肝炎病毒抗原抗体检测的

肝炎病毒抗原抗体检测的 原理及检测试剂的选择原则 解放军第四七四医院 张和平 ELISA原理 HBsAg:双抗体夹心法 HBeAg :双抗体夹心法抗 HBs :双抗原夹心法 抗 Hbe:竞争 法 抗HBc: 竞争 法 1.在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 “夹心复合物”。 2.类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，如按常法测定，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect） 3.因为曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。   ●双抗体夹心法 两对半与美国Abbott试剂的比较 河北医学杂志（新） >> 2005年 第10期 总第10期(月刊) >> 论著 乙型肝炎病毒（HBV）标志物是国内实验室经常检测的项目。两对半试剂生产厂家较多，试剂质量良莠不齐。五家试剂公司分别为英科新创（厦门）科技有限公司、上海荣盛生物技术有限公司、北京万泰生物药业有限公司、珠海丽珠试剂有限公司、深圳月亮湾生物工程有限公司。各厂家质量有较大差异,为了提高乙肝两对半的检验质量，避免误诊、漏诊，以美国Abbott试剂作为参比试剂，对五家公司的两对半试剂的质量进行了对比、评价［4］。 两对半与美国Abbott试剂的比较 1.本次试验Abbott Axsym系统检测标本中HBsAg结果最高至210 S/CO，HBsAb结果最高至6000 mIU/mL，HBeAg最高至11600 PEIU/mL，以Abbott试剂测定标本的S/CO值为横坐标，五家试剂测定相应标本的OD值为纵坐标，分别绘出了HBsAg、HBsAb及HBeAg的浓度关系图，故在实际应用中的许多一步法试剂仍有HOOK效应存在。对于HBsAg,A、C、D三家试剂存在HOOK效应；对于HBsAb,A试剂存在HOOK效应；对于HBeAg，D试剂存在HOOK效应。此结果可供临床检验部门参考。 两对半与美国Abbott试剂的比较 1.五家试剂对于HBsAg,HBsAb,HBeAg项目的可检出检测下线分别为5.0 S/CO、17 mIU/mL、8.5 PEIU/mL, 2而Abbott试剂的阳性检测下线分别是1.0 S/CO、10 mIU/mL、0.28 PEIU/Ml,五家试剂在灵敏度上均低于Abbott试剂, 3.国外全自动分析仪系统检测灵敏度，速度，准确性均高于国内试剂。 4.各家ELISA试剂的各个检测项目特异性均较好，灵敏度相对较差，尤其是HBeAg，需要提高灵敏度［11］。结果表明除对于HBcAb试剂D的相对灵敏度较差外；其它的各家试剂的各个检测项目的相对灵敏度、相对特异性及总符合率均较好，基本上能满足临床及实验室的要求，此结果可供参考。 ●双抗体夹心法 4.因此在使用一步法试剂 测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。 6.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。 双抗体夹心法 7.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。 8. 双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项指标。 9.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，应分别包被固相和制备酶结合物。例如 HBsAg的a决定簇，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型， 双抗原夹心法测抗体 1.反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。 2. 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。 3.乙肝标志物中抗 HBs的检测常采用本法。 4.本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 竞争法测抗体 1.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。 2.标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 3. 抗HBc.抗 Hbe: 　ELISA一般采用此法。 试剂盒选择 ◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产 品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。 ◎灵敏度： 1）为试剂检出被检物质的最低量的能力； 2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好） ，取决于包被物的全面性。 3) 每一批新试剂应作实验对照 血液检测HBsAg ELISA阳性结果确证分析 中华医学实践杂志 > 2004年第3卷第5期 >   1.以卫生部临床检验中心的1ng/ml HBsAg质控血清，用正常血清稀释随标本检测，国产试剂检测灵敏度为0.5ng/ml，进口试剂为0.10ng/ml。 2.在122例ELISA阳性样本中,其中国产试剂检出88例，检出率为72.1%，进口试剂全部检出，两者差异有显著性（X 2 =17.1，P<0.05）。在进口试剂单阳性结果40例中，经确认34例为阳性，国产试剂未检出，国产试剂存在一定的漏检率。主要由于0.5～0.1ng/ml的HBV不能检出的原因。在33例ELISA阳性确证实验阴性样本中，进口试剂占6例，为18.2%，国产试剂27例，占71.8%，进口试剂假阳性率明显比国产试剂低。 3.其中进口试剂S/CO值分布以>3为大多数，占91.7%，表 明进口试剂灵敏度高，不易漏检。国产试剂S/CO值分布以1～10之间为多数占65.5%，而1～0.7区间有11例，占9%，表明试剂灵敏度欠佳。 试剂盒选择 ◎特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性。 ◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围 试剂盒选择 ◎稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指 标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37℃每稳定一天相当于4-10℃保存一个半月。 ◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，）定量试验结果计算也 应简单。 试剂盒选择 ◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。 ◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。 中国药品生物制品检定所四种试剂盒质量标准： 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）： 外观：液体组份无沉淀或絮状物，冻干组份呈白色或棕色疏松体。 溶解时间：冻干组分溶解时间≤3分钟。 阴性参考品符合率（20份）：阴性参考品符合率（-/-）为20/20 阳性参考符合率(3份)：阳性参考品符合率（+/+）为3/3 Adr亚型最低检出量（ng/ml）：≤0.5 Adw亚型最低检出量（ng/ml）：≤1.0 Ay亚型最低检出量（ng/ml）≤1.0 精密性（n=10）：CV≤15% (adr、adw、ayr、ayw4个亚型，) 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）： 外观：液体组份无沉淀或絮状物，冻干组份呈白色或棕色疏松体。 溶解时间：冻干组分溶解时间≤3分钟。 阴性参考品符合率（30份）： ≥29/30 阳性参考符合率(30份)：≥29/30 精密性（n=10）：CV≤15% 灵敏度：要求L1、L2阳性，L3可阳性或阴性，L4阴性。   人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体酶联免疫诊断试剂盒（双抗原夹心法）： 外观：液体组份无沉淀或絮状物。 阴性参考品符合率（20份）：≥18/20 阳性参考符合率：HIV-1型参考品18份 阳性参考品符合率18/18其中Ap11、Ap12≥2.0且阿Ap12≥Ap11） HIV-2 型参考品2份 阳性参考符合率2/2 最低检出限参考品符合率（6份）：至少检出阳性反应3份（≥3/6） 且基质血清阴性反应 精密性（n=10）：CV≤15% 梅毒螺旋抗体酶联免疫诊断试剂盒（双抗原夹心法）： 外观：液体组份无沉淀或絮状物 阳性参考品符合率（10份）：10/10 阴性参考符合率(20份)：20/20 精密性（n=10）：CV≤15% 试剂盒评价 ◎1.试剂评价需要有权威的血清考核盘（ Panel）进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取得，每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选 择。 ◎2.根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量水平，按照质量选择灵敏度高的或特异性高的试剂； ◎3.通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等判断试剂的 优劣； 试剂盒评价 ◎4.参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果，这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医院，反映了试剂在某一地区的使用情况 ◎5.根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。 试剂盒评价 ◎ 5.为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。 ◎6.移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内； 试剂盒评价 ◎7.水浴箱   经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差； ◎8.洗板机   每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞； ◎9.酶标仪   经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 酶标仪校正程序 灵敏度准确度检测 ①灵敏度：精确配制6 ug/ml重铬酸钾（干燥）溶液（0.05 mo1／L硫酸溶解），加入200 ul重铬酸钾溶液于小孔杯中，以0.05 mo1／L硫酸溶液作空白，于450 nm（参比波长650 nm）测定，其吸光度应≥ 0.01 A。 ②准确度：准确配制：1mmo/L对硝基苯酚（提纯品）水溶液，然后以10 mmo1／L氢氧化钠溶液25 倍稀释之，加入200 ul稀释液于小孔杯中，以10 mmo1／L NaOH溶液作空白，于405 nm（参比波长650 nm）检测，其吸光度应在0.4 A（0.395～0.408 A）左右。 经过多次在不同型号仪器间进行反复测定，结果发现该标准物溶液在450nm波长处有一较为恒定的测定值， 方法与原理 滤光片波长精度检查及其峰值测定 用高精度紫外可见分光光度计（波长精度±0.3 nm）对不同波长的滤光片进行光谱扫描，检测值与标定值之差即为滤光片波长精度，其差值越接近于零且峰值越大表示滤光片的质量越好，波长精度越高。 将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外-可见分光光度计（波长精度±0.3nm）于 可见光区对每个滤光片进行扫描。 滤光片波长精度检查理论基础： 酶标仪的滤光片质量好坏，直接影响仪器的灵敏度高低，而滤光片的质量又是以其波长精度及其峰值指标来衡量的，因此滤光片波长精度及峰值是衡量酶标仪的重要参数之一，这在厂家的仪器说明书中虽未曾提及，但在仪器的实际使用过程中，发现对滤光片波长精度和峰值进行检查是重要的也是必要的，通过检查可以发现滤光片的波长标定值与实测值的符合程度，可以发现滤光片的质量是否符合要求。 通道差与孔间差检测： (1).通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体， 将其（内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右）置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，1于490nm处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。 (2).孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条（8条共96孔 ）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065～ 0.070 A）先后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm处检测。 通道差与孔间差检测理论解释 为了提高酶标仪的检测速度，根据 96孔酶标板的规格特点，目前大多数厂家的中、高档酶标仪均采用8通道的检测器（部分中、低档酶标仪目前仍采用单通）．因而它们每个通道的检测能力是不尽相同的，它是仪器内部的固有误差，与所测溶液浓度成正相关（不同检测器对不同浓度溶液的响应能力不同），所以通道差是衡量酶标仪性能良好与否的重要指标之一；其衡量指标用极差表示，这与厂家推荐的指标是一致的；极差值越接近于零，通道差越小，说明同一样品于不同通道检测结果的一致性越好。 通道差与孔间差检测理论解释 采用的评价指标（士1.96 s）也是有利于结果校正的。另外，在设计孔间差测量的操作方法上，将200 ul甲基橙溶液吸光度调至 0.065～0.070 A，是充分考虑到加样器的误差（上海求精公司，200 ul，士2％CV），其目的是使加样误差控制在仪器的分辨率（0.01 A）以下，这样也就避免了孔间差结果不因加样误差而导致假性增高。 零点飘移（稳定性观察） 方法:取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200ul蒸溜水并调零，于490nm处每隔30分钟 测一次，观察各个通道4小时内吸光度的变化。 测量原理：零点飘移是评价仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关，它间接地反映了仪器内部检测系统在单位时间内处于工作状态下的稳定性及仪器的机械性能情况（连续进板、检测、退出），故它是评估仪器内部电路系统、光学系统（检测器）及机械系统良好与否的指标。 精密度评价 方法:每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同浓度的甲基橙溶解，蒸溜水调零，于490nm作双份平行测定 ，每日测二次（上下午各一次），连续测定20天。分别计算其批内精密度，日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。 线性测定： 线性测定：用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm平行测8次，取其均值。计算其回归方程，相关系数及标准 估计误差s，并用±1.96s表示样品测量的误差范围. 双波长测定评价：取一分甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶血液（测定 波长为490nm，校正波长为585nm），先后于8个通道检测，每个通道测3次，比较各组之间是否具有统计学差异，以考察 双波长消除干扰组分的效果。 双波长评价 取同一厂、同一批号酶标板条（每个通道 2条共24孔）每孔加入200 ul甲基橙溶液（吸光度调至0.065～0.070 A）先后于8个通道分别采用单波长（490 nm）和双波长（测定波长490 nm、参比波长630／ 650 nm）进行检测，计算单波长和双波长测定结果的均值、离散度，比较各组之间是否具有统计学差异以考察双波长清除干扰因素的效果。 全军医用光学计量站 酶标仪技术要求指标 稳定度A:±1.0% 波长准确度nm: ±3 吸光度重复性%：2% 吸光度准确性A: ±0.09 线性误差（0-1.5 A ） ： ±10% 测试速度（分）：≤1 谢 谢