EDTA-胰蛋白酶的配制

EDTA-胰蛋白酶的配制   1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。 2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。 3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。 4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。 5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。 6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。 7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。 8、储存液放在－20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏细胞。 9、消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm培养皿加入0.5ml足已，加入后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入37度培养箱消化。 10、注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。 11、胰酶37消化效果最好，低于37度也有消化能力，有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意，不可消化过久。