预运动训练对局灶缺血大鼠纹状体单胺类神经递质及其代谢产物变化的影响

预运动训练对局灶缺血大鼠纹状体单胺类神经递质及其代谢产物变化的影响 摘 要:以纹状体为目标核团，探讨预运动训练改善脑缺血损伤的机制。将雄性Wistar大鼠随机分为安静对照微透析组(CM)、安静对照染色组(CS)、预运动训练微透析组(EM)及预运动训练染色组(ES)(每组10只)。首先在CM及EM组大鼠纹状体内埋植微透析探针导轨，手术恢复后，对EM及ES组大鼠进行为期4周的有氧运动训练。训练结束后，对所有大鼠实施大脑中动脉阻塞手术，并运用微透析-高效液相色谱电化学联用技术对缺血及再灌注过程中大鼠纹状体细胞外液多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)及各自代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、3-甲基4-羟基苯乙二醇(MHPG)的变化进行观察。CS及ES组大鼠，在大脑中动脉阻塞手术恢复24 h，取脑进行TTC染色。染色结果发现，与CS组相比，ES组大鼠纹状体损伤面积比例显著降低(P 1.5 微透析样品的采集 pH值为7.4的人工脑脊液(Artificial cerebrospinal fluid，aCSF)，用0.2 μm无菌过滤器过滤。将膜长度为4 mm的透析探针(MAB，瑞典)插入探针导轨，探针与人工脑脊液灌流系统直接相接。采样前开启透析灌流系统，调节恒流泵控制液体流速为2 μL/min。灌流平衡90 min后开始收集透析液，大鼠从局灶缺血手术前30 min到缺血手术过程中及再缺血再灌注120 min期间每隔15 min进行一次采样，每次采样30 μL，透析液经冷冻收集器收集后，置-20 ?的冰箱中保存待测。 1.6 透析液中DA、5-HT、NE及其代谢产物的检测 DA、5-HT、NE及其代谢产物浓度的检测由库仑阵列电化学高效液相系统完成(Model 5600A CoulArray Detector System，美国惠泽ESA公司)。色谱柱为HR-80 C18反相柱(80×4.6 mm I.D.，3 m，100 ?)，检测器为电化学检测器(Model 5600A CoulArray Detector)。流动相配制方法为:一水合柠檬酸13.347 g，二水合柠檬酸三钠17.906 g，EDTA?2Na?2H2O 37.2 mg，八烷基磺酸钠(OSA) 117.15 mg，加入超纯水500 mL左右充分搅拌至溶解，再加入甲醇(色谱纯)100 mL，然后用超纯水定容至1 000 mL。调整pH为4.3。流动相可循环使用一周，但每天必须经0.22 m水系滤膜负压过滤兼脱气处理。仪器参数设置:流速为0.6 mL/min，电化学检测器的信号经记录仪处理后输入计算机，用专用软件(CoulArray for Wingdows?32 applycation software)记录并存储。 1.7 损伤面积的测量 安静对照染色组及预运动训练染色组大鼠在缺血手术完成后将其皮肤缝合，恢复24 h后，测量其脑损伤面积。大鼠经过量麻醉后，实施心脏灌流手术，脑组织被取出后切成2 mm厚度的脑片，然后使用2，3，5—氯化三苯基四氮唑(2，3，4-triphenytetrazolium-chloride，TTC)进行染色。因损伤区脑组织无法着色(仍保持白色)，正常脑组织被染成红色。对照大鼠脑立体定位图谱，测量大鼠右侧纹状体损伤面积(由Image-Pro Plus，Media Cybernetics，version 6.0软件完成)，其损伤百分比即可通过公式计算出来，计算公式为[10]:[对侧纹状体面积-(同侧纹状体面积-损伤面积)/对侧纹状体面积]×100%。 1.8 数据统计 根据标准曲线计算出每个样品中各种递质及其代谢产物的水平，为避免微透析探针回收率差异，以每只大鼠安静状态下透析液中物质水平为基础值，使用不同时间段样品透析液物质水平与基础水平的比值来反映其变化规律，所有数据均用平均数?标准差( ?s)示，应用SPSS 13.0统计软件进行独立样本T检验，P0.05)。二羟苯乙酸(DOPAC)为DA的代谢产物，对其变化进行观察，结果发现，缺血过程中两组大鼠纹状体胞外DOPAC水平均快速下降，后逐渐上升(图2-B)。再灌注时，DOPAC快速上升，后又逐渐下降，但180 min时刻，两组胞外DOPAC仍高于安静水平。对两组变化情况进行进行对比发现，缺血15 min时，预运动训练组大鼠纹状体胞外DOPAC水平显著高于对照组(P0.05)。 2.3 预运动训练对5-HT及其代谢产物变化的影响 如图3所示，对照组与预运动训练组大鼠局灶缺血15 min后纹状体胞外5-HT水平均出现显著升高，在缺血30 min后达最高值，随后逐渐下降，再灌注期间，两组纹状体5-HT水平持续下降。缺血15,30 min期间，预运动训练组大鼠纹状体胞外5-HT水平极显著低于对照组(P0.05)。对5-HT代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)变化进行观察发现，缺血过程中两组大鼠纹状体胞外5-HIAA水平同样呈快速下降趋势，后又逐渐上升。再灌注时，5-HIAA -HIAA均高于各自安静时刻水平。对先快速上升，后逐渐下降，180 min时刻，两组胞外5 两组变化情况进行对比，仅缺血30 min时，预运动训练组大鼠纹状体胞外5-HIAA水平显著高于对照组(P0.05)。 2.4 预运动训练对NE及其代谢产物变化的影响 如图4所示，缺血及再灌注过程中，两组大鼠纹状体胞外NE及其代谢产物3-甲基4-羟基苯乙二醇(MHPG)的变化与DA、5-HT及其代谢产物的变化趋势基本一致:缺血15 min后纹状体胞外NE水平均先升高，后又逐渐下降(缺血15,45 min期间，预运动训练组大鼠纹状体胞外NE水平极显著(P 3 讨论 预运动训练对脑缺血的保护作用已经得到了广泛证实，在探讨其保护作用的可能机制时，以往研究更多将注意力集中于预运动训练对心脑血管[11]或大脑皮层的作用上。近年来，有学者开始注意到纹状体微环境、结构及功能的改变可能与预运动训练的缺血保护作用密切相关[6，9]。本实验对不同组别大鼠MCAO缺血再灌注24 h后纹状体损伤比例进行比较发现，预运动训练可显著降低纹状体损伤面积的比例(见图1)，该结果一方面再次验证了预运动训练对脑缺血的保护作用，另一方面，进一步证实了纹状体结构及功能改善对脑中风预后的积极影响。 已知DA及5-HT等多种单胺类神经递质的变化与纹状体缺血损伤的发生密切相关[7]，本实验结果发现，缺血过程中纹状体胞外DA、5-HT及NE水平均出现快速升高，随后又逐渐下降，再灌注过程中，基本稳定在基线以下水平，该结果与以往报道结果[13-14]一致。缺血过程中，纹状体胞外DA、5-HT及NE水平快速升高的确切机制目前尚未完全阐明，已经有大量文献报道，缺血过程中纹状体胞外谷氨酸浓度会迅速上升[6，9，14]，而Ohta等[15]研究结果显示，胞外谷氨酸浓度的升高会导致DA、5-HT及NE等单胺类神经递质的大量释放。另外，缺血过程中会有大量的自由基产生，自由基攻击神经元的脂质膜结构，使细胞膜结构和功能受到损伤，该途径也可能是导致单胺类神经递质向胞外泄漏的机制之一。在纹状体内，DA可与相应受体结合起到兴奋神经元的作用，虽然5-HT及NE与相应受体结构后可起到抑制神经元兴奋性作用，但由于3种神经递质中DA升高幅度最大(缺血15 min后，对照组DA水平可达基值的(2120.5?131.2)%)，因此，3种神经递质的净作用仍表现为兴奋性作用。胞外累积的单胺类神经递质与兴奋性氨基酸类神经递质共同作用可导致细胞内的Ca2+超载，诱发神经元兴奋性毒性，该途径可能是导致纹状体神经元缺血死亡的重要步骤之一[16]。另外，细胞内单胺类递质向细胞外液大量释放后，还可被单胺类氧化酶氧化成氢过氧化物，氢过氧化物生成氧自由基，引发自由基连锁反应，加速纹状体细胞缺血死亡[17]。从图2-A、图3-A及图4-A中可以看出，预运动训练可显著降低缺血过程中纹状体细胞外液DA、5-HT及NE的水平，一方面可能是由于预运动训练降低了缺血过程中大鼠纹状体细胞外液谷氨酸的累积[6，9]，进而减少了谷氨酸对单胺类神经递质向胞外释放的诱导作用。另一方面，资料显示，规律有氧运动可显著提高纹状体过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)等抗氧化酶的活性[18]，本实验中，4周预运动训练可能通过提高纹状体抗氧化酶的作用，提高了纹状体对缺血的耐受能力，减少了神经元脂质过氧化损伤，降低了单胺类神经递质向胞外的泄漏，进而起到了减少神经元细胞死亡的作用。 对于缺血及再灌注过程中纹状体细胞外液DOPAC、5-HIAA及MHPG的变化，如图 2-B、图3-B及图4-B所示，缺血过程中3种神经递质代谢产物均呈快速下降趋势，且预运 动训练组各代谢产物下降幅度均不同程度小于对照组。缺血过程中纹状体细胞外液中单胺类 神经递质代谢产物水平下降的详细机制目前尚不完全清楚，可能是由于单胺类神经递质代谢 所需能量匮乏及酶活性下降所致[12]，预运动训练组下降幅度小于对照组，提示预运动训练 组纹状体血液及能量供应优于对照组。而再灌注期间，单胺类神经递质代谢产物均呈快速上 升既而缓慢下降趋势，该结果与以往报道一致[12-13]。再灌注期间，单胺类神经递质代谢产 物的这种变化可能是由于能量物质供给及相关酶活性的恢复有关，两组间比较无显著差异。 科学、合理的预运动训练是保护缺血性脑损伤的一种有效手段，纹状体作为预运动训 练发挥其神经保护作用的靶标核团之一，缺血及再灌注过程中，其胞外单胺类神经递质及其 代谢产物水平的改变可能是预运动训练实现其保护功能的途径之一。 参考文献: [1] Moro M A，Almeida A，Bola?os J P，et al. 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