内皮细胞的培养

内皮细胞的培养 一：内皮细胞培养基的配制（内皮通用） M199或DMEM 按配方配制 胎牛血清 20% 青霉素 100U/ml 链霉素 100ug/ml L-谷氨酰胺 2mM ECGS（内皮细胞生长因子粗提物） 100ug/ml 肝素钠 20ug/ml (40u/ml) 胰岛素(可不用) 40ug/ml 用0.2um的滤膜过滤除菌。培养基在4度可保存2周，在-20 度可保存3个月。 二：培养板，瓶的包被 2%的白明胶溶液（HanKs或培养基配制） 96孔培养板——50ul/孔 24孔培养板——100ul/孔 6 孔培养板——200ul/孔 T25培养瓶——1ml/瓶 T75培养瓶——3ml/瓶 4度过夜（或37度30分钟后4度1小时），细胞加入前弃去明胶溶液。 三：肝窦及肝癌内皮（小细胞）培养基： 胎牛血清 10% 青霉素 100u/ml 链霉素 100ug/ml L-谷氨酰胺 2mM DMEM或M199 按配方配制 将细胞冷冻管在37?水浴中快速震荡溶解，然后将细胞悬液 缓慢加入到含有30mlDMEM溶液的50ml离心管中，经 1000rpm离心5分钟，弃上清。加6ml内皮细胞培养基中， 接种在明胶预先包被的T25培养瓶中，37?5%的二氧化碳培养箱中培养，24小时后更换培养基。 : 先将T25细胞培养瓶中的培养液弃掉，加入D-HanKs液将 瓶中的培养液清洗干净，弃去洗液并加入胰蛋白酶消化液 3ml（0.1%胰蛋白酶 0.1%的EDTA）。 ? 在显微镜下观察细胞形态变化，当大多数细胞（80%）变圆后，加入20ml无血清DMEM培养基，震荡使细胞脱壁。 ? 消化后的细胞悬液经1000rpm离心5分钟后，弃去上清，将 细胞沉淀悬浮于18ml内皮细胞培养基中，混匀后分种于三 个明胶预先包被的T25培养瓶中。 三， 将消化后的细胞沉淀溶解于细胞冷冻液中（胎牛血清加10% DMSO），配制成10?细胞/1.5ml浓度，将细胞悬液分装于细 胞冻存管中（1.5ml/管），将冻存管放置于-20?冰箱中24小时后移入液氮中。 基本原理： 免疫细胞化学是在细胞化学技术的基础上，吸收免疫学的理论和 技术发展起来的一项技术，其基本原理是用荧光素或酶等标记物 或显色物标记特异性抗体，通过免疫学中的抗原抗体反应与细胞 内的相应抗原结合，形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合 物，因此可用荧光显微镜或普通光学显微镜观察到复合物的存 在，达到检测细胞内抗原物质的目的。细胞免疫化学是一项综合 性技术，包括标本的准备（制备，储备，固定），染色方法以及 结果的分析判断，非特异性染色的减轻，消除等。 实验材料： 细胞载玻片（96孔），上海玻璃片厂 细胞抗原，各种待检细胞 第一抗体，杂交瘤上清及免疫多抗 第二抗体，生物素化马抗小鼠IgG(H+L)， vector生产， 辣根酶标记链亲合素， vector生产 第二抗体购自中山公司 DAB, 购自中山公司 马血清封闭液，购自中山公司 30%双氧水，国产 本院领取 无菌细胞刮子 本室自制 PBS 实验步骤： （一） 细胞点片的制备： 1． 细胞载玻片洗液泡30分钟，自来水洗干净，过三次蒸 馏水，绸布擦干，于95%乙醇保存待用。 2． 待测细胞（细胞抗原）用刮子轻轻刮下，用PBS洗三次 3． 配成500万/ml（PBS稀释），按1万/孔进行点片（2ul/ 孔）。 4． 以上细胞点片后吹干（超净台中吹2小时以上）。 5． -20?丙酮固定30分钟，吹干，密封4?保存（干燥器 内）。 （二） 单抗的测定： -20?丙酮固定后的细胞点片 ? PBS洗一次 ? 3%双氧水（PBS配制）在染缸中去除内源性过氧化物酶（15分钟）。 ? PBS洗三次 ? 10%马血清封闭10分钟 ? PBS洗一次 ? 超净台中吹干（1小时以上，充分干燥） ? 加入一抗（单克隆上清，1:2或1:5）4? 16小时 ? PBS洗三次 ? 加生物素化马抗小鼠IgG(H+L)（5ug/ml） 室温30分钟 ? PBS洗三次 ? 加辣根酶标记链亲合素（2.5ug/ml） 室温30分钟 ? PBS洗三次 (注意：生物素化马抗小鼠IgG(H+L)及辣根酶标记链亲合 素配制时，加2%马血清) ? 加DAB（10mlPBS+6mgDAB+30%双氧水10uL） ? 显色5-6分钟 ? 自来水充分冲洗 ? 显微镜下观察结果（观察时片子上可点适量的水） 免疫组织化学指应用免疫学及免疫化学原理，检测机体内具 有抗原性的化学物质或细胞与组织等成分的技术，也可用来 检测抗体。免疫组织化学显示抗体与抗原特异性结合的信号 有荧光素，酶标或金属颗粒标记等。根据这些显示手段，大 致可分为免疫荧光技术，免疫酶标技术及免疫金属标记技 术，其中以免疫酶标技术最为常用。 石蜡切片 本院中心制备 PBS 中山公司 拘橼酸缓冲液 中山公司 湿盒 抗原修复盒 免疫组化笔 第一抗体 二甲苯 95%乙醇 85%乙醇 70%乙醇 50%乙醇 无水乙醇 S-P通用型组化试剂盒 中山公司 DAB DAKO 公司 一：脱蜡至水 二甲苯 20分钟 ? 二甲苯 20分钟 ? 无水乙醇 10分钟 ? 无水乙醇 10分钟 ? 95%乙醇 10分钟 ? 85%乙醇 10分钟 ? 70%乙醇 10分钟 ? 50%乙醇 10分钟 ? DDW 10分钟 二：抗原修复 拘橼酸缓冲液高火3-4分钟 至有小气泡（沸腾） ? 放入切片 高火1-2分钟 ? 低火 4分钟 ? 中低火 4分钟 ? 自然冷却 1小时以上 三：免疫组化笔画片 注意：1，笔尖不能用力向下戳，以免笔内液体流出。 2，画片时不要碰到组织块。 3，不要干片。 四：S-P试剂盒的使用 免疫组化笔画片 ? PBS 洗三次 （每次3分钟） ? S-P KiT solutionA 10min ? PBS×3 10min ? S-P KiT solutionB 10min ? PBS×3 10min ? 加一抗（按一定稀释度） 4?过夜（湿盒） ? PBS×3 10min ? S-P KiT solutionC 10min ? PBS×3 10min ? S-P KiT solutionD 10min 五：DAB 显色 ? DAB 显色（3-5分钟）每块组织约200ul ? 自来水冲洗干净 ? 苏木素复染 30秒 ? 自来水冲洗干净 ? 1%HCL/乙醇 分色 3秒 （作用：把细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料 脱去，保证细胞核和细胞浆染色分明，不可分色过度。） ? 1%氨水反蓝 3秒 （作用：分色后，苏木素在酸性条件下为红色，在碱性条件 下为蓝色） 六：脱水，透明，封片 ? DDW 5min ? 50% 乙醇 5min ? 70% 乙醇 5min ? 85% 乙醇 5min ? 95% 乙醇 5min ? 无水乙醇 5min 吹干 ? 二甲苯 10min ? 加拿大树胶封片 ? 显微镜下观察结果 杂交瘤细胞培养基： DMEM H（高糖） 国产胎牛血清 10% L-谷氨酰胺 2mM 青霉素 100U/mL 链霉素 100ug/mL 杂交瘤细胞的换液，传代，冻存 当杂交瘤细胞在容器中长到80-90%满，即可进行换液 或传代。 换液： 轻轻吸去杂交瘤细胞上清液（不要接触贴壁细 胞），换入新鲜细胞培养液。 传代：轻轻吹落贴壁细胞，（或用手轻拍瓶壁振落细胞） 混匀，根据需要接种细胞数量。一般为1传2到1传10均可。 冻存：1传2传代细胞，待细胞长至80-90%满（1-2天），换液，24小时后冻存。轻轻吹落贴壁细胞，（或 用手轻拍瓶壁振落细胞）1500rpm/min×5min 离心，弃去上清液，加入细胞冻存液（90%国产胎牛血清， 10%DMSO），细胞浓度>500万/mL。4?放置1小时，-20? 放置2小时（液体结冰），-80?放置24小时，转入液 氮中。 大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强 的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水， 发生凝聚而沉淀析出。 硫酸胺 生理盐水 小鼠腹水（富含小鼠单抗） 电磁搅拌器 1：饱和硫酸胺溶液的制备 称取硫酸胺400克加入500mL蒸馏水中，70-80?水浴搅拌至溶解，室温放置过夜，随着温度下降部分硫酸胺即结晶析 出，达到过饱和状态。用氨水调PH至7．0-7．2备用。 2：盐析腹水 在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺溶液至所需浓度后， 4?过夜，离心，弃上清。沉淀用生理盐水溶解。 小鼠腹水 ?50%饱和度硫酸胺 沉淀球蛋白 ?33%饱和度硫酸胺 沉淀r球蛋白(抗体主要部分) 3：去盐 盐析分离的抗体中含有大量中性盐分，长期存在影响抗体的 生物活性和后续应用。去除方法有透析法，超滤法，葡萄糖 凝胶G50层析法。 透析法去盐 将透析袋用蒸馏水浸泡后，一端用橡皮筋扎 紧，装水试验不漏后加入含盐溶液并扎紧。将透析袋悬于透 析液中，置4?冰箱中透析，每3-4小时换液一次，至透析 液中不含NH4离子。在电磁搅拌下或加大透析液体积可加快 透析过程。 基本原理：致敏的B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这 些细胞不能在体外长期存活。骨髓瘤细胞可在体外长期生存 并大量繁殖，但不能分泌特异性抗体。若将小鼠的骨髓瘤细 胞与这些能够分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特点，又具有B淋巴细胞 分泌特异性抗体的能力。由于每个致敏的B淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体，所以克隆化的杂交瘤细胞能够 分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体，这就是单克隆抗体 制备的基本原理。 一：颗粒性抗原（固定细胞）制备 体外培养细胞或活体组织 ? 制备成单细胞（非胰酶消化） ? PBS 洗三次 ? 加入3%多聚甲醛（4?）40ml，4?过夜（固定） ? 2500rpm/min×10min ? 加入40mlPBS混匀 37? 2小时 ? 2500rpm/min×10min ? 加入40mlPBS混匀 37? 2小时 ? 2500rpm/min×10min ? 加入40mlPBS混匀 37? 2小时 ? 2500rpm/min×10min ? 加入适量PBS（含1000U/ml青霉素 ? 1000ug/ml链霉素） 4?保存待用（使用时PBS洗去青，链霉素） 二：免疫动物 6-8周雌性BABL/C小鼠，皮下多点接种固定细胞600万/只， 一周后改为腹腔注射600万/只。以后间隔一周或10天免疫一次，免疫10次后取小鼠尾血，开始测定抗体效价，当效 价达到1?20000-1?50000时，即可进行细胞融合。（融合 前三天冲击免疫，600万/只，腹腔注射） 三：细胞融合 材料 S/P20细胞 HAT 选择培养基 GIBCO（100×）或sigma(50×) DMEM IMDM PEG 1500 ５０％Ｗ／Ｖ Ｒｏｃｈｅ公司 35mm平皿 30个 6cm玻璃平皿 6套 100ml DDW (高压灭菌) 眼科剪，镊各3把（无菌） 普通镊（大）2把 100-150目筛网3个（无菌） 玻璃10ml注射器芯2个 3-4周雌性BALB/C小鼠 3只 50ml塑料离心管2个（进口，无菌） 手套 2副 （高压灭菌） HT（GIBCO 100×或sigma 50×） 方法 1：实验动物的准备 (1) 取免疫后小鼠（600万/只，免疫一年，效价1：20000） 眼球取血（0.8ml/只），分离血清-20?保存。 (2) 自来水冲洗小鼠，置于1/100新洁尔灭浸泡1-2分 钟。 (3) 放入超净台，75%乙醇全身消毒。 (4) 小鼠右侧卧位，剪开皮肤，剪开腹膜，用小镊子提 取脾脏，放于平皿中。（免疫充分的脾脏个体大且色 深） (5) 研碎脾脏。 (6) 加IMDM 10ml, 过100目筛网，1200rpm×5min。 (7) 吸出上面的培养液，加2ml IMDM 混匀。 2：S/P20细胞的准备及细胞融合 （1） 融合前1周，复苏S/P20细胞（早代），连续传3 代。 （2） 收集S/P20细胞，1200rpm×5min。 （3） 取1支50ml塑料离心管，将脾细胞吸入。 （4） 按S/P20?脾细胞体积=1?1，加入S/P20细胞 （S/P20?脾=1?1 离心后体积比）。用DMEM补足 10ml, 1200rpm×5min。 （5） 吸出离心后的液体，在手心中轻轻转动，混匀。 （6） 定Timer,6min. 在37?水浴中，（保温壶）第一分 钟加入PEG 0.7-0.8ml。（将吸管插入细胞中，慢 慢搅拌加入PEG），放置一分钟。 （7） 第三，四分钟加入2mlIMDM (吸管插入到细胞底层， 因为PEG重），先慢后快。 （8） 第五，六分钟加入余下的IMDM，（大约8ml)，最终 体积10ml。 （9） 1200rpm×10min,吸去上清，加1滴IMDM，在手心 中混匀。 （10） 无菌取正常小鼠胸腺，100目筛网成单细胞， 10mlIMDM 洗一次，1200rpm×5min。 （11） 取1ml HAT，加入融合细胞中（1mlＨＡＴ可接种 ２０个平皿）。 （12） 离心后的胸腺细胞加１ｍｌ ＩＭＤＭ，加入融合 细胞。 （13） 轻轻吹匀细胞，用ＩＭＤＭ补足５ｍｌ。 （14） 加入１０ｍｌ胎牛血清。 （15） 加入半固体培养基至４０ｍｌ，盖好离心管，充分 混匀。 （16） 加入到３．５ｃｍ平皿中，每个平皿３－４滴（２ ｍｌ），放入干净饭盒内，保留一个平皿在外面观 察，其余８天内不用打开。 （17） 置于５％ＣＯ２，３７?培养箱中。 （18） ８天后，在超净台内，用解剖镜挑取单克隆 ，１ ０－１５个９６孔板。 （19） 待细胞在９６孔板长到２／３满后，收集上清，测 定其与免疫细胞的反应情况。选取阳性克隆转入 2４孔板，重复检测后，选择阳性克隆－Ｔ２５－Ｔ７５ 大瓶中，扩大，冻存。 注：从平皿中挑取单克隆入９６孔板时，该板应在前一天 扑小鼠滋养层细胞。（３－４周ＢＡＬＢ／Ｃ雌性小鼠胸 腺，每只可扑四个９６孔板） 3：本实验重要试剂的配制 半固体培养基的配制 1） 配制2倍的IMDM，过滤除菌。 2） 称取甲基纤维素2.5克，放在100ml瓶中，加一个搅 拌子，加入50ml去离子水，（去离子水50ml不包含 甲基纤维素的体积）稍微搅拌（甲基纤维素为M0512， sigma 公司产品）。 3） 消毒，高压，15磅，20分钟。（高压后，甲基纤维素 并不立刻溶解，室温放置几小时后溶解） 4） 放置在4?，过夜，应为透明。 5） 加入2×IMDM 50ml （无菌操作）。配置好半固体培 养基含常规PS,ＬＧ。 6） ４?搅拌，２４小时左右。 杂交瘤细胞体外培养的上清液中，含有一定量的抗体， 为获取大量抗体，一要加大培养容器，大量收集上清， 二需对抗体进行浓缩。其程序为先接种一定密度的细 胞，培养24小时后更换新培养液一次，再持续培养 1-2周，期间细胞会不断死亡，而抗体含量可逐渐增 加。 另一种收集抗体的方法是用体内移殖法。取同系 （BABL/C）6-8周龄的雌性小鼠，腹腔内注射0.5ml 降值烷（Pristane）或石蜡油，一周后腹腔注射 100-1000万杂交瘤细胞。杂交瘤细胞将在腹腔中增殖 和产生腹水。腹水中抗体含量可达mg水平。然后可将腹水再移注入另几只小鼠腹腔中，以产生更多腹水。 细胞培养上清中抗体的含量低且混有大量的牛血清蛋 白，腹水中抗体含量虽然很高，但也含有小鼠本身的 蛋白，因而也要进行纯化和性质鉴定。 外周血液中单个核细胞（Peripheral mononuclear cell,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞，PMNC是免疫学实验最常用的细胞，也是进行T，B细胞分离纯化过 程的重要中间环节。因此，获得高纯度和活性的PMNC常常是许多免疫学实验的先决条件。 PMNC在其体积，形状和比重方面与外周血中其 它细胞有差异。红细胞和多核细胞的比重（1.092）比PMNC的比重（1.075-1.090）大。因此，利用一种比 重介于1.075-1.092之间的等渗溶液（分层液）作密 度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分 布，从而可使PMNC从血细胞中分离出来。本法淋巴细 胞的回收率约为80%-90%，淋巴细胞的纯度为90%。不同的动物所用细胞分离液的比重有所不同，如大鼠为 1.087g/ml,而小鼠和豚鼠为1.085g/ml。 （一）聚蔗糖-泛影葡胺分层液 比重1.077?0.001， 商品名：淋巴细胞分离液。 （三）抗凝剂 配制200U/ml注射用肝素溶液。 （四）台盼蓝染液 称取4克台盼蓝放置研钵中，加 少量双蒸水，反复研磨，加少量双蒸水至 100ml，离心（1500r/min,10min），吸出上层液， 即为4%水溶液，用前用生理盐水稀释成0.4%。 （一）抗凝血稀释 取静脉抗凝血，用 PH7.2-7.6Hanks溶液将抗凝血作1?1-1?2稀 释。 （二）取分层液4或15ml置入15或50ml灭菌离心管 内。 （三）用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm 处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分 层液上。稀释血液与分层液体积比例为2?1， 即8或30ml稀释血重叠于4或15ml分层液上。 （四）用水平离心机离心（12000r/min 20-25min）， 离心后PMNC悬浮于血浆与分层液的界面上，呈 白膜状。用毛细吸管轻插至白膜层，沿试管壁 周缘吸出界面层细胞，移入另一试管中。 （五）用5倍以上体积的Hanks液或PBS液（含1%牛 血清白蛋白，BSA）离心（1500r/min,5-10min） 洗涤三次。 （六）最后将细胞重悬于淋巴细胞培养基中。 （一）接通电源，将“Power”键打到“ON”的 位置。 （二）用钥匙将操作模式打到“Manual”的位置。 （三）按“STOP/OPEN”键打开机盖，检查驱动 轴和转头轴是否清洁。 （四）选择合适的转头，轻轻的垂直放到轴心支 撑物上轻轻压下（离心速度一定不能超过 转头梭镖限速。） （五）将严格配平好的离心管对称的放入转头 内并盖紧转头盖。 （六）关紧盖子并锁上，此时屏幕显示的 “LATCH”将消失。 （七）按“Temp?”切换键数秒，然后按下所需 温度数值，按“ENTER”键即可。同样按 “转速”切换键以及数字键和“ENTER” 键来选择所需转速，按“Time”切换键以 及数字键和“ENTER”键来选择所需时间， 按“Accel”切换键以及数字键和“ENTER” 键来选择所需加速转速，按“Brake”切 换键以及数字键和“ENTER”键来选择所 需减速转速。 （八）设定好所需温度，转速，时间，加速转速， 减速转速后，按“Start”键开始离心。 （九）离心结束后，用“T”型扳手将转头取下。 擦净离心机内胆及转头，关上机盖，切断 电源，并进行离心机使用后登记。 1，sephadexG100 凝胶柱及纯化检测系统（Grade Frac） 2,牛脑匀浆 3，硫酸链霉素（streptomycin Sulfate USPGrade Amresco 公司 上海生工分装） 4，1.2um ，0.22um微孔滤膜 5，平衡液 50mmol/L Tris HCL 0.5mmol/L EDTA PH7.5 0.22um过滤去离子水配制 5升平衡液配方： Tris 30.275g EDTA 0.9305g+0.1gNaOH?50ml水（完全溶解） 以4500ml水溶解 HCL 18ml, PH7.5 加水至5L 6，保存液， 平衡液+0.02%叠氮钠 7，新鲜制备的过滤去离子水（0.22um） 8，PBS 9，PEG20000 10，透析袋 11，DMEM-E(内皮专用培养基) 12，P50泵 1,拆卸凝胶柱（lamge泵气压排出凝胶约2000ml),以洗涤灵漂洗柱子，去离子水冲洗干净。凝胶最好加热 至沸以排出水中气体。 2，按装好柱子，与地面垂直，先予装500ml水，再灌注凝胶（出口封闭）。灌胶要匀速，不间断，柱子两端 膜片要排净空气，待胶全部进入柱子约5cm 后，装上上端接头，拧紧，否则易至柱子流干。 3，平衡液平衡约25小时，2ml/min(总体积?3升) 4，牛脑匀浆约80ml 10000rpm×40min 4?离心（IEC离心机），上清加入5%硫酸链霉素沉淀过夜，10000rpm×40min 4?离心（IEC离心机）。上清用1.2um和0.22um滤膜过滤。 5，柱子平衡好后上样（不超过100ml/次），注意加样 环正向安装。（液流方向与柱子字符方向相同）， 1-2ml/min洗脱。 6，约流出400-500ml液体后出峰，提前设置好检测系 统。 7，分段收集流出液 （1）上升段?弃(不收) （2）主峰平段前半段，收集（20ml/瓶）但不与其它段混和。（可能有毒性） （3）主峰平段后半段，分瓶收。 （4）主峰下降段，收集。 （5）第二峰（尾峰） （6）色素段?弃(不收) 8，收集的样品混和（主峰后半段+主峰下降段+第二峰（尾峰），测定蛋白含量。 9，煮透析袋（去离子水，煮沸10min），去离子水冲洗，装入样品，以PEG20000浓缩样品。最终浓度在5-10mg/ml。 10，1×PBS 2500ml透析6小时，换PBS 2次，最后用500ml DMEM-E透析6小时。 11，样品分装-80?保存。（半年）