瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病位点检测方法的建立

瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病位点检测方法的建立 瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病位点检测方法 的建立 卞圈冲?2011?10?科技?1? 瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病位点检测方法的建立 焦士会,田月珍,努尔比亚?吾布力.,吴宏军,刘爱荣,张胜利,黄锡霞,王雅春',张沅 (1.中国农业大学动物科技学院,北京100193;2.新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐830052; 3.内蒙古谢尔塔拉种牛场.呼伦贝尔021008:4.内蒙古呼伦贝尔市海拉尔 农垦集团有限责任公司,呼伦贝尔021008) 中图分类号:$823.2文献标识码:A文章编号:1004—4264(2011)10—0001—04 摘要:牛蜘蛛腿综合征(ArachnomeliaSyndrome,AS)是一种常染色体隐性遗传病,现主要见于德系西门塔尔 牛和欧洲瑞士褐牛.患病犊牛先天骨骼系统严重畸形,出生即死亡或出生不久死亡.已证实瑞士褐牛蜘蛛腿 综合征是由编码亚硫酸盐氧化酶的基因SUOX外显子4上一个单碱基插入突变c.363—364insG所致.本研 究首次建立了瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病基因突变位点分子筛查的方法:荧光引物PCR产物电泳法和PCR 产物直接测序法使用荧光引物PCR产物电泳法对10个品种187头牛样本进行该突变位点的基因型分 型,没有发现携带该致病基因的个体.荧光引物PCR产物电泳法判定基因型快速可靠,实验成本较低,适合 大规模群体的检测由于我国曾多次进口瑞士褐牛遗传物质.可能将该致病基因引入本地牛群体.因此对我 国相关牛群开展AS隐性不利基因的筛查是必要的,尤其是针对种公牛进行筛查,可避免该致病基因在群体 的传播造成重大经济损失. 关键词:瑞士褐牛;蜘蛛腿综合征;SUOX基因;分子检测方法 牛蜘蛛腿综合征(ArachnomeliaSyndrome,0MIA pheneID139,Group000059)是一种犊牛先天性骨 骼系统畸形隐性遗传病,因患病犊牛外观像蜘蛛而 得名.患病个体出生时死亡或出生后不久死亡,主要 表现为头部,四肢和脊柱的畸形,畸形损伤的程度 呈现个体差异,个别犊牛还同时伴有心脏疾病或脑 积水等病理特征[112l.该病最早由德国科学家Rieck 和Schade报道(1975)131,主要见于德系西门塔尔牛 和欧洲瑞士褐牛.虽然在这两个群体中AS患病牛表 型特征相同,但是对患病犊牛的系谱分析发现二者 可追溯到不同的祖先.此外,基因定位的结果也显 收稿日期:20l1—03—07 基金项目:国家科技支撑(2006BAD04A01),围际合作项目(编 号:2008DFA31120).新疆维吾尔自治区"卜一五"科技重 大专项(200731134). 硕士研究生,专业方向为分子数量遗传学. 作者简介:焦士会(1986-),女, 通讯作者:王雅春(1968一),女.博士,副教授,研究方向为分子数量 遗传学. 黄锡霞(1963一),女,教授,研究方向为动物遗传育种. 示二者的致病基因可能存在于牛不同的染色体上. 是由不同的基因位点突变引起的l4]. 2010年,Dr~gemaller等应用大规模平行测序结 合Sanger测序技术,证实瑞士褐牛的AS是由位于牛 5号染色体上编码亚硫酸盐氧化酶的SUOX基因 (SulfiteOxidasegene,GeneID509837)外显子4上 的一个G碱基的插入所致,插入突变c.363—364insG 会导致SUOX蛋白从124位置发生移码突变并且 会由于移码提前产生终止密码子c61.而截止目前,对 于德系西门塔尔牛还未见具体致病基因或突变的 报道. 我国曾进口大量不同牛品种的胚胎,优秀公牛 冻精等,通过杂交对我国地方品种牛生产性能的提 高发挥了重要作用.然而,同时也将一些不利的遗 传疾病基因带入,如CVM,BLAD等_7,81.在新疆褐牛 的育成以及选育提高过程中,曾多次引入欧洲及美 国瑞士褐牛活畜和遗传物质,AS隐性有害基因是否 ? 2?卞圈奶斗?2011?10?科技 已存在于我国牛群尚处于末知状态.由于目前我国 对奶牛遗传疾病的检测机构及机制尚不完善,如果 AS携带者公牛在群体中广泛使用,势必会造成致病 基因在群体内的快速传播,将来可能造成巨火的损 失.因此.亟需建立针对AS疾病的榆测方法,进行 不利基因的筛查和剔除.本研究通过对Su0x基因 c.363—364insG突变附近位置引物,建立荧光引 物PCR法并结合测序验证,对多个品种进行检测, 目的在于建立一种褐牛AS隐性遗传病快速,准确的 分子检测方法. 1材料和方法 1.1试验材料 各品种公牛冻精83支,来自北京奶牛中心等6 个单位:内蒙卉i河牛耳组织样78份,来自内蒙古 海拉尔谢尔塔拉种牛场.部分试验材料信息如表1 所示.其中包含1头系谱中标明为AS携带者的德系 西门塔尔公牛ROMEL169052.本试验还测定了该公 牛与三河牛及中国荷斯坦牛的26头杂交后代抗凝 血或耳组织样(未列入表1). 表1牛蜘蛛腿综合征基因型检测的部分试验材料信息 品种个体数(头)样品形式样品来源 注:a.根据公牛系谱信息,其中名为ROMEI(牛169052)的个体为 AS携带者公牛,共收集到其26头后代. 1.2试验方法 1.2.1冻精及耳组织基因组DNA提取 参考陈慧勇(2005)方法【9j提取公牛冻精DNA, 采用DNA提取试剂盒DP30(天根生化科技有限公 司,北京)提取牛耳组织DNA.使用NanoDrop2000 色谱法检测DNA浓度及纯度后,定量到50ng/IxL,4~C 保存备用. 1.2.2引物设计 使用Primer3和Oligo6针对导致褐牛蜘蛛腿 综合征的致病基因SUOK突变位点c.363—364insG 设计引物.上游引物5'一GAGTCACCACGCAGATAT ACCA一3',下游引物5'一CTCAGCTCCCCAATCTrGT ACT一3'.由上海英俊公司合成.预测PCR产物片段 长度245bp. 1.2.3荧光引物PCR及个体基『大]型判定 本试验首先使用荧光引物PCR扩增,上游引物 5'端加入HEX荧光基团..PCR反应体系总体积 20L:DNA模板1L,10xPCRBufier2L,25mmol/L MgC121.2L,2.5retool/LdNTP2L,正反向引物稀 释至10mmol/L各1.5txll'aqDNA聚合酶(5U/IxL) 0.2,0.25p~L,加灭菌去离子水至20p~L.PCR反应程 序为:95?预变性5rain,然后95?变性30s,60?退火 30s,72~C延伸30s,共35个循环,72?最终延伸10min. PCR产物经2%琼脂糖凝胶检测扩增效果,通过毛细 管电泳并使用ABI370系统进行荧光检测,南北京擎 科新业生物技术有限公司完成.荧光检测结果使用 GeneMapper4.0软件判定个体基因型. 1.2.4测序验证 使用普通PCR引物进行扩增,反应体系和条件 同1.2_3.产物回收纯化后测序,由华大基因公司完成. 测序峰冈使用Chromas软件查看,序列用BioEdit软 件ClustalWMufj『)jealignment进行多重比对. 2结果与分析 2.1荧光引物PCR扩增结果 使用荧光引物进行目的DNA片段扩增,经2% 琼脂糖凝胶电泳检测后,可以看到明清晰的条带, 条带在200-300bp之问(冈1).如果部分个体PCR扩 增后无目的条带或者不清晰,则需要重新进行试验. 300bp 200bp 图1PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳检测结果 4为检测个体PCR产物条带,C为PCR扩增阴性对照,M 注:1, 为DNAMarkerI 2.2荧光引物PCR产物毛细管电泳检测 对PCR目的条带清晰的个体.在测序仪上进 行毛细管电泳,并扫描荧光信.GeneMapper4.0 软件判型结果如冈2.检测的187份样品都在246, 中国才?2011?10?科技?3? 23523723924124324524724925】253255257 图2SU0X基因突变位点荧光引物PCR判型结果 注:从峰图上可以看到信号值达34000的主峰,主峰位于246, 247bp2.f~J. 247bp位置处卅现单一信号峰,说明个体均为纯合型. 但是由于没有设定已知基凶型的参照个体,所以需 要通过PCR产物测序来对毛细管电泳检测结果进 行验证. 23PCR产物测序验证 对187份样品中的32份进行了普通引物的 PCR扩增,并回收测序,测序结果如图3a.可以看出 在突变位点处碱基为C碱基,没有出现G碱基插入导 致的叠峰现象(图3e).序列比对结果表明测序检测 个体的序列都与参考序列(NCBIGeneID:509837) 相同(图4),未在PCR产物的127位鸟嘌呤(G)和 128位的胞嘧啶(C)之间发现存在c.363—364insG突 变的杂合子个体,均为纯合基因型,与荧光PCR产 物测序法结果一致. a本试验测序榆测个体 ,,?-?一-A一?艇- h欧洲瑞士褐牛(纯合子)c欧洲瑞褐牛(杂合f) 00'_0{f,^f,【_(,((^I{:^Lt^",f,t,【_r,l,… 图3本试验被测序检测个体PCR产物扩增所得测序结果与文献 报道的测序结果比较.其中a为实验个体PCR产物测序结果;b,c 为文献报道的欧洲瑞士褐牛PCR产物测序结果,其中黑色箭头位 置为报道的瑞士褐牛AS致病突变位点c.363—364insG. i^1一一0j一一'GGA^0GG0GGGej0A^0IG;G:一s$.,(GG7C l0一,:l_S"—GGg,j:A,c,6GGG0(-ncA^G0S^gc0S(nG,(S8G0(0 i10,!口.G0G0Ace0GsGG0j00}^00}G"{e:0c一800G0000e 0005*G:GG0^}?^c,Gs0GGsGag'G0e,Gc^G0s68:f一 2g03..",3G?l:0SG;^}^:^0:'^GG0GG#女l:^,?_l{SA0:^00"G<0005 rf……{AG#0SG^^A:0:GG3Ga,Ge0AA0e0gaci《0GCC~GGGGQC{ 图4使用生物学软件BioEdit对实验检测个体PCR产物测序序 列与基因参考序列进行多重比对的结果.上图中前5行序列分别 为被检测公牛个体1A1,1F07,1H10,2G05,2E03;第6列序列为参考 序列(NCBIGeneID:509837) 3讨论 3.1瑞士褐牛AS致病位点检测方法的建立 研究首次建立了瑞士褐牛蜘蛛腿综合征致病 位点分子筛查的方法:荧光引物PCR产物电泳法和 PCR产物直接测序法.荧光引物PCR产物电泳法. 是在PCR上游或者下游引物的末端标记荧光基团 (FAM,HEX等),PCR产物通过毛细管电泳后在测 序仪中标记的荧光基团扫描信号,得到的荧光信号 在处理软件中对照荧光分子量Marker确定扩增的 PCR产物长度.此法常用于微卫星等多等位基因检 测,是一种常用的检测长度多态的技术手段[9].本 研究使用荧光引物进行PCR扩增,并在测序仪上 进行毛细管电泳扫描荧光信号.扫描结果使用 GeneMapper4.0软件判型,结果所有参与测定的个 体均在同一位置(246bp长度附近)出现单一峰,为 纯合基因型.并通过测序验证了部分试验个体都为 野生型. 使用荧光引物PCR法应特别注意被检测个体 DNA质量.将DNA浓度调到一致,否则容易导致PCR 扩增信号强度参差不齐,可能出现信号弱的个体无 法被检出的情况,需要重新检测.此外,荧光引物 PCR产物在电泳检测时,由于可能存在系统误差,如 内标指示的偏差,或者TaqDNA聚合酶在PCR产物 3'末端加1个A(腺嘌呤)碱基尾巴,导致扫描的片 段位置发生一个或两个碱基的偏移[10,11],如本研 究中预测PCR片段245bp,而检测信号上主峰在 246,247bp位置.在试验的过程中,只需要设置一个 基因型已知的个体作为参照,其他个体参考标 准个体的峰图就能够准确判定其基因型了.本试验只 选取了来自10个品种的187份样品进行检测,没有 找到阳性个体,是验证该分子检测方法的缺憾之处. 建议在我国与瑞士褐牛有关的牛群体中开展大规 模群体的扫描,尤其是种牛群体,一方面可以排查 携带者.另一方面将寻找到的携带者个体与正常个 体一起作为标准参照,以完善检测方法,应用于以 后的检测中. 本研究使用PCR产物测序的方法,对187份样 品中的32份进行PCR产物测序,得到的序列与 NCBI参考序列进行比对,没有发现携带突变位点 M删舭肼M M娜 ? 4?中固奶才?2011?10?科技 c.363—364insG的个体,全部为纯合基因型,与荧光 引物PCR产物电泳法得到的结果一致. 3.2荧光引物PCR与测序检测方法的比较 本研究选取了187头牛的样品作为研究对象. 使用荧光引物PCR产物扫描判型的方法进行瑞士 褐牛AS致病基因突变位点检测,结合PCR产物测 序,结果没有发现该基因的突变.荧光引物PCR产 物电泳法.其检测灵敏度高,可分辨长度差异lbp 的等位基因片段,并且具有同时检测多位点的优点. PCR产物测序法对于寻找DNA序列上的突变是一 种准确性极高的检测方法,通过与已知序列比对可 以非常直观地判定个体的基因型,然而对于大群体 基因型检测其投入成本较高.如普通测序成本平均 3035元.而荧光PCR产物电泳检测法仅12,17元, 可以节约一半以上的成本,非常适用于大规模群体 的检测.此外,荧光引物PCR检测法还可以与多重 PCR技术结合起来,即实现一次PCR检测多种遗传 疾病,在未来种用家畜遗传病检测方面可以发挥更 大的作用[. 3.3c.363,364insC位点不是德系西门塔尔牛AS 致病突变 本研究中检测的个体中包括了1头系谱中标明 为AS携带者的德系西门塔尔公牛ROMEL169052 及其26个后代,在这些个体中未发现突变位点c.363, 364insG的存在,表明西门塔尔牛的蜘蛛腿综合征不 是由SUOX基因的c.363,364insG突变位点引起 的,与文献报道的推测相同l2】.对于引起德系西门塔 尔牛蜘蛛腿综合征的致病基因还需继续深入的挖 掘与研究,争取早日找到致病突变,及早筛查和剔 除群体中的隐性携带者,阻止致病基因在群体中的 传播,由于未曾有荷斯坦牛,河牛等品种牛的蜘 蛛腿综合征报道.本文无法证明SUOX基因的c.363, 364insG突变是否为这些品种牛的致病位点. 4结论 本研究选取了187头牛的样品作为研究对象. 建立了荧光引物PCR产物电泳法和测序法两种对 褐牛蜘蛛腿综合征的致病基因的检测方法,两种方 法都能准确地判定检测牛的基因型.荧光引物PCR 产物电泳法成本低,检测快,可作为该病大群体高 通但未改遗因牛查鲥?网网q… 中圈蜗冲?2011?10?科技?5? 一 步法RT—PCR检测血清混合样品在BVDV清除计划中的应用 黄凯,邵晓磊,马狮 (北京三元绿荷奶牛养殖中心,北京100076) 中图分类号:$823文献标识码:A文章编号:1004—4264(2011)10-0005-04 摘要:利用一步法RT—PCR对58份BVDV抗原阳性血清进行检测.试验证明,对OD舶0=0.3的标准血清,该 方法的最低检出限为5L/头,血清混合检测时至少可将60份OD45o>0.3的阳性血清等量混合.此外,RT- PCR与ELISA—Ag联合使用时,数学推导证明当混合样品为l0,30个/份时,BVDV清除计划检测成本最低, 相比单独使用ELISA—Ag,成本至少下降70%.综上,本试验确立的一步法RT—PCR灵敏度高,特异性好,联 合ELISA—Ag使用,可大幅降低BVDV清除计划的检测成本,故值得推广使用. 关键词:一步法RT—PCR;血清混合检测;BVDV清除计划;抗原捕获ELISAELISA—Ag;最佳混合比 牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovineviraldiarrhea/ mucosaldisease.BVD/MD)是一种严重危害奶牛健康 的病毒性传染病,有研究证明,BVDV持续感染牛 收稿日期:2011—01—29 作者简介:黄凯(1984一),男,硕士研究生,研究方向为奶牛临床疾病 的诊治与实验室诊断. (BovineviraldiarrheavirusPersistentlyinfected cattle)是该病毒循环传播的重要原因rlj2].鉴于PI牛 的危害,上世纪90年代初,瑞典等欧洲国家相继开 展了针对PI牛的BVDV清除计划,经过十余年的 努力.取得了良好的经济效益和社会效益『3'41.尽管 此确实有效,但由于需要使用大量昂贵的进口 .--'_--??--_----?-…?I-I?…-----o--?I…-___---_…??__?-………-_?--..._--.'一. EstablishmentofMolecularDetectionMethodsforArachnomeliaSyndromein BrownSwissCattle JIAOShi—hui,TIANYue, zhen,Norbia?Wbuli.,WUHong~un,LIUAi-rong4,ZHANGSheng—li,HUANGXi—xia, WANGYa—chun.ZHANGYuan (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193; 2.CollegeofAnimalScienceandTechonology,XinjiangAgricultureUniversity,Uromqi830052; 3.BreedingCowFarmofInnerMongoliaXieertala,Hulunbeier021008; 4.InnerMongoliaStateHailarFarmsGroupCo.Ltd,Hulunbeier021008) Abstract:ArachnomeliaSyndrome(As)isanautosomalrecessivedisease,whichwasfoundmainlyinGermanSimmentalandEuropean BrownSwisscattle.Affectedcalvesshowedsevereskeletonmalformationandweredeadatbornorsoonafterbirth.Therewas evidencethatASinEuropeanBrownSwisswascausedbyasinglenucleotideleotideinsertionc.363—364insGintheexon4ofSUOX gene.whichencodesSulfiteOxidase.Incurrentstudy,weestablishedtwomoleculardetectionmethodsofidentifyingthecausative mutationforASinBrownSwiss:fluorescentlylabeledprimerPCRproductelectrophoresisanddirectlyPCRproductsequencing.With fluoreseentlylabeledprimerPCRproductelectrophoresis,therewasnocarrieridentifiedinall187samplesof10cattlebreeds. FluorescentlylabeledprimerPCRproductelectrophoresisenabledfastandreliableindividualgenotypingwithlowercost,whichwas idealforlargepopulationscreening.SinceChinahasimposedembryosandsemenofBrownSwissfromothercountries,mutationfor ASmavbeintroducedandcouldbespreadto1ocalcattlepopulation.Therefore,itisnecessarytoscreenthecausativemutationin cattlep0pulaIionrelatedwithBrownSwiss,suchasXinjiangBrownCattleandtheircrossbreds,especiallythebreedingbulls,in ordertoavoidgreateconomiclossthroughspreadingofthisgeneticdefect. Kevwords:BrownSwisscattle;ArachnomeliaSyndrome;SUOXgene;Moleculardetection method