_谷氨酰基转肽酶_GGT_基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

_谷氨酰基转肽酶_GGT_基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究 ( ) 中国生物工程杂志 Ch ina B io techno logy, 2006 , 26 11 : 48,53 γΟ谷氨酰基转肽酶 ( GGT)基因工程菌的 构建及其发酵条件的初步研究 3 3 王 娜 张 洁 沈 微 唐雪明 诸葛健 ()江南大学工业微生物技术教育部重点实验室 无锡 214036 γ摘要 利用 PCR 技术以 B acillus subtilis SYU 20016 基因组 DNA 为模板 ,扩增出 1. 8 kb编码 Ο谷 氨酰基转肽酶的基因 gg t,将其连接到温控表达载体 pBV 220 ,得到重组载体 pBV 220 Οgg t,重组载体 在大肠杆菌 JM 109中得到表达 。 SD SΟPA GE显示融合表达产物的分子量大小为 65 kD a,同核 酸序列测定的推导值相符 。对含有 gg t的基因工程菌进行表达研究表明 : 发酵培养温度为 30 ?, )( γpH 为 7. 2 ,装液量为 20m l 250m l锥形瓶 的条件下 42 ?诱导 4 h后 ,重组菌的 Ο谷氨酰基转肽酶 ()酶活力达到 6U /m l。目前报道的非基因工程菌 枯草芽孢杆菌 NXΟ2 酶活最高仅为 3. 2U /m l。 γ发酵条件 质粒稳定性 关键词 茶氨酸 Ο谷氨酰基转肽酶 生物转化 中图分类号 Q81419 γ( ) Ο谷氨酰基转肽酶 GGT是谷胱甘肽代谢途径中 1 与 的一个关键酶 , 广泛分布于活体组织中 。它既可以催 γγ化 Ο谷氨酰基化合物上的 Ο谷氨酰基团转移至氨基 1. 1 材 料 γ酸 、多肽等受体上 ,也可以催化 Ο谷氨酰基化合物水解 1. 1. 1 菌株及质粒 B acillus subtilis SYU 20016、大肠 [ 1 , 2 ] γγ反应生成 Ο谷氨酸 。目前 ,已有多种细菌中的 Ο谷 杆菌 JM 109、pBV220 由本实验室保 藏 ; pMD18 ΟT 购自 氨酰基转肽酶被用作合成目的化合物的生物催化剂 , TaKaR a公司 。 γ其中应用最广的是谷氨酰胺和乙胺在 Ο谷氨酰基转肽 [ 3 ] 酶的催化作用下发生谷氨酰基反应得到茶氨酸 。茶 1. 1. 2 主 要 试 剂 和 工 具 酶 质 粒 小 量 抽 提 试 剂 盒 、 氨酸是茶叶中含有的一种特殊的氨基酸 , 它是茶叶鲜 () ; DNA 胶回 收 试 剂 盒 上 海 博 大 泰 克 公 司 工 具 酶 爽味的主要成分 , 并且可缓冲咖啡碱的苦味和茶多酚 ( ) TaKaR a公司 ;丙烯酰胺 ,甲叉双丙烯酰胺 , 广范围蛋 的苦涩味 ,因此可作为改善食品风味的添加剂 , 广泛应 ( ) 白质分子量 P rom ega公司 。 用于各种饮料和食品中 。此外 , 茶氨酸还具有明确的 ( ) 1. 1. 3 液体种子培养基 g /L 胰蛋白胨 10 ,酵母提 药理作用 ,可作为降血压和抗肿瘤的辅助药物和抵抗 取物 5 , 氯化钠 10 , pH7. 0。需要使用的 Amp r浓度为 [ 4 ] 致病微生物的新药 。目前 , 国内外报道的合成茶氨 μ100 g /m l。酸方法有化学合成法 , 但此法反应复杂 、副产物多 、提 ( ) 1. 1. 4 发酵培养基 g /L 胰蛋白胨 5 , 酵母提取物 取困难 、收率低 、安全性差 、能耗大 、污染大 。为了得到 5 ,葡萄糖 10 ,硫酸胺 1. 0 ,磷酸二氢钾 3. 0 ,磷酸氢二钠 能用于生物转化法生产茶氨酸的微生物 , 必须提高微 γ生物中 Ο谷氨酰基转肽酶的表达量 。本文构建了高效 5 17. 1 ,氯化钠 0. 5 , 1. 034 ×10 Pa高压灭菌 20m in。 γ表达 Ο谷氨酰基转肽酶的重组大肠杆菌 , 其转化生成 1. 2 方 法 茶氨酸的能力也相应地提高 。 1. 2. 1 引物设计与合成 根据 NCB I公布的枯草芽孢 γ杆菌 SYU 20016Ο谷氨酰基转肽酶基因序列设计引物 如下 : 上游引物 P1: 5 ′CCGGAA TTCA TGAAAA GAACGTG GAACGTCTG 3 ′ 下游引物 P2: 5 ′CGGGGA TCCGAA GA TA GACGTGC 收稿日期 : 2006 206 221 修回日期 : 2006 208 207 3 通讯作者 ,电子信箱 : jzhuge@ sohu. com A TTA GC 3 ′。 LB 平板 将单菌落分别挑至不含抗生素和含抗生素的 引物 P1、P2 的 5 ′端分别引入了 EcoR I、B am H I两个 上 , 37 ?培养 12 h,统计形成的菌落数 。 限制性酶切位点 。以上引物由上海生工生物工程技术 1. 2. 5 SD SΟPA GE 采用 5 %浓缩胶及 12 %分离胶的 [ 6 ] 服务有限公司合成 。 不连续垂直平板电泳 ,考马斯亮蓝 R Ο250 染色 。 1. 2. 2 gg t基因的克隆及测序 以枯草芽孢杆菌 SYU 1. 2. 6 发酵条件初步研究及酶活测定 具体步骤参 20016 总 DNA 为模板 ,直接 PCR 扩增 gg t基因的序列 。 照文献 [ 7 ]。 胶回收和纯化 PCR 扩增的 gg t与 pMD18 ΟT载体进行连 接 ,送上海华诺公司测序 。 2 结果与分析 )( 1. 2. 3 重组大肠杆菌 JM 109 pBV220 Οgg t的构建 将 目的片段从 pMD18 ΟT 上酶切消化 后 连接 到 表 达 载 体 2. 1 gg t基因的 PC R扩增及测序 pBV220 上 ,转化大肠杆菌 JM 109 ,涂布 LB 平板 。筛选 以提取的 B. subtilis SYU20016 总 DNA 为模板 , 利 () 得到重组质粒命名为 pBV220 Οgg t 如图 1 。 用上 述 合 成 的 相 应 引 物 P1、P2 , 用 Taq DNA 聚 合 酶 PCR 扩增含 有 B. subtilis SYU20016 gg t 自 身 信 号 肽编 码基因以及其结构基因 。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳 验证 ,结果表明扩增出的片段大小与预计的大小一致 。 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图 2。 图 1 重组表达载体 pBV220Οgg t的构建 F ig. 1 C on struc t ion of recom b inan t expre ss ion p la sm id pBV220Οgg t 图 2 gg t基因 PC R扩增片段 )( 1. 2. 4 重组大肠杆菌 JM 109 pBV220 Οgg t质粒稳定性 F ig. 2 PC R produc ts of gg t gen e [ 5 ]λ1: PCR p roducts of gg t gene; 2:DNA / Pst I M a rke r 的研究 接种单菌落到不含抗生素的 LB 培养基中 37 ?培养 12 h做种子 ,转种培养 24 h,每隔 24 h 按 1 %的 6SYU20016 gg t基因的测序结果显示 枯草芽孢杆菌 接种量重新接种培养 , 同时取样 , 以无菌水稀释至 10 如图 3 ,该基因的开放阅读框架编码 587 个氨基酸 , 1 到 倍 ,取 0. 1m l涂布于不含抗生素的平板上 ,用无菌牙签 90 个碱基编码信号肽序列 。 50 中国生物工程杂志Ch ina B io techno logy Vo l. 26 No. 11 2006 γ图 3 枯草芽孢杆菌 SY U20016 Ο谷氨酰基转肽酶编码基因 γF ig. 3 The open rea d in g fram e ofΟg lu tam y ltran spep t ida se γ含 完 整 Ο谷 氨 酰 基 转 肽 酶 基 因 的 重 组 质 粒 pBV220 Οgg t的构建和酶切鉴定 2. 2 EcoR I和 B am H I酶切 pMD18 ΟTΟgg t后电泳分离回 pM D 18 ΟTΟgg t的构建及酶切鉴定收基因片段 。回收产物在 T4 DNA 连接酶作用下与经 以 P1、P2 为引物的 PCR 反应产物经 PCR 产物纯 相同限制性内切酶酶切的载体 pBV220 连接 ,连接后转 化试剂盒纯化 ,产物和 pMD18 ΟT载体连接 ,连接产物转 化感受态细胞 。检出转化子培养后提取质粒用 EcoR I 化感受态 E. coli JM 109。在 LB 平板上检出转化子 , 培 和 B am H I酶切 ,酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果见 养后双酶切 ,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析 , 结果见 图 5。酶 切 产 物 与 预 期 的 片 段 一 致 , 证 实 重 组 质 粒 图 4。图谱分析表明 ,重组质粒经酶切后释放出大小约 pBV220 Οgg t构建成功 。 为 1800 bp 片段 ,证实重组质粒 pMD18 ΟTΟgg t构建成功 。 γ2. 3 含 完 整 Ο谷 氨 酰 基 转 肽 酶 基 因 的 重 组 质 粒 图 4 双酶切验证 pM D 18 ΟTΟgg t凝胶电泳 图 5 双酶切验证 pBV220 Οgg t凝胶电泳 F ig. 4 En zym e ana ly s is of recom b inan t p la sm id F ig. 5 En zym e ana ly s is of recom b inan t p la sm id λ1: pMD18 ΟTΟgg t / EcoR I + B am H I; 2:DNA / H in d III λ1:DNA /H ind III; 2: pBV220 Οgg t / EcoR I + B am H I 100 次仅有 83 %的菌株携带重组质粒基因工程菌 。 代 2. 4 重组菌质粒稳定性研究 ) ( 重组大肠杆菌 JM 109 pBV220 Οgg t在加压和不加 ) ( 实验表明工程菌 JM 109 pBV220 Οgg t在无选择压力下 压的情况下连续转种 5 次 , 统计在加和不加 Amp 的平 连续培养 60 代以上 , 质粒基本保持稳定 , 培养代数大 皿中的菌落数 ,结果见表 1 ,在传代 60 次质粒基本保持 大超过实际生产所需的时间 , 说明它在质粒稳定性方 稳定 ,随着转种次数的增加 , 存在质粒丢失的现象 , 传 面适合工业化生产的要求 。 表 1 重组菌大肠杆菌 JM 109( pBV220Οgg t) 的生长和酶活表达均为最佳 , 因此工程菌的诱导时机 选择在 OD为 1. 50 时 。 600 连续转种后在抗生素平板上的菌落数 Ta b le 1 The sta b il ity of E. co li JM 109 ( pBV220 Οgg t) p la sm id )( )( pBV220 Οgg t Amp + pBV220 Οgg t Amp Ο 传代次数 20 100 100 40 98 100 60 96 100 80 90 100 100 83 100 图 7 工程菌的生长曲线 2. 5 重组菌全细胞蛋白 SD SΟPA GE 电泳分析 F ig. 7 C urve s of ce ll grow th 将重组菌接种 LB 液体培养基 ,每小时取样测其可 见光下的吸光度 。当 OD> 017 以上 , 将培养基放入 600 42 ?摇床振荡培养 。每小时取样并用 SD SΟPA GE 分析 , 结果 表 明 gg t 基 因 可 以 在 E. coli JM 109 表 达 。 SD S Ο PA GE 凝胶分析见图 6。 图 8 诱导时间对酶活的影响 F ig. 8 Effec t of m u ta gen s is t im e on en zym e form a t ion 2. 6. 2 发酵温度对菌体生长和产酶的影响 在 25 ?, 30 ?, 37 ?接种培养 12 h,诱导后测其酶活 ,如图 9 结果 表明在 30 ?最有利于菌体生长 ,酶活达到 5. 76U /m l。 图 6 重组菌全细胞蛋白 SD SΟPA GE电泳分析 F ig. 6 SD SΟPA GE ana ly s is of pro te in s in who le ce lls ) ( 1、2、3、6、8、9、10: E. coli JM109 pBV220 Οgg tinduc tion fo r 4 h、6 h、5 h、 ( ) ( ) 4 h、3 h、2 h、1 h; 4、7: E. coli JM109 pBV220 con tro l; 5: p ro te in 图 9 温度对菌体生长和酶活的影响 ( )m a rke rs 97. 4 kD a, 66. 2 kD a, 42. 7 kD a, 31 kD a, 14. 4 kD a F ig. 9 Effec t of in it ia l tem pera ture of in cuba t ion on en zym e form a t ion γ2. 6 重组菌株 JM 109 表达重组 Ο谷氨酰基转肽酶发 酵条件的初步研究及酶活测定2. 6. 3 pH 对菌体生长和产酶的影响 各种微生物都 2. 6. 1 重组菌发酵的生长曲线与最适诱导时间的确 有最适生长的 pH 值范围 , 超出这个范围 , 菌体的生长 定 将重组菌株 JM 109 接种到发酵培 养 基 中 , 如 图 7 和目标蛋白的表达就会受到影响 。本文中调节培养基 所示 : 1 ,4 h为延迟期 , OD为 0. 50 左右 ; 5 ,10 h 为对 的初始 pH , 考 察 其 对菌 体 生 长 和 目标 蛋 白 表 达 的 影 600 数生长期 , OD从 0. 50 增加到 2 左右 ; 11 ,15 h 为稳定 响 ,结果如上图 10 ,结果表明在 pH7. 2 时最有利于菌体 600 期 , OD变化不大 , 15 h 以上为衰亡期 ,细胞开始自溶 , 600生长 ,酶活达到 5. 7U /m l。 OD下降 。当 菌 体 密 度 分 别 达 到 0. 50、1. 00、1. 50、 6002. 6. 4 不 同 接 种 量 对 菌 体 生 长 和 产 酶 的 影 响 在 250m l三角瓶中接入 1 % , 2 % , 3 % , 4 % , 5 % , 6 %种子液 2100、2. 50 时升温到 42 ?,诱导表达 4 h,如图 8 工程菌 52 中国生物工程杂志Ch ina B io techno logy Vo l. 26 No. 11 2006 酰基转肽酶只能在 20 ?保持良好活性 , 提高温度活性 则很快丧失 , 热稳定性很差 。诸多研究表明枯草芽孢 [ 8 ] γ杆菌来源的 Ο谷氨酰基转肽酶有良好的热稳定性 , γ本研究克隆了枯草芽孢杆菌来源的编码 Ο谷氨酰基转 肽酶的基因 gg t, 并利用 pBV220 温控表达系统成功地 γ构建了表达重组 Ο谷氨 酰 基 转 肽 酶的 大 肠 杆 菌 工程 菌 。重组菌株 JM 109 在培养温度为 30 ?, pH 为 7. 2 ,接 ) ( 种量为 2 %及装液量为 20m l 250m l锥形瓶 的发酵条 10 pH对菌体生长和酶活的影响 图 件下 , 42 ?诱导 4 小时后酶活达最大值为 6U /m l, 此后 F ig. 10 Effect of pH of incuba t ion on enzym e forma t ion 逐渐下降 ,对比野生型枯草芽孢杆菌 NXΟ2 产酶水平 3. 后培养 12 h,诱导后测其酶活 ,可知种子液 OD在 0. 5600 ,2. 4 之间时 ,随种子液浓度增高 ,发酵液的终止 OD600 先升后降 ,基因工程菌的酶活有一最佳值 。综合考虑 [ 9 ] γ2U /m l 可认为 Ο谷氨酰基转肽酶在大肠杆菌重组菌 选择接种量为 2 % 。 中获得高效表达 。如进一步实施高密度发酵及工艺优 2. 6. 5 不同装液量对菌体生长和产酶的影响 试验 了化 ,预计产酶水平将进一步获得提高 。 ( ) 不同的装液量 250m l锥形瓶 对工程菌生长和目标 蛋 白表达的影响 ,分别装入 10、20、30、40、50、60m l的液 体参考文献 培养基 , 30 ?、150 r /m in 振荡培养 12 h 后 , 42 ?高 温 诱 导 4 h 后测定酶活 , 结果见图 11。如图显示 20m l时 工[ 1 ] Suzuk i H , H a sh imo to W , Kum agai H. Glu ta th ione m etabo lism 程菌的表达量较其它装液量水平时高 , 当装液量大 于 in Escherich ia coli. Jou rna l of Mo lecu lar ca ta lysis B: Enzym a tic, 20m l时 , 随 着 装 液 量 增 加 工 程 菌 的 表 达 量 随 之 降 1999 , 6: 175 ,184 低 。这是因为随装液量的增加 , 发酵液与空气的接触 γ[ 2 ] 邹柏样 ,林浩 ,许廷森. 蓖麻蚕的 Ο谷氨酰基转肽酶的研究. 面积减小 ,发酵系统的供氧能力降低导致发酵液中溶 ( ) 昆虫学报 , 1986 , 29 1 : 16 ,23 氧减少从而阻碍细胞的生长和外源蛋白的表达 , 同时 Zou B X, L i X, Xu T S. A c ta En tomo logica Sin ica, 1986 , 29 引起底物的不完全氧化产生多种有机酸 , 如乙酸等也 ( ) 1 : 16 ,23 有可能影响外源蛋白的表达 。综合考虑装液量对菌体 [ 3 ] M k inen P L , M k inen K K. Gamm aΟGlu tam yltran sfera se from ??生长和目标蛋白表达的影响 , 选择发酵装液量为 20m l the ou te r ce ll enve lop e of Treponem a den tico la A TCC 35405. ( ) 250m l锥形瓶 ,酶活可达到 6U /m l。 ( ) Infec tion Imm un ity, 1997 , 65 2 : 685 ,691 [ 4 ] Kobaya sh i M , Moch izuk i M , Tera sh im a T, e t a l. H ypo ten sive effec t and ac tiva tion of dop am ine rgic neu ron s by thean ine in ra ts. In te rna tional Sympo sium of Tea Cu ltu reand H ea lth Sc ience ( ) C. Tokyo U n ive rsity, 1996: 164 ,169 [ 5 ] Kum agai H , Ech igo T, Suzuk i H , e t a l. Enzym a tic syn the sis of γΟglu tam yltyro sine m e thyl e ste r from L Οglu tam ine and L Οtyro sine γ m e thyl e ste r w ith Escherich ia coli K Ο 12 Ο glu tam yltran sp ep tidase. A gricu ltu ra l and B io logica l Chem istry, 1989 , 53: 1429 ,1430 [ 6 ] 郭尧君. 蛋 白 质 电 泳 实 验 技 术. 北 京 : 科 学 出 版 社 , 1999. 123 ,156 图 11 装液量对菌体生长和酶活的影响 Guo R J. The E lectrop ho re tic Techn ique of P ro te in. B e ijing: F ig. 11 Effec t of m ed ium vo lum e on en zym e form a t ion Sc ience P re ss, 1999. 123 ,156 γ[ 7 ] Suzuk i H , Kum aga i H , Toch iku ra T. ΟGlu tam yltran sp ep tida se from Escherich ia coli K Ο12: p u rification and p rop e rtie s. The 3 讨 论 Jou rna l of B io logica l Chem istry, 1986 , 168: 1325 ,1331 γ[ 8 ] 郭亮 ,沈微 ,诸葛健 ,等. 硕士学位 : 大肠杆菌 Ο谷氨酰 γ利用基因工程技术生产 Ο谷氨酰基转肽酶的研究 基转肽酶的研究. 无锡 : 江南大学 , 2004. 13 ,16 γ 在国内外开展较少 ,主要集中于克隆大肠杆菌来源的 Ο 谷氨酰基转肽酶的编码基因实施工程菌的构建 。然 Guo L , Shen V , Zhuge J , e t a l. M a rster D isse rtation of Sou the rn Yangtze U n ive rsity, 2004 , 13 ,16 γ而 ,随着研究的深入 ,人们发现大肠杆菌来源的 Ο谷氨 γ[ 9 ] 张新民 ,张鲁嘉 ,荀志金 ,等. Ο谷氨酰基转肽酶产生菌的筛 Zhang X M , Zhang L J , Xun ZH J , e t a l. Ch ine se Jow rna l of ( ) ( ) 选和培养条件的研究. 生物加工过程 , 2003 , 1 2 : 39 ,42 B iop roce ss Engineering, 2003 , 1 2 : 39 ,42 C on struc t ion Ferm en ta t ion of En g in eered S tra in an d γProper t ie s of Recom b inan tΟg lu tam y ltran spep t ida se WAN G N a ZHAN G J ie SH EN W e i TAN G XueΟm ing ZHU GeΟjian ( )The Key L abo ra to ry of Indu stria l B io techno logy M in istry of Education, W uxi 214036 , Ch ina γ ) ( A b stra c t The Οglu tam yltran sp ep tida se encod ing gene gg t from B acillus subtilis SYU 20016 wa s amp lified by PCR. The ggt gene wa s in se rted in pBV220 to yie ld the recom b inan t exp re ssion vec to r pBV220 Οgg t. O ve rΟexp re ssion of ggt in E. coli JM 109 wa s ach ieved w ith pBV220 Οgg t. SD S ΟPA GE ana lysis showed an ove rΟ exp re ssed recom b inan t p roduc t a t abou t 65 kD a, con sisten t w ith the mo lecu la r we igh t p red ic ted from gene sequence. The fe rm en t cond ition s of rΟglu tam yltran sp ep tida se we re a lso d iscu ssed. The op tim um temp e ra tu re and pH fo r the enzym e we re de te rm ined a s 30 ? and 7. 2 re sp ec tive ly. The cu ltu re s we re incuba ted a t 42 ? fo r 4 h w ith b ro th vo lum e 20m l /250m l fla sk and the yie ld of 6U /m l wa s ob ta ined, enzym e ac tivity of B. subtilis NX Ο2 wa s on ly 3. 2 U /m l. γKey word s ΟGlu tam yltran sp ep tida se Thean ine B io tran sfo rm a tion Fe rm en ta tion cond ition P la sm id stab ility