【doc】 多沙唑嗪和亚硝基乙酰青霉胺体外抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究

【doc】 多沙唑嗪和亚硝基乙酰青霉胺体外抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究 多沙唑嗪和亚硝基乙酰青霉胺体外抑制人 血管平滑肌细胞增殖的研究 2005年第45卷第23期山东医药 多沙唑嗪和亚硝基乙酰青霉胺体外抑制 人血管平滑肌细胞增殖的研究 杨霞,杨君. (1肥城矿业集团机关医院,山东肥城271608;2山东省千佛山医院) 【关键词】多沙唑嗪;亚硝基乙酰青霉胺;血管平滑肌细胞;增殖 【中图分类号】R364.3【文献标识码】B【文章编号】1002—266X(2005)23—0022—02 2004年l1月,2005年2月,我们对多沙唑嗪 (Dox)和亚硝基乙酰青霉胺(SNAP)对人血管平滑 肌细胞(VSMc)的体外抑制作用进行了探讨.现报 告如下. 1材料与方法 1.1主要试剂及仪器Dox,SNAP,DMEM培养 基,新生小牛血清,a一平滑肌肌动蛋白单克隆抗体及 氚标记脱氧嘧啶核苷酸(.H—TdR),460型液体闪烁 计数仪,ZT一?型微量细胞收集器,CO.培养箱. 1.2VSMC培养与鉴定选择1例因胃肠道疾病 (良性病变)手术的患者,术中取肠系膜动脉2, 3cm,用贴块法进行细胞培养.放入Hank’S液中清 洗,去除外膜和内膜,将中膜组织剪成约lmm.的小 块接种于培养瓶内,贴壁3h后浸入2ODMEM培 养液中.15,20d细胞融合,出现”峰与谷”结构.以 0.25胰蛋白酶消化细胞,1ODMEM培养基传 代,采用平滑肌肌动蛋白单克隆抗体免疫组织化学 染色鉴定细胞.实验均采用6代以内的VSMC. 1.3.H—TdR掺入量实验分组对照组(不加任何 药物),Dox(0.1,1,10,25t~mol/L)组,SNAP(500, 800,1000~mol/I)组,Dox(10/~mol/I)+SNAP (300,500,800~mol/I)组,SNAP(500~mol/I)+ Dox(0.1,1,10/~mol/I)组.VSMC以5.0×1O/ I1OOl/孔的密度种于96孔板,细胞贴壁后继续培 养48h.换无血清DMEM同步化培养48h,按分组加 入不同浓度的Dox和SNAP,每浓度1O孔.培养1h 后,加入2O%新生小牛血清,20h后加入.H—TdR 37kBq/孔,继续培养6h.用微量细胞收集器收集样 本,液体闪烁计数法测定放射性强度的每分钟计数 值(cpm). 1.4统计学处理数据以z?S表示,两均数比较采 用t检验. 2结果 2.1Dox对VSMCDNA合成的作用无血清同步 化培养48h后,VSMC.H-TdR掺入量为(220?2O.4) 22 cpm.20血清作用下,VSMC的.H—TdR掺入量为 (1270?96.5)cpm,与无血清同步化组比较,有显着差 异(Pd0.001).0.1/~mol/IDox对VSMC的DNA合 成无明显抑制作用为(1155?96.2)cpm,P>0.05.1, 10,25/~mol/LDox作用下VSMC的.H—TdR掺入量 分别为(983?58.7),(730?54.9),(500?64.1)cpm, 与对照组(20血清组)比较均有显着差异 (Pd0.01).随药物浓度的增加掺入量逐渐减小,表现 为剂量依赖性(各浓度组间两两比较,P均do.O1). 2.2SNAP对VSMCDNA合成的作用在浓度分 别为500,800,1000~mol/L的SNAP作用下,VSMC 的.H—TdR掺入量分别为(1096.33?85.6),(852? 57.8),(693?49.6)cpm.与对照组比较,P均d0.01. 随着药物浓度的增加掺入量值逐渐减小,表现为剂量 依赖性(各浓度组间两两比较,P均d0.01). 2.3Dox与SNAP的协同作用500~mol/ISNAP 分别与0.1,1,10t~mol/IDox共同作用于VSMC,抑 制率分别为37?8.9,48%?6.9,68?5.8, 高于Dox单独作用时(分别为9.1,22.6, 42.5),Pd0.05.10~mol/LDox分别与300,500, 800t~mol/ISNAP共同作用,对VSMC的抑制率(分 别为29.3,36.6,52)明显高于SNAP单独作用 时(分别为8.2%,13.7%,33),P<O.05.说明Dox 与SNAP能够协同性抑制VSMC的增殖. 3讨论 在血管的功能调节中,NO是一个关键的分子. 由左旋一精氨酸(I一Arg)经一氧化氮合酶(NOS)作 用而生成.NOS有两种类型:一种为原生型(cNOS), 又分为内皮细胞型(eNOS)和脑型(nNOS)两种亚 型,酶的激活需要Ca抖的存在,为Ca抖依赖型.另一 种为诱生型(iNOS),来源于巨噬细胞,血管平滑肌细 胞,为非Ca抖依赖型.在生理状态下,L-Arg经细胞 内cNOS途径生成低浓度NO,发挥信号传递,维持 血管张力等生理作用;在病理条件下则通过激活iN— OS持续产生大量NO,由此途径生成的NO往往表 2005年第45卷第23期山东医药 表现为细胞毒作用.许多血管性疾病的产生都与NO 生成不足有关,如高血压,动脉硬化,PTCA术后再 狭窄及与感染性休克相关的血管反应性降低等. SNAP是一种S一硝基胺类化合物,常作为外源 性NO供体及血管扩张剂用于实验.本研究发现, SNAP能抑制VSMC的增殖,且表现为剂量依赖性, 与Garg的结论一致,但低于其报道的抑制率.其原 因可能为在不同的实验条件下(如温度,溶液中的阳 离子浓度等),SNAP降解的半衰期有很大差别. 我们还发现,Dox对VSMC增殖的抑制呈浓度 依赖性.Ulrich等口]已证实这种作用是通过增加细胞 周期依赖性激酶抑制剂(CDKI)p27表达,抑制Rb 磷酸化,阻止VSMC由G.期向S期转换实现的.关 于Dox作用于p27的途径,目前尚未明确.已知 cAMP及Rho/GTP途径均能调节p27表达.cAMP 作为第二信使通过上调p27抑制细胞生长,使有丝 分裂停止在G.期.这一过程是通过调节CD.表达 实现的.但实验显示,Dox对CD.表达无影响,所以 推断Dox可能与cAMP途径无关.Dox是否通过 Rho/GTP对p27表达的负调控影响细胞增殖未见 .Sato研究发现,NO通过阻滞VSMC的细胞增 殖周期来抑制其增殖,而非诱导细胞凋亡.已有研究 表明,这种作用是通过cGMP依赖性和非依赖性途 径实现的.NO通过cGMP途径使细胞周期依赖性 蛋白激酶抑制剂(CDKI)p27和p21的表达上调,抑 制Rb蛋白磷酸化,使VSMC停滞在G.期.当 SNAP或IL一1p作用于VSMC时,细胞内cGMP浓 度显着增加,cAMP激酶活性随之增强,p27下调受 阻,细胞分裂停止在G.期.Dox与SNAP能协同性 抑制VSMC增殖,提示二者可能分别作用于不同的 信号传导途径. Vashisht等对兔于腹主动脉内膜剥脱术后应用 Dox治疗,发现内膜的增生明显被抑制,且呈剂量依 赖性.提示Dox不仅可直接抑制VSMC增殖,还可 与血管壁产生的NO协同性抑制VSMC增殖.我们 在实验中选用的Dox浓度与其在体内发挥降压作用 时的浓度相同,表明Dox在降压的同时,还能与体内 的NO协同性抑制VSMC增殖,防治血管再狭窄. 【参考文献】 [1]UlrichK,ShuW,SarahK,el:a1.DoxazosinInhibitsRetinoblast— omaProteinPhosph0ryIationandGt-STransitioninHuman CoronarySmoothMuscleCells[J].ArteriosclerThrombVasc Biol,2000,20:1216—1224.(收稿日期:2005—05—02) 前列腺素E治疗糖尿病周围神经病变36例疗效观察 郭卫宾 (驻马店市第四人民医院,河南驻马店463000) 2002年3月,2004年12月,我们采用前列腺素El治疗 糖尿病周围神经病变患者36例,取得良好效果.现报告如下. 临床资料:66例患者均符合1980年wHO糖尿病诊断 ,均有不同程度的四肢麻木,疼痛和感觉异常;肌电图检 查示运动神经传导速度(MCV),感觉神经传导速度(sCV)均 减慢.男4O例,女26例;年龄49,68岁,平均57岁;病程5, 24a,平均7.3a;周围神经病变3,46个月,平均14.5个月.将 66例患者随机分为治疗组36例和对照组3O例,两组性别, 年龄,病情,病程等方面差异无显着性,P>0.05. 方法:两组均常规予糖尿病饮食,口服降血糖药物及补充 B族维生素等.治疗组予前列腺素E.100mg+生理盐水 250ml静滴,对照组予复方丹参注射液16ml+生理盐水 200ml静滴,均1次/d,14d为一疗程.观察治疗前后临床症 状,体征变化,检测血糖,肝肾功能,并测定MCV,SCV.两组 问率的比较采用x检验. 结果:治疗组显效(自觉症状基本消失,膝腱,跟腱反射明 显好转或恢复正常,神经传导速度较前增加?5m/s或恢复正 常)24例,有效(自觉症状好转,神经传导速度较前增加<5m/ s)8例,无效(自觉症状无减或加重)4例,总有效率88.9; ? 经验交流? 对照组分别为5,l1,14例及53.4%,两组总有效率比较,P< 0.05.治疗组仅少数患者针刺部位发红,胀痛,减慢输液速度 后缓解. 讨论:糖尿病神经病变的发生机制主要为滋养神经的微 血管病变,以周围神经系统病变最为常见.糖尿病微血管病变 主要表现为毛细血管数目减少,内皮细胞增生肥大;血管基底 膜增厚,管腔变窄.另外,由于血小板聚集或纤维素的沉积,使 毛细血管进一步狭窄或闭塞.从而导致微循环血供不足,缺 血,缺氧,使末梢神经纤维轴突变性,继以节段性或弥漫性脱 髓鞘改变.前列腺素E.在治疗中有以下作用:?其为强有力 的内源性血小板聚集抑制剂,通过刺激细胞表面受体激活细 胞内鸟苷酸环化酶,使血小板内环磷鸟苷浓度增加,Ca浓度 降低,从而抑制血小板活性.?增加红细胞环磷酸腺苷含量, 改善红细胞变形能力,降低血液黏度.?降低血栓素Az水 平,防止血管收缩和痉挛,抑制血栓形成.?直接舒张血管平 滑肌,改善缺血微循环血流.本研究显示,前列腺素E.治疗糖 尿病周围神经病变其疗效明显优于对照组,且无明显不良反 应,是治疗糖尿病周围神经病变较为有效的药物. (收稿日期:2005—03—07) 23