实验性肝纤维化动物模型的建立及中药花芝肝泰抗肝纤维化的作用研究

实验性肝纤维化动物模型的建立及中药花芝肝泰抗肝纤维化的作用研究 实验性肝纤维化动物模型的建立及中药花芝肝泰抗肝 纤维化的作用研究 分类号 密级公开UDC保密期限 硕士 学位论文 目 实 验性肝 纤维化动物模型的 建立 及中药 花芝肝泰抗肝纤维 化的作用研究 作者姓 名叶 霖财 指导教 师周文霞 研究员张永祥 研究员 培养单 位军事医学 科学院毒物药物研 究所 专业名 称药 理 学论文提 交日 期2010 年 5 月 25 日学位授 予单 位 中 国人民 解放军军事医学科 学院 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制 军 事 医 学 科 学 院研 究 生 学 位 论 文独 创 性 声 明 秉承军事 医学科 学 院严谨的 学风和 科 研作风, 本 人声明 所呈交的 学 位论文是 本人在 导 师指导下 独立进 行 的研究工 作和取 得 的研究成 果, 除 了文中特 别加以 标 注和致谢 之处外, 论文中不 包含其 他 人已经发 表或撰 写过的研究成果,也不包含为获得 军事医学科学院 或 其它 教 育 机 构 的 学位或证 而使 用 过的材料。 与我一 同工作的 同志对 本 研究所做 的任何 贡献均已 在论文 中 作了明确 的说明 并 表示了谢 意。 论文作者 签字:签字日期: 年 月 日 军 事 医 学 科 学 院研 究 生 学 位 论 文版 权 使 用 授 权 书 本学位论文作者完 全了解 军事医学科学院 有关保留、使用学位论 文的。特授权 军事医学科学院 可以 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编入有关 数据库 进 行检索, 可以 采用影 印、 缩印或扫 描等复 制手段保 存、 汇编以供 查阅和 借 阅。 同意将 本学位 论文的复 印件和 磁 盘送交国 家有关 部门和机 构。 (保密学 位论文 在 解密后适 用本授 权 书) 论文作者 签字: 签字日期:年 月 日 指导教师 签字: 签字日期:年 月 日 硕 士学位论文 实验性肝纤维化 动物 模型的建立及 中药 花芝肝泰抗肝纤维化的作用研究 研究生: 叶霖财 导 师: 周文霞 研究员张永祥 研究员 申 请 学 位: 医学硕 士 专 业: 药理学 年 级: 2007 级 军事医学科学院毒物药物研究所 培 养 单 位: 研究起止日期: 2007 年 9 月至 2010 年 5 月 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文目录 目录 缩略词表1 中文摘要2 英文摘要6 前 言10 材料和方法13 一、实验动物13 二、药物和试剂. 13 三、主要实验仪器 13 四、实验方法14 五、统计学处理. 16 实验结果 17 一、四氯化碳法肝纤维化模型的建立和优化. 17 1、不同剂量的四氯化碳诱导的 KM 小鼠肝纤维化模型的差异17 2、不同 CCl 给药途径 造模引起的肝纤维化成模率和死亡率的比较19 4 3、小鼠和大鼠形成的肝纤维化比较. 21 二、中药花芝肝泰(HZGT )对 CCl 所致 ICR 小鼠肝纤维化的影响 25 4 1、HZGT 对肝纤维化 小鼠体重增长的影响25 3、HZGT 对肝纤维化 小鼠 ALT 的影响28 4、HZGT 对肝纤维化 小鼠 HA 的影响. 29 5、HZGT 对肝纤维化 小鼠肝组织病理形态的影响(HE 染色) 30 6、HZGT 对肝纤维化 小鼠肝组织胶原沉积的影响(Masson 染色)31 7、HZGT 对肝纤维化 小鼠肝纤维化评分的影响 32 三、HZGT 对 CCl 所致 SD 大鼠肝纤维化的影响34 4 1、HZGT 对肝纤维化 大鼠体重增长的影响34 2、HZGT 对肝纤维化 大鼠血清 ALT 的影响 35 3、HZGT 对肝纤维化 大鼠血清 HA 的影响35 4、HZGT 对肝纤维化 大鼠血清 LN 的影响36 5、HZGT 对肝纤维化 大鼠肝组织病理形态的影响(HE 染色) 37 6、HZGT 对肝纤维化 大鼠肝组织胶原沉积的影响(Masson 染色)38 7、HZGT 对肝纤维化 大鼠肝纤维化病理评分的影响. 38 第 I 页军事医 学科 学院 硕士 学位 论文目录 四、HZGT 对 ConA 诱 导的 Balb/c 小鼠急性肝 损伤的影响. 39 五、HZGT 抗肝纤维化 的机制41 1、HZGT 对肝纤维化 小鼠血清 TGF- ?1 的影 响. 41 2、MTT 法观察 HZGT 含药血清对肝星状细胞系 LX-2 细胞增殖的影 响 41 3、高内涵成像分析系统观察 HZGT 含药血清 对 LX-2 存活率的影响 44 4、流式细胞术观察 HZGT 含药血清对 LX-2 细胞凋亡的影响 46 讨 论48 一、CCl 致肝纤维化模 型的建立 48 4 1、不同剂量的 CCl 形 成的肝纤维化的差异 48 4 2、不同造模途径造模形成的成模率和死亡率的差异 49 3、大鼠和小鼠肝纤维化的比较 49 二、HZGT 抗肝纤维化 疗效的观察 50 1、一般情况50 2、谷丙转氨酶(ALT ). 51 3、白蛋白(ALB )和 总蛋白(TP ). 51 4、透明质酸(HA ) 、 层连蛋白(LN )和病 理评分 52 三、HZGT 对 ConA 诱 导的急性肝的保护作用. 52 四、HZGT 抗肝纤维化 的可能机制 53 结 论55 参考文献 56 文献综述 59 研究论文 66 个人简历 75 致谢. 76 第 II 页军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 缩略 词表 缩 略词表 缩写 英文全名 中文全名 HZGT HuaZhiGanTai 花芝肝泰 FCS Fetal calf serum 胎牛血清 TGF- ?1 Transforming growth factor ?1 转化生长因子 ?1 CCl Carbon tetrachloride 四氯化碳 4 HSC Hepatic stellate cell 肝星状细胞 HA Hyaluronic acid 透明质酸 LN Laminin 层粘连蛋白 ALT Alanine Aminotransferase 丙氨酸氨基转移酶 MTT Methylthiazolyte-trazolium 甲基噻唑基四唑 ELISA Enzyme-Linked immunosrobent assay 酶联免疫吸附测定 TP Total protein 总蛋白 ALB Albumen 白蛋白 HE Hematoxylin-eosin 苏木精-伊红 RIA Radioimmunoassay 放射免疫分析 FZHY FuZhengHuaYu 扶正化瘀 FITC Fluoresein iso-thiocyanate 异硫氰酸荧光黄 AM Calcein 钙黄绿素 ConA Concanavalin A 伴刀豆蛋白 A Dex Dexamethasone 地塞米松 第 1 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文中 文摘 要 中文摘要 实验性肝纤维化模型的建立及中药花芝肝泰 抗肝纤维化作用的研究 ( 中文摘 要) 学 位申 请人姓 名: 叶霖财 学 号:071123 申 请学 位门类 和级 别:医 学硕 士 指 导教 师:张 永祥 研究员周 文霞 研究员 专 业名 称:药 理学 专 业代码 :100706 年 级:2007 级 培 养单 位:军 事医 学科学 院毒 物药物 研究 所 肝纤维化是机体对所有慢性肝脏疾病的一 种主动的损伤修复反应, 特点为 细 胞外基质的过度沉积, 发展到晚期表现为肝脏内纤维胶原 弥漫性分布, 原 有的规 则有序的小叶结构遭到破坏, 代之以再生结节, 即为肝硬化 。 肝硬化将导 致肝衰 竭、门脉高压、腹水等多种严重的并发症。全世界每年有 140 万人死于肝硬化, 肝硬化居全美死亡原因的第七位。 由于缺乏安全 有效的预防和治疗药物, 一旦发 展到肝硬化阶段, 唯一 有效的治疗手段就是肝移植。 因此, 在早期阶段, 即 肝纤 维化阶段进行干预就显得尤为重要。 抗肝纤维化的环节主要包括去除病因, 抗炎抗氧化, 抑制细胞外基质的产生 和促进细胞外基质的降解。 目前的 抗肝纤维化药物主要包括 γ-干扰素 (IFN- γ) 、 秋水仙碱、 青霉胺等 抑制胶原合成的药物, 但其 治疗效果并不理想。 中医理论认 为 肝纤维化的发病机制为多方面原因致肝络阻塞、 血瘀气滞, 以致肝脾失养, 升 降失司, 水湿停留, 腹内积块和腹水相继而成。 其辨证以脾虚或肾虚为本, 瘀血 或兼有气滞为标。 其治疗针对病因以扶正化瘀、 攻补兼施为主。 治法上多采用健 脾养肝补肾, 随症加用活血行气、 软坚化瘀、 利水之品 。 国内文献报道的 中医药 复方, 如扶正化瘀胶囊、 复方鳖甲软肝片等显示出了较好的疗效, 提示中 医药可 能 成为抗肝纤维化的优先选择。 花芝肝泰 (HZGT ) 胶 囊是由灵芝、 五味子等中药组成的复方制剂, 临床应 用治疗 肝硬化亦取得较好的疗效, 但其药理作用特点、 作用机理和药效物质基础 均不清楚 。因此,本课题 建立并优化了 CCl 诱导 肝纤维化模型和 ConA 诱导的 4 急性肝损伤模型, 观察 了花芝肝泰对模型的治疗作用 并对其作用机制进行 了初步 的研究 。 第 2 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文中 文摘 要 一、 CCl 致肝纤维化模型的 建立 4 肝纤维化动物模型按成因不同可分为化学性毒物诱导模型, 免疫性肝损伤模 型、胆汁淤积性肝纤维化模型等。其中化学毒物四氯化碳(carbon tetrachloride , CCl ) 诱导的肝纤维化 模型是使用最广泛的肝 纤维化模型, 具有和人类肝纤维化 4 相似的病理改变以及简便易行等特点。其原理是 CCl 在肝细胞微粒 体氧化 酶的 4 作用下生成三氯化碳自由基攻击肝细胞,引起肝细胞的坏死,反复 用 CCl 攻击 4 引起慢性炎症而导致肝纤维化的形成。 该模型的成模时间、 成模率、 死亡率文献 报导很不一致,根据 CCl 的给予量、给药途径、动物品系的改变而有所不同。 4 本研究主要对 CCl 的 剂量、给药途径和动物种属等造模条件对模型的成模 4 率和死亡率的影响进行了考察。 考察剂量时,CCl 设定 0.5、0.75、1.0 ml/kg 三个剂量, 采用腹腔注射 进行, 4 2 次/ 周, 共 8 周, 于第 9 周开始停止注射 CCl , 观察至第 12 周; 考察给药途径 4 时采用 相同剂量的 CCl 腹腔注射或灌胃,2 次/ 周,共 12 周;考察动物种属 时, 4 选择 ICR 小鼠和 SD 大 鼠, 相同剂量的 CCl 灌胃,2 次/ 周, 共 12 周。 观察动物 4 的体重、 血清 ALT、TP 、ALB 、HA 和生存曲 线随造模时间的变化, 采用 苏木精 - 伊红 和马松三色染色观察肝脏病理改变。 实验结果表明, 选用不同剂量的 CCl 腹腔注 射后, 在第 10 周, 0.5 ml/kg CCl 4 4 造模仅在汇管区形成纤维化, 0.75 ml/kg CCl 则形成了纤维间隔, 而 1 ml/kg CCl 4 4 造模形成 的纤维间隔将肝脏分割成块, 即 晚期肝纤维化 (advanced liver fibrosis ) , 提示合适的 CCl 剂量 为 1 ml/kg 。 灌胃和腹腔注射的 给药途径均能导致明显的肝 4 纤维化,其中灌胃 方 式造 模 死亡率在 10% 以下,而腹腔注射方式造模死亡率在 60% 以上,说明灌胃造模动物耐受性较好。大鼠和小鼠 应用 CCl 后,血清 ALT 4 均在第 4 周出现高峰, 之后稍微下降, 接着持续升高; 血清 HA 则在第 6 周开始 升高, 至 12 周实验结束时仍在继续升高。 造模 12 周时大鼠肝纤维化评分高于小 鼠, 说明大鼠模型的病理改变较 小鼠模型更严重。 以上结果提示大鼠和小鼠肝纤 维化发生发展过程中各项指标的变化趋势类似, 均可以用于抗肝纤维化药物的筛 选和评价。 二、 HZGT 疗效的观察 通过第一部分的研究, 确立了 CCl 肝纤维化 模型的造模方法为 1ml/kg CCl 4 4 灌胃给药。 在此基础上,观察了 HZGT 对小鼠模型的疗 效。结果显示,肝纤维化小鼠 体重的增长受到抑制, 血清 ALT 和 HA 明显升 高, 肝纤维化病理评分为为 2.7?1.2 。 第 3 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文中 文摘 要 HZGT 对肝纤维化小鼠体重增长的抑制没有明显改善,能在造模第 5 周和第 11 周显著降低肝纤维化小鼠血清 ALT,能在第 12 周显著降低其血清 HA ,减少肝 纤维化小鼠肝脏的纤维化病理评分,以上结果说明 HZGT 对 CCl 所 致的 小 鼠 肝 4 纤维化具有明显的治疗作用。 进而在大鼠模型上进一步观察了 HZGT 的疗 效。结果显示,肝纤维化大鼠 体重的增长受到明显的抑制, 血清 ALT 、HA 和 LN 明显升高, 肝纤 维化评分为 4.0?0.0。HZGT 能够促 进肝纤维化大鼠体重的增长,能在第 8 周和 第 10 周显著 降低其血清 ALT, 能在 第 10 周显著降低其血清 HA 和 LN , 减少其 肝脏胶原的沉 积和组织病理评分,以上结果说明 HZGT 对 CCl 所致大鼠肝纤维化具 有 明 显 的 4 治疗作用。 上述研究表明,HZGT 对 CCl 所诱导的肝纤 维化具有明显的治疗作用。由 4 于 我 国 的 肝 纤维 化 主 要是 由 乙 肝 病 毒引 起 的 免疫 性 肝 炎 迁 延不 愈 造 成的 ,ConA 诱导的急性肝损伤和病毒引起的爆发性肝炎有相似的特征。本研究进 一步考察 HZGT 对 ConA 诱导的 免疫性肝炎的作用。 结果显示高剂量的 HZGT 能够 显著地 降低模型小鼠血清 ALT ,提示 HZGT 对免疫 性肝炎具有保护作用。至于 HZGT 对 ConA 诱导的免疫性肝纤维化模型是否有治疗作用,尚需进一步研究。 三、 HZGT 作用机制的研究 目 前 的 研究 表明 ,HSC 处 于肝 纤 维化 的中 心环 节 , 是细 胞外 基 质的主 要 产 生细胞 ,TGF- ?1 是促 进 HSC 产生胶原最强的细胞因子。 因此本部分研究首先在整体动物模型上考察了 HZGT 对肝纤维化 小鼠血清 TGF- ?1 的作用。结果 显示,HZGT 能够剂量依赖性的降低 肝纤维化小鼠血清中 TGF- ?1 的含量。 以上结 果提示, HZGT 可能能 够影响 HSC 的增殖和胶原的产生。 进而在细胞水平上考察了 HZGT 对肝星形细胞 系 LX-2 细胞增殖、 形 态和凋 亡的影响。结果显示,HZGT 含药血清能够促 进 LX-2 细胞的生长,改变 LX-2 细胞的形态,降低 LX-2 细胞的存活率,增加 LX-2 细胞的凋亡。以上结果提示 TGF- ?1 ?HSC 通路是 HZGT 抗肝纤维化的途 径之一。 通过以上研究,本论文主要得到以下 : 1、 通过对 CCl 造模剂量 、造模途径及动物种属进行考察,确定 CCl 合适 4 4 的造模剂量为 1.0 ml/k , 造模途径宜选灌胃 方 式, 大鼠和小鼠模型 肝 纤维 化的各项指标变化趋势一致, 均可用于抗肝纤维化药物的筛选和评价。 2、 HZGT 能降低肝纤维化 小鼠血清 ALT、HA 值 及肝脏的胶原沉积和肝纤 第 4 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文中 文摘 要 维化病理评分,说明 HZGT 对 CCl 所致小鼠肝纤维化具有明显改善作 4 用。 3、 HZGT 能减轻 CCl 所 致肝纤维化大鼠体重的降低, 并能 降低肝纤维化 大 4 鼠血清 ALT、HA 和 LN 值及肝脏的胶原沉积和肝纤维化病理评分, 说明 对 CCl 所致大鼠肝纤 维化具有明显改善作用。 4 4、 HZGT 能降低 ConA 诱 导的肝损伤模型小鼠血清 ALT 活力,提示 HZGT 对免疫性肝炎具有保护作用。 5、 HZGT 能够剂量依赖性 地降 低肝纤维化小鼠血清 TGF- ?1 的含量,改 变 HSC 的活化状态,降 低 LX-2 细胞的存活率 ,促进 HSC 的凋亡, 提示 TGF- ?1-HSC 通路是 HZGT 抗肝纤维化的途径 之一。 关 键词 : 四氯化碳;刀 豆蛋白; 肝纤维化;花芝肝泰;肝星形细胞 第 5 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 英文 摘要 英文摘要 Establishment of liver fibrotic animal model induced by carbon tetrachloride and the observation of the effect of HZGT on liver fibrotic animal models M.M Candidate: Ye Lin-Cai Supervisor: Professor Zhang Yong-Xiang Professor Zhou Wen-Xia Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850 Abstract Hepatic fibrosis is one kind of the active wound-healing response of the organism body to repeated injury in all types of chronic liver disease with the typical feature of the excessive accumulation of extracellular matrix proteins. The advanced stage of hepatic fibrosis is called cirrhosis, which will cause serious complications including hepatic failure, portal hypertension, carcinoma and so on. There are more than 1.4 million people died of liver cirrhosis and its complications, the seventh leading cause of death in the United States. However, liver transplantation is the only effect treatment for cirrhosis. Thus it’s particularly important to interfere at the fibrotic stateThe anti-liver fibrotic treatment steps include curing of the primary injury, anti-inflammation and oxidation, inhibition of the production of ECM and degradation of ECM. The drugs in use are not effective for they are only able aimed at one or two steps mentioned above. The Traditional Chinese Medicine TCM has the function of balancing physiological status of organism body at different levels and helps body himself overcome the disease. TCM theory considers that the nature of liver fibrosis is ―deposition of qi and blood, accumulation of mass‖ and thus the treatment principle is ―promoting blood circulation, clearing away heat and toxic material‖. On this basis, compound prescriptions of TCM FuZhengHuaYu and BieJiaRuanGanPian showed effective therapy. TCM may be the first choice for anti-liver fibrosis第 6 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 英文 摘要 The chief constituent of HZGT is glossy ganoderma, which has kinds of pharmacological actions including hepatocyte protecting, anti-inflammation, increasing protein and nucleic acid synthesis, enhancing the immune system and delaying senility. Ganoderma Triterpene can lower serum ALT and AST of fibrotic rats, the expression of TGF- ?1 mRNA and MMP-2 of liver tissue. More important the test of HZGT on cirrhotic patients is positive. The study is to establish and optimize the liver fibrosis animal model induced by carbon tetrachloride and to establish the immune acute liver injury model induced by ConA, observe the therapy effect of Traditional Chinese Medcine HZGT on the animal model and superficially probe into the anti-fibrosis mechanisms of HZGT1. Establishment of liver fibrosis animal model induced by carbon tetrachloride Liver fibrotic animal models include chemical toxicant induced, bile duct ligation induced, immune complex induced experiment animal models. Chemical toxicant CCl induced animal model, easy and convenient to build, is the most widely 4 used animal model for its pathological changes is similar to human being. The mechanism is that CCl is metabolized by cytochrome P450 into ?CCl radicals , 4 3 which will attack hepatocyte and cause hepatocyte necrosis. That repeatedly damage hepatocyte with CCl leads to chronic inflammation which will finally induce fibrosis4 The fibrotic forming time, rate and the death rate of the model induced by CCl is 4 different when the dose or the administration of CCl or the animal species used is 4 different The optimizations of liver fibrotic animal model include doses of CCl , routes of 4 CCl administration and animal species. To find the suitable does of CCl for 4 4 modeling, we injected intraperitoneally KM mice with CCl at the dose of 0.5 、0.75、 4 1 ml/kg body weight, twice a week, totally 8 weeks. From the beginning of the 9th week we stopped CCl injection, but keep the research until the 12th week. To 4 optimize the routes of CCl administration, we administrated ICR mice CCl 4 4 intraperitoneally or intragastrically, twice a week, totally 12 weeks. To compare mice and rats for modeling, we administrated ICR mice or SD rats CCl intragastrically, 4 twice a week, totally 12 weeks. After 8 weeks CCl injection, on the 10th week there 4 were collagen fibers limited in portal areas of 0.5 ml/kg CCl group, fibrous septum 4 formed in 0.75 ml/kg CCl group and early cirrhosis in 1 ml/kg CCl group, which 4 4 suggested that the appropriate CCl dose was 1 ml/kg. Although intraperitoneal 4 第 7 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 英文 摘要 injection and intragastric administration both induced apparent fibrosis, but the death rate of intraperitoneal injection was up to 80%, which of intragastric administration was below 10%. It suggested that the better administration was intragastric administration. Trends of liver fibrotic indicators of rats and of mice were comparable and rats were more evident. To establish liver fibrosis induced by CCl , 1 ml/kg CCl 4 4 and intragastric administration should be adopted and which of animal species should be chosen depends on the purposes2. The observation of the therapy effect of HZGTBy the study of part ?, we determined that the CCl modeling conditions is that 4 the dose of CCl is 1ml/kg body weight and the way of administration is intragastric 4 administration First we observed the therapy effect of HZGT on the mice fibrotic model, of which body weight, TP, ALB, HA, ALT and liver histopathology were detectedAlthough HZGT has on effect on the body weight growth of the fibrotic mice, HZGT can notably lower serum ALT, HA and liver fibrotic score of the mice. It suggests that HZGT has the therapy effect on the mice model induced by CCl 4. To assure the conclusion of the anti-fibrotic effect of HZGT, we next observed the effect of HZGT on the rat fibrotic model, of which body weight, LN, HA, ALT and liver histopathology were detected. HZGT can promoted the body weight growth of the fibrotic rats, and lower serum ALT, HA, LN and liver fibrotic score of the ratsIt suggests that HZGT has the therapy effect on the rat model induced by CCl 4. As the inflammation caused by CCl is different from the inflammation caused 4 by hepatic B virus which creates most cases of liver injury in our country, we then observed the effect of HZGT on the liver injury induced by ConA, by which the inflammation caused is similar to the inflammation caused hepatic B virus. HZGT can lowered serum ALT caused by ConA. It suggests that HZGT can protect liver from immune injuryThe methods of ALT detection is Lai point terminal assay, of TP detection diuretic assay, of ALB detection bromocresol green assay, of HA and LN RIAHematoxylin-eosin staining is for the general observation of liver histopathology and masson staining is for the observation of collagen fibers deposition 3. The anti-fibrotic mechanisms of HZGT 第 8 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 英文 摘要 To probe into the anti-fibrotic mechanism of HZGT, serum TGF- β1 of the fibrotic mice was analyzed by ELISA, the proliferation of hepatic stellate cells cultured in DMEM containing HZGT serum was analyzed by MTT assay, the morpha of the same cells were analyzed by ImageXpressIsoCyte system and the apoptosis of which were analyzed by Flow cytometer. HZGT serum promoted the proliferation of HSC, changed the morpha of HSC and increased the apoptosis of HSC. It suggests that lowering serum TGF- β1 of the fibrotic mice and changing status of HSC is one of the anti-fibrotic mechanisms of HZGTIn conclusion, to establish liver fibrosis induced by CCl , 1 ml/kg CCl and 4 4 intragastric administration should be adopted and which animal species should be chosen depends on the purposes. HZGT has the effect of anti-liver fibrosis induced by CCl and can protect mice from liver injury by ConA. The effect of HZGT on TGF- β 4 1 to HSC pathway may be one of its anti-fibrotic mechanismsKey words: carbon tetrachloride; ConA; liver fibrosis; HZGT; hepatic stellate cell 第 9 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 前言 前 言 [1] 肝纤维化是机体对所有慢性肝脏疾病的一种主动的损伤修复反应 , 特点为 细胞外基质 (extracellular matrix, ECM )的过度沉积,发展到晚期表现为 肝脏内 纤维胶原弥漫性分布,原有的规则有序的小叶结 构遭到破坏,代之以再生结 节 , 称为肝硬化(图 1) 。 图 1. 肝纤维化示意图。 (J. Clin. Invest. 2005:1152:209 ?218.) [1] 肝硬化将导致肝衰竭、 门脉高压、 腹水、 肝癌 等多种严重的并发症 。 流行 病学 显示全球每年有接近 140 万的人死于肝硬化 , 美国每年有将近 2 万 5 千 [2,3] 人死于肝硬化,排名死 亡原因的第七位 。 由于以往欠发达地区肝 炎病毒(我 国有 1 亿的乙肝病毒携带 ) 的高度流行以及近年来饮酒引起的酒精性肝病和与肥 胖 密 切 相 关 的 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 脏 疾 病 (none alcoholic fatty liver disease , NAFLD )的急剧上升 ,肝纤维化/ 肝硬化已经是一个亟待解决的公共健康问题。 目前的抗肝纤维化策略包括除去病因, 抗炎抗氧化, 抑制细胞外基质的产生 [10] 和促进细胞外基质的降解 。 现将抗肝纤维化 药物根据 作用机制总结如表 1。从 [10] 表 1 中可以看出抗纤维化药物的疗效有限 ,可能由以下三点原因造成 的 :1) 肝纤维 化治疗 的疗 效精 确判定 困难, 肝组 织活 检仍然 是评估 的金 标准 。2 ) 动物 的肝纤维化与人类有较大差异 。 首先, 人类肝纤维化的形成过程极其漫长, 通常 需要数年甚至数十年的时间 , 形成的纤维间隔相互结缠, 吸收 难度大; 其次, 人 第 10 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 前言 类肝脏的再生能力远低于动物。 因而, 许多在 动物模型上有效的药物在人类自身 上却疗效不佳。3) 肝脏在物质代谢和能量代谢方面具有重要作用, 受人体神经、 内分泌、 免疫等 多个系统 的调节。 因而肝纤维化 也是一个复杂的过程, 涉及炎症 、 氧 化 应激 、HSC 的活化 及 胶原 的 沉积 和降 解 等 多 个环 节 。 目 前的 药物 只 针对 一 个或 2 个环节进行治疗, 治疗效果不明显。 表 1 目前正在研究 的抗纤 维化药物以及相关信 息 动物模型 优缺点以及 研发方 制剂 机制 临床试验中 的疗效 代表药物 上的疗效 向 [11] PDGF 的 拮抗 剂 抑制细 胞因 子; 抑制 有效 无临床 数据 可能可 以根 据PDGF 伊 马替 尼 HSC 的 活化 的亚型 进行 特异 的 拮抗 TGF- 的 拮抗 剂 抑制HSC 的活 化及 功能 数据较 多 无临床 数据 运用新 技术 手段 特 无 异的递 送药 物[12] 大 麻 素 受 体: CBR1 的拮 抑制 HSC 的激 活和 促 有效 部分药 物处 于治 疗 开发具 有外 周限 制 利莫那 班 抗剂/CBR2 的 激 动 剂 进 HSC 的 凋亡 NASH 的临 床? 期实 验 性的药 物[13] 5-HT2 的 拮抗 剂 抗 炎 和 抑 制 HSC 的 活 化 有效 处于早 期的 临床 试验 需要进 一步 的研 究 凯坦生 阶段 确认[14] RAS 的 拮抗 剂 抑制 HSC 的增 殖 有效 在 NASH 和慢 性乙 型 具 有 较 好 的 研 发 前 景 雷米普 利 肝炎中 疗效 一般[15] PPAR-激动 剂 抗炎和 抑 制 HSC 增殖 有效 NASH 治疗 有效 增 加 心 肌 梗 死 的 几 率 罗格列 酮[16] 抗氧化 剂 抗氧化 数据较 多 数据较 少 肝硬化 疗效 不佳 , 需 水飞蓟 素 联合治 疗[17] 秋水仙 碱抑制 HSC 的活 化 数据少 临床试 验中 疗效 不佳 可供体 外 筛 选的 阳 秋水仙 碱 性药物[18] NF- ?B 的抑制 剂 促进 HSC 的凋 亡 有效 无临床 数据 需要进 一步 的临 床 姜黄素 研究 [19] 半胱天 冬酶 抑制剂 抑制肝 细胞 凋亡 数据较 少 在慢性丙型肝炎中有效 缺乏特 异性 的靶 点 IDN-5566 中医学 理论 认为肝 纤维 化本质 是 “ 气血瘀 积、 症瘕聚 集 ” ,因而 其治 疗原则 是 “活 血化瘀 、清 热解 毒 ” 。 基于这 样的 理解 ,国内 文献报 道的 中医 药复方 ,如 [20,21] 扶正化瘀胶囊、 复方鳖 甲软肝片 等显示出了较好 的临床疗效 。 据报道扶正化 [21] 瘀胶囊于 2007 年已经在美国进行临床?期实验 。在国内多中心多 样本的临床 研究中,扶正化瘀胶囊可以使病人的肝纤维化评分 由 2.33 下降至 1.80。 中医药 可能将成为抗肝纤维化的优先选择。 花芝肝 泰HZGT 是 以 灵 芝 为 主 要 成 分 的 中药 。 灵芝属担子菌多孔菌科灵芝 属植物, 含有多糖类、 三萜类、 氨基酸类、 生物碱类、 核苷类、 甾醇类、 酶类 等 第 11 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文 前言 十大类 100 余种成分, 《本经》云: “主耳聋,利关节,保神,益精气,坚筋骨, 好颜色 ” ,具 有保 肝解 毒、抗 炎、增 强免 疫、 促进核 酸蛋 白 质合 成以 及延缓 衰老 [22] 等多种药理作用 , 经 试用于肝硬化病人取得了很好的疗效。 因此, 本课题建立 CCl 诱导的化学性肝纤 维化模型 和 ConA 诱导的急性肝损伤模型 。 在模型完善的 4 基础上, 观察 了花芝肝泰对实验性肝纤维化的疗效, 并对其作用机制进行初步的 研究。 第 12 页 军事医 学科 学院 硕士 学位 论文材料和 方法 材 料和方 法 一、实验动物 KM 小鼠, 清洁级, 雄性, 周龄 5~6 w , 体重 24~28 g ;Balb/c 小鼠, 清 洁级, 雄性,周龄 6~8 w ,体 重 18~22 g ;SD 大鼠,清洁级,雄性,周龄 4~5w ,体重 180~220 g ; 以上实验动 物由军事医学科学院实验动物中心提供。 体重 ICR 小鼠, 清洁级, 雄性, 周龄 5~6 w ,18~22 g ;C57/BL6 小鼠, 清洁 级, 雌 性, 周龄 5~6 w ,体重 14~18 g ;以 上实验动物由维通利华生物科技有限公司提供。 实验时饲养于温度 (20 ?2) ?和湿度(10%~70% )的动物饲 养室, 自由饮 水,光照时间随昼夜变化。 二、 药物和试剂 1、 药物 花芝肝泰(HZGT ) , 由 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所 提 供 ; 扶 正 化 瘀 (FZHY ) 购 自 上 海黄海 制 药 有限 公 司; 秋 水仙 碱 (Colchicine), 由军 事 医 学 科 学院危险品器材库提供 ;地塞米松注射液,购自天津金耀氨基酸有限公司。 2、 试剂 胎牛血清(fetal bovin serum , FBS ) ,GIBCO 公司;DMEM ,橄榄油(国 药集团化学 试剂公司 , 批号 F20080219),四 氯化碳 (北 京化学试 剂 公司,批号 10006492)