【doc】精氨酸酶对异丙肾上腺素诱导心肌细胞内钙浓度的影响

【doc】精氨酸酶对异丙肾上腺素诱导心肌细胞内钙浓度的影响 精氨酸酶对异丙肾上腺素诱导心肌细胞内 钙浓度的影响 广东医学2008年1月第29卷第1期GuangdongMedicalJournalJan.2008,Vo1.29,No.1 精氨酸酶对异丙肾上腺素诱导心肌细胞内 钙浓度的影响米 孙飞吴赛珠张晓添 南方医科大学南方医院心内科(广州510515);解放军大连疗养院药剂科(辽-7大连116023) 【摘要】目的探讨精氨酸酶对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的心肌细胞内游离钙浓度变化的影 响及其机制.方法培养乳鼠心肌细胞,分别给予精氨酸酶抑制剂S一(2一boronoethy1)一L—eysteine(BEC)及神 经元型一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂vinyl—L—N一5一(1一imino一3一buteny1)一L—omithine(L—VNIO),钙离子 荧光指示剂Fluo一3/AM及激光共聚焦显微镜(LSCM)检测ISO诱导的心肌细胞内游离钙浓度的变化.结果 BEC明显升高心肌中NO浓度和ISO诱导的心肌细胞内钙离子浓度.L—VNIO可以逆转这一过程.结论抑制 精氨酸酶能够通过nNOS/NO途径升高ISO诱导的心肌细胞内钙浓度. 【关键词】精氨酸酶一氧化氮一氧化氮合酶游离钙 精氨酸酶是广泛存在于机体的一种以精氨酸为底 物的酶,精氨酸酶在机体的不同组织中发挥着多种功 能,例如精氨酸酶可以诱导平滑肌细胞增殖,抑制内 皮细胞增殖,抑制炎症因子诱导的巨噬细胞中iNOS 活性,防止机体生成过多的NO.一氧化氮合酶 (NOS)是机体中另外一种以精氨酸为底物的酶,在生 理情况下,心肌中可以表达内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)和神经元型一氧化氮合酶(nNOS),二者以精 氨酸为底物生成NO,参与心肌收缩的调整.不同亚型 的NOS在心肌中的位置不同,从而对心肌的收缩产生 不同的影响.已有研究表明,由于精氨酸酶同NOS 竞争催化同一种底物,二者具有相互的调节抑制作 用j.本实验主要目的是研究精氨酸酶对心肌中 NOS的影响以及对ISO诱导的心肌细胞游离钙浓度的 影响,以探讨精氨酸酶对心肌功能的影响. 1与方法 1.1试剂及仪器胎牛血清(PAA);Fluo一3/AM与 DMSO(Biotium);DMEM培养基(Gibco);NO检测试剂 盒(南京建成);S一(2一boronoethy1)一L—cysteine (BEC),vinyl—L—N一5一(1一imino一3一buteny1)一L —omithine(L—VNIO)(Sigma);LEICA激光共聚焦 显微镜. 1.2心肌细胞培养及分组取新生1,3d的SD乳 鼠(南方医科大学动物所提供)心肌.采用多次酶消 化法,差速分离去除平滑肌细胞,内皮细胞,成纤维细 胞等非心肌细胞.使心肌细胞比例达到95%以上. 调整细胞浓度1×10./ml,用含20%胎牛血清的DMEM 在petridish培养皿中培养4d.给予L—VNIO 500ixmol/L处理12h,BEC10mol/L处理1h,取细胞 培养液,10000r/min分离10min,取上清,硝酸还原酶 法检测NO;PBS液清洗细胞3次.给予PBS液200Ixl, 加入0.5mol/L的DMSO稀释的Fluo一3/AM21, 广东省科技项目(编号:2006B35501005);广州市科技攻关 计划(编号:2003Z3一E4201) ? 49? 37?,5%CO避光孵育45min,PBS清洗3次,Hanks 液500ul液孵育内含BEC10mol/L和(或)L—VNIO 500txmol/L,上机检测,每2s扫描一次,不中断扫描的 情况下给予ISO,终浓度为1umol/L,继续扫描5min. 激光共聚焦显微镜计算机软件进行结果.以单独 给予ISO组为对照组,其心肌细胞内游离钙浓度的荧 光值为100,其余组与之比较. 1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件,各组间 比较采用单因素方差分析(One—WayANOVA);多重 比较采用LSD法;2r差不齐的采用TamhaneT2检验. 2结果 2.1不同处理对心肌细胞NO产生的影响与ISO组 NO浓度[(61.4?9.9)txmol/L]相比,心肌细胞给予精 氨酸酶抑制剂BEC后,NO浓度[(72.8?9.4)txmol/ L]明显升高(P<0.01);给予nNOS抑制剂L—VNIO 则可以明显降低心肌细胞内NO浓度[(44.8?7.9) txmol/L](P<0.O1).BEC同L—VNIO联合处理细 胞,与对照组相比,NO浓度明显降低[(44.8?7.9) txmol/L],但是同单独使用L—VNIO相比,差异无显着 性(P>0.05). 2.2不同处理对心肌细胞中游离钙浓度的影响与 单独给予ISO组(100.0?0.0)相比,给予BEC明显升 高ISO诱导的细胞钙荧光峰值(119.9?9.4)(P< 0.O1).给予BEC+L—VNIO后,BEC对ISO诱导的 细胞钙荧光峰值的升高作用消失,其值(71.2?6.9)同 单独给予L—VNIO荧光值峰值(78.8?7.3)相比,差 异无显着性(P>0.05),同ISO组相比,其细胞内钙荧 光值峰值明显降低(P<0.01). 3讨论 很多的实验表明,精氨酸酶与NOS的活性具有相 互的调整作用.在巨噬细胞,内皮细胞,平滑肌细胞等 组织中,精氨酸酶能够抑制NOS的活性,降低细胞NO 浓度.但是精氨酸酶在心肌中的表达与对心肌功能的 影响研究较少.JOCHEN等报道鼠心肌细胞可以表 ?50?广东医学2008年1月第29卷第l期 GuangdongMedicalJournalJan.2008,Vo1.29,No.1 达精氨酸酶,并且可以调整正常心肌的收缩.本实验 结果表明,抑制心肌中的精氨酸酶活性,可以明显升高 心肌中NO浓度,产生这种效果的原因可能是因为抑 制精氨酸酶活性后,其对NOS的抑制作用减弱,NOS 可用的底物增多,产生的NO增多.同时抑制精氨酸 酶和nNOS活性,则心肌NO产生受到抑制.但是其较 单独抑制nNOS时心肌的NO浓度为高.虽然在统计 学上二者没有明显差异,但提示抑制精氨酸酶活性的 时候,可能会升高了心肌eNOS的活性,通过eNOS途 径升高了心肌的NO浓度. ISO通过cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)对参与 兴奋一收缩耦联过程中的蛋白磷酸化,其中包括对肌 浆网RyR蛋白的磷酸化,促进肌浆网钙释放,产生正 性肌力作用.nNOS/NO是参与调节ISO这一过程的 主要因子.本实验对细胞胞浆钙离子的测定结果显 示,以BEC抑制精氨酸酶,可以明显升高ISO诱导的 心肌内钙荧光值峰值.同时抑制nNOS和精氨酸酶, 则精氨酸酶对ISO诱导心肌内游离钙浓度升高的作用 消失,此时细胞内钙浓度明显低于单独给予ISO时诱 导的钙浓度.这种细胞内钙浓度的变化同心肌细胞 NO浓度的改变相对应.上述结果提示抑制精氨酸酶 可以使nNOS活性升高,其产生的NO增多,ISO诱导 的心肌细胞内的游离钙浓度明显升高.增强心肌细胞 对ISO的反应性. 参考文献 [1]LIUHW,GUOYAOW,SIDNEYM,eta1.Elevated~inaseI expressioninratao~icsmoothmusclecellsincreasescellprollfera— 9264. tion[J].PNAS,2001,98:9260— [2]HUILI,CYNTHIAJ,MEININGERKA,eta1.Activitiesofa一 naseIandIIarelimitingforendothelialcellproliferation[J]_AmJ PhysiolRegulatoryIntegrativeCompPhysiol,2002,282:64—69. [3]GOTOHT,MORIM.ARGINASE?Downregulatesnitricoxide (NO)productionandpreventsNO—mediatedapoptosisinmurine macrophage—derivedRAW264.7cells[J].JCellBiol,1999, 144(3):427—434. [4]BAROUCHLA,HARRISONRW,SKAFMW,eta1.NitricOX- ideregulatestheheartbyspatialconfinementofnitricoxidesyn— thaseisoforms[J].Nature,2002,416:337—339. 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(收稿日期:2007—06—27编辑:庄晓文) 小剂量地塞米松,丹参联合N一乙酰半胱氨酸对 肺纤维化大鼠的治疗作用 刘小燕李时悦陈小波李靖 广州医学院第一附属医院,广州呼吸疾病研究所(广州510120);2中山大学药理毒理教研实验室(广州510089) 【摘要】目的探讨小剂量地塞米松,丹参联合N一乙酰半胱氨酸对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的治疗作 用及其作用机制.方法48只SD雄性大鼠,随机抽出12只,气管内注入生理盐水(作为正常对照),剩余36只 经气管内注入博莱霉素造模成功后随机分为模型组12只(作为阴性对照),小剂量地塞米松和丹参治疗组l2只 (作为阳性对照),小剂量地塞米松,丹参联合N一乙酰半胱氨酸组12只(作为实验组),分别给予相应药物治疗. 以上各组动物在第28天处死,对苏木精伊红染色(HE)肺组织病理结果行半定量评价,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检BALF中IFN一,TNF一的含量.结果?与阴性对照组相比,阳性对照组和试验组的肺纤维化程 度和范围均减轻,差异有显着性(P<0.05),28dBALF中IFN一的含量均升高,TNF一的含量均降低,差异有显着 性(P<0.05);?与阳性对照组相比,实验组肺纤维化程度和范围未见明显减轻,28dBALF中IFN一和TNF一的 含量差异无显着性.结论?小剂量地塞米松,丹参对纤维化大鼠具有一定的治疗作用,其作用可能与增加IFN一 的含量和降低TNF一的含量有关;?N一乙酰半胱氨酸不能增强地塞米松和丹参治疗纤维化的作用. 【关键词】肺纤维化肿瘤坏死因子一干扰素一地塞米松丹参N一乙酰半胱氨酸 特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis, IPF)是一种以普通型问质性肺炎(usualinterstitialpneu— monitis,UIP)为特征性病理改变的慢性炎症性肺疾病, 其病因不明,发病机制不清,缺乏有效治疗手段,IPF确 诊后平均存活期为2,4年,5年生存率为 ?通讯作者 30%,50%.以往使用的药物,如糖皮质激素,秋水 仙碱,硫唑嘌呤,环磷酰胺,D一青霉胺等均被认为对 IPF治疗效果不明显,因此目前许多研究项目集中在 IPF的治疗方面,本试验通过对肺纤维化大鼠肺组织的 病理半定量评价以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中IFN 一 的含量的测定,观察小剂量地塞米松,丹 ^y及TNF— 参联合N一乙酰半胱氨酸对纤维化大鼠的治疗作用.