重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究

重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究 重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定 性研究 第25卷第6期 2008年12月 生物学杂志 JOURNALOFBIOLOGY Vo1.25No.6 Dee,2008 重组人白蛋白干扰素OL一2b融合蛋白的稳定性研究 夏毅,范清林,邹文艺,黄辉,宋礼华 (1.安徽大学生命科学学院,合肥230039;2安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥23OO88; 3.安徽省生物研究所,合肥230088) 摘要:研究重组人白蛋白干扰素_2b融合蛋白(rHsA—IFNa-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指 标,考察rHSA—IFNa一2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA—IFNoL一2b在37?,55?下放置5h后生物学 活性无明显降低,60?水浴1h即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2,3,9)改变时,生物学活性未发生明显变 化:rHSA—IFNc~-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低. 重组人白蛋白干扰素0【-2b融合蛋白对热,酸碱变化稳定,但不宜冻融. 关键词:重组人白蛋白干扰素0l一2b融合蛋白;热稳定性;酸碱稳定性;冻融耐受性 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1008—9632(2008)06—0038—03 重组人白蛋白干扰素c~-2b融合蛋白(rHSA—IFNc~- 2b)是采用基因融合技术研制而成…,临床适应症包括 肿瘤,慢性乙型,丙型病毒性肝炎及其它病毒感染性疾 病.这一融合蛋白与普通干扰素的生物学活性相似, 但药物的代谢动力学特性改变,在猴体内代谢半衰期 延长了2O倍,约为PEG化干扰素半衰期的1.5,2倍; 同时还缩小了体内血药峰谷浓度差,可提高疗效,减少 患者痛苦和医疗费用.相对于普通干扰素而言,重组 人白蛋白融合干扰素是长效制剂,其临床和社会效益 十分显着. 本制品是在毕赤酵母中高效表达并经高度纯化而 IFN_2b,纯度可达95% 成具有高生物学活性的rHSA— 以上;本文就rHSA—IFN0l一2b液体制剂的稳定性进行 研究,并对影响其稳定性的因素进行了较全面的研究, 可为rHSA—IFNR-2b的制剂研究提供参考. 1仪器与材料 1.1实验试剂 重组人白蛋白融合一2b干扰素(0.5mg/mL)安徽 安科生物工程(集团)股份有限公司研发中心基因工 程室制备,批号:20060530;新生小牛血清,购自杭州四 季青生物制品有限公司;DMEM培养液,含0.585g/L. 38 收稿日期:2007—10—18:修回日期:2007—11—16 作者简介:夏毅(1982.),女,硕士研究生,专业方向:基因工程, E—mail:xiayiyi@msn.COB; 通讯作者:宋礼华(1957一),男,研究员,博士生导师,E—mail: Songlh@ankebio.eom. 基金项目:安徽省科技攻关项目(06013063A) 谷氨酰胺,100ku/L青霉素,链霉素,NaHCO调pH值 至7.2,7.4;DMEM培养基干粉由美国GBICO公司生 产,青霉素,链霉素购自华北制药有限公司,谷氨酰胺, 胰蛋白酶均为Sigma公司产品;人基因工程oL-2b干扰 素效价测定参考品系国家参考品,购自中国药品生物 制品检定所. 1.2实验细胞 人羊膜细胞(Wish细胞),购自中国药品生物制品 检定所,自行繁殖,在培养基中单层贴壁生长,2d以上 传代,于含10%小牛血清DMEM培养液中生长;水泡 性口腔炎病毒(VSV病毒),购自中国药品生物制品检 定所,一80?保存. 13主要仪器 倒置显微镜,OLYMPUSXS2一D2;YB一1I澄明度检 测仪;医用超净工作台SW.CT.1F型,苏净集团安泰公 司;二氧化碳孵箱,MJX.160B.Z型,美国OWLSephara. tionSystems产品;P8D垂直电泳槽,美国SHEL—LAB公 司产品;酶标仪及配套数据处理程序,美国Molecular Devices公司;LC—IOAVP型高效液相色谱仪,日本岛 津;N2000色谱工作站,浙江大学智达信息工程有限 公司. 2方法 2.1热稳定性实验 将rHSA—IFNct-2b样品分别放置于37~C,55%和 60?条件下,于1,2,3,4,5h时取样,并立即置于4?保 存,待取样结束后检测其生物学活性和纯度. 生物学活性测定:参照《中国药典》2005版关于 第25卷第6期 2OO8年l2月 生物学杂志 JOURNALOFBIOLOGY Vo1.25No.6 Dee,2008 IFNo~.2b的生物学活性的检测方法,用Wish细胞.VSV 系统测定表达蛋白的效价,参照品的效价计算 rHSA-IFN仅-2b的生物学活性. 纯度测定:分别采用SDS.聚丙烯酰胺凝胶(SDS— PAGE)电泳和高效液相色谱(HPLC)两种方法检测样 品纯度.SDS.PAGE电泳采用12%分离胶,考马斯亮 蓝染色;HPLC:色谱柱(TSK—GELSW3000),流动相为 lOOmMPB,100mMNaC1,pH值7.0,检测波长280nm, 流速0.5mL/min,柱温25?. 2.3酸碱稳定性实验 将rHSA.IFNot一2b样品pH值分别调至2,3,9,于 1,3,6,12h时取样,检测生物学活性以及纯度(方法如 上). 2.4冻融耐受性实验 rHSA—IFN仅-2b样品一20?冻结1d,取出室温融 化,如此反复冻融4次,每次融化后取样,检测其生物 学纯度和活性(方法如上). 3结果 3.1rHSA—IFNot.2b热稳定性实验 rHSA—IFN0【-2b样品分别放置于37?,55?和60? 条件下,其活性变化趋势如图1所示,rHSA—IFNot-2b在 37~(2下放置5h后生物活性没有降低,放置1个月后生 物活性仍未发生明显变化;在55%条件下放置5h活性 无明显降低;60oC水浴1h后,可见rHSA-IFNct-2b活性 降低,5h后活性降低达90%以上,但未见蛋白质聚集 现象.由此可见,rHSA.IFNa-2b的热稳定性较好. 一 1.' 莪 嚣:: n2 0 Ol23?6a对蛔曲) }1.I._.1_. 1.2×10.IU/mL之间,并无明显变化(图2),即rHSA. IFNa-2b在pH值为2,3,9时较稳定.这说明rHSA. IFNa一2b的酸碱稳定性良好. IFNot-2b冻融耐受性实验 3.3rHSA— rHSA.IFNot-2b样品反复冻融4次,每次冷冻时间 为1d,采用SDS—PAGE检测其纯度(见图3),冻融一次 后聚合体条带明显,反复冻融后聚合体含量逐渐增加. 采用HPLC检测其纯度,分别选用了20mMPBS, 100mMPBS,20mMPB,100mMPB(pH值均为7.0)作 为流动相,比较分离效果;另外参照药典,人血白蛋白 的HPLC检测流动相采用lOOmMPB+100mMNaC1 (pH值7.0),我们同时选用(100mMPB+100mM NaC1,pH值7.0)作为流动相,比较分离效果.结果 表明采用100raMPB+lOOmMNaC1作为流动相时,rH. SA.IFN0【_2b聚合体与rHSA—IFNot-2b的分离度最高,可 达到1.4(见图3). ?+研.4Hl懂.2H)叫3.Old)1:未冻融rHSA—IFN~-2b;2:-20"C冻融1次;3:_20~C冻 融2次; 4:-20~C冻融3次;5:-20?冻融4次;6:蛋白markeL 图3rHSA.IFNd_2b反复冻融4次SDS—PAGE图谱 Fig.3SDS-PAGEprofileofrHSA—IFNa-2bafterthe4thfreeze-thaw 图4rHSA.IFNct-2b的HPLC图谱 Fig.4HPLCprofileofrHSA-IFNct-2b 2 1:rHSA—IFNa-2b聚合体;2:rHSA—IFNot-2b 图5rHSA.IFNct-2b冻融4次后的HPLC图谱 Fig.5HPLCprofileofrHSA—IFNct-2bafterthe4thfreeze.thaw 39 第25卷第6期 2008年12月 生物学杂志 JOURNALOFBIOLOGY V01.25No.6 Dec.2008 反复冻融rHSA—IFNc~-2b样品,进样50uL,折算其 聚合体含量(见表1),rHSA—IFNa-2b反复冻融后聚合 体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%;但 其生物活性并未见明显降低(见图6). 表1rHSA—IFNct-2b反复冻融的HPLC纯度测定结果 Table1PurityofrHSA—IFNa一2bafterthe4thfreeze-thaw —1.4 詈j0.8 0.6 l}gO_4 O2 0 l00 ?雹 60:: 钓萎2Ol1 O 0l234 冻囊次数 +活性变化+=聚体古量 图6反复冻融对rHSA-IFNc~-2b二聚体含量及活性的影响 Fig.6Effectoffreeze—thawsonhioactivityofrHSA一1FNa-2b andthecontentofitsdimer 4讨论 蛋白质的稳定性主要是由蛋白质本身的结构特点 和周围环境决定,在分离纯化过程中,搅拌,升温,pH 值变化,盐浓度变化,添加表面活性剂或者有机溶剂 等,都有可能造成结构变化的可能. 温度和pH值是影响rHSA-IFNa-2b水溶液稳定性 的两个重要因素.实验结果表明,rHSA-IFNc~-2b低温 储藏具有良好的稳定性,并对一定范围内的温度,酸碱 变化也表现出较强的稳定性. rHSA.IFN01.2b反复冻融后有聚合体产生,冻融次 数增加,聚合体含量随之增加,冻融4次后聚合体含量 可达l7.91%,其生物活性没有明显降低,但蛋白纯度 有一定降低.可见rHSA.IFNcL-2b对溶液的冻融很敏 感,随着温度的降低,疏水相互作用减弱,氢键增强,三 级结构可能有所改变,天然蛋白质构象发生破坏而使 其变性并开始聚集.所以rHSA.IFNot-2b不宜冻干保 存,以液体制剂4~C保存为宜. 上述稳定性实验结果对于rHSA.IFN-2b的溶液 制剂研究工作具有一定的参考价值,并为下一步临床 研究打下一定基础. 参考文献: [1]张伍魁,范清林,邹文艺,等.白蛋白融合0【.2b干扰素在 毕赤酵母中的表达[J].中国生物工程.杂志,2005,25 (12):45,49. [2]中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程[M] . 北京:化学工业出版社,2000:373,375. [3]罗振,等.人血白蛋白制剂中多聚体的HPLC测定 [J].云南大学学报(自然科学报),1994,1634(2):74. [4]任勇,丁东平,渠刚,等.蛋白质类药物的稳定性研 究进展[J].华南国防医学杂志,2006,20(4):3l,33. Thestabilitystudyofrecombinanthumanserum albumin.interferon-o~-2bfusionprotein XIAYi,FANQing—lin,zouWen—yi, HUANGHui.S0NGLi—hua (1.SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,Hefei23(X)39,China;2AnkeBiotechnology(Group)Co. LTD,Hefei23OO88,China;3.BiologyInstituteofAnhuiProvince,Hefei230088,China)' Abstract:Theresearchwasdevelopedtoevaluatethestabilityofrecombinanthumanalbumininterferonfusionprotein(rH. SA—IFNa-2b).Anti— viralactivityandpuritywereusedasthemainindexestoevaluatethethermalstability.acid— basestabilitv andfreezethawingtolerance.ThebioactivityofrHSA— IFNc~-2bdidnotdecreasesignificantlyat37?and55?for5hours. but decreasedby40%at60? for1hour.ThebioactivityshowednosignificantchangeafterbeingstoredatpH2andpH9for12 hoursorfrzenthawingfourtimes.Thedimerincreasedgraduallyafterfreezingthawingfourtimes,andtheconcentrationofdimer reached17.91%.OurresultsdemonstratedthatrHSA-IFNct-2bisstableatdifferenttemperatureandpHvalues. butitisnotsuit. ableforfreezethawing. Keywords:(rHSA—IFNc~-2b);thermalstability;acid— basestability:freezethawingtolerance