.因 此,经过优化实验条件,改造反应容器,控制反应速 度,使反应尽量均匀,从而制出均匀的单分散系胶 体金,满足了蛋白质标记的需求.市场上有商品胶 体金供应,可根据实验目的直接选购不同粒径的胶 体金. 3.3葡萄球菌A蛋白(SPA)分子和含有SPA分 子的菌体能与人,兔,小鼠,狗和猪等多种哺乳动物 IgG分子的Fc段非特异性结合,同时仍保留IgG 与相应抗原结合的Fab段位点及其反应特性,可 作为一种非常有用的免疫学工具]. 3.4我们使用PEG稳定SPA一胶体金复合物,很 多报道都采用此法,常用PEG2o0o0,浓度合适,以 免背景太深;也可用卵清蛋白,牛清蛋白和聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)等高分子化合物,标记时要先让 SPA与胶体金反应数分钟再加稳定剂.不同的pH 和不同的高分子化合物的条件下,胶体金稳定时问 不同,测定的灵敏度也不同,需要深入研究,选择一 个较好的环境体系. 3.5SPA一胶体金复合物活性实验[9]:取洁净玻璃 片,加SPA一胶体金复合物及人抗体免疫球蛋白 IgG致敏的红细胞悬浮液各一滴,混匀,室温下放 置10min,用显微镜观察有红细胞凝集,表明免疫 胶体金能与抗体免疫球蛋白发生凝集反应,其生物 活性良好. 3.6胶体金技术在免疫学检验的运用,大大简化 了免疫检验的操作,试剂稳定保存期较长,无需特 殊的仪器设备,可满足床旁即时检验的要求,已广 泛运用于临床诊断. 参考文献: [1]李连青.阴道加德纳菌对细菌性阴道病的病原学诊断 [J].中华医院感染学杂志,2005,15:227. [2]庄文越,王冰梅,孙红霞.阴道加特纳菌抗体检测的临 床应用[J].北华大学(自然科学版),2004,5: 45O一451. [3]张卓然.临床微生物学和微生物检验[M].第3版.北 京:人民卫生出版社,2003:204. [41吕世静.免疫学检验[M1.第2版.北京:人民卫生出 版社,2005:81. [5]徐宜为.免疫检测技术[M1.第2版.北京:科学出版 社,1991:304. [6]陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].北京:科学出 版社,2003:166—168. [7]李成文.现代免疫化学技术[M].上海:上海科学技术 出版社,1992:166—168. [8]沈玉清.免疫学与免疫学检验[M].北京:中国医药科 技出版社,1989:222. [9]曹之舫,武建国.金标记SPA活性简易测定法[J].临 床检验杂志,1990,4:57.收稿日期:2006—10—25 胱蛋白酶抑制剂C的测定方法及临床应用研究进展 庞保军,孙绍军(山东省聊城市人民医院,山东聊城252000) 中图分类号:R692.6R446.11+2文献标识码:A 胱蛋白酶抑制剂C(cystatinC,简称CystC)由机体 所有有核细胞产生,产生率恒定.循环中的CystC经肾小球 作者简介:庞保军(1963一),男,大专,主任技师. 文章编号:1671—7414(2007)02—046—03 滤过,被近曲小管重吸收并完全代谢是一种反映肾小球滤 过率(GFR)变化的理想的内源性标志物.本文就胱蛋白酶