2005淫羊藿的炮制机理[1]

摘要： 研究假说：中药经炮制后可提高活性成分的吸收，从而达到增加药效的目的。 本研究选择淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai.），利用ADME/Tox平台研究单体活性成分Epimedin A、Epimedin B、Epimedin C、Icariin 、Baohuside Ⅰ的吸收、代谢机理与动力学及淫羊藿炮制品的提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用。从中药活性成分吸收与代谢的角度阐明淫羊藿的炮制机理。 中药炮制的科学研究起步较晚，对减毒或增效的物质基础及炮制机理研究较少。目前对中药炮制机理的阐述只是停留在该过程的两端即化学成分的变化和药理药效层面，而对阐明炮制机理的重要环节——炮制前后有效成分的吸收、代谢研究不够深入，本课拟从更深层次上阐明中药炮制机理，同时为制定合理的炮制工艺和质量标准提高科学依据，为中药现代化、国际化做出更大贡献。 (一)立项依据与研究内容 1.项目的立项依据 1.1中药炮制是我国人民在数千年的医疗实践中不断总结、改进、发展形成的一套传统制药技术，和中药复方一起构成了祖国医药学的两大鲜明特色。 目前对中药炮制机理研究所采用的方法有：①应用化学方法进行研究[1]：中药的疗效，是由于其所含的化学成分决定的。中药经过炮制后，所含的化学成分的性质和含量会产生不同程度的改变，因而药理作用、临床疗效也会发生相应变化，可见，研究中药炮制前后化学成分性质和含量的变化是中药炮制机理研究的重要内容，该方法在一定程度上能阐明炮制原理，而且能指导炮制工艺的设计和改进，也是制订质量标准的重要依据。蔡宝昌等[2，3]测定了马钱子不同炮制品中生物碱和马钱子苷的含量，表明炮制后生物碱和马钱子苷的含量均降低；蔡宝昌等[4]从炮制前后的马钱子中提取鉴定了16个生物碱，其中异马钱子碱等为新生物碱；②应用实验药理学方法进行研究[1]：中药的临床研究由于受到复方用药和患者对象的制约，一般不易进行，加上很多中药化学成分研究还缺乏与药效的紧密联系，或者尚属空白，因此实验药理学的研究也是揭示中药炮制机理的方法之一。应用实验药理学的方法研究中药炮制，主要选用适合中医病理模型的方法和指标来进行，或选用已有的药理方法和指标来进行。在化学成分不清的情况下，通过实验药理学的方法来研究炮制前后的生物活性变化，也可达到控制炮制质量和指导工艺改革的目的。如：蔡宝昌等[2]的研究表明马钱子不同炮制品的急性毒性较生品均有所降低；马聘等[5]的研究表明草乌用新方法炮制后具有对心律影响小、毒性低等优点。 总之，目前中药炮制机理研究主要通过炮制前后药物有效成分含量或溶出量增加、与治疗无关的成分的减少和药材中所含酶的活力的破坏以保留有效成分等化学成分变化的角度和炮制前后药理毒理的对比等角度来阐述。 1.2从目前对中药炮制机理的研究现状可看出：对炮制机理阐述的过程中缺少一架沟通中药炮制前后化学成分变化与药理药效变化之间关系的桥梁——中药活性成分ADME/Tox系统的研究；中药活性成分吸收与代谢是中药产生生物效应的重要环节，更是彻底阐述中药炮制机理的最佳切入点。本研究拟利用中药活性成分细胞层次的ADME/Tox系统研究中药淫羊藿的入药品种之一淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai.）的炮制机理。 1.3 为了充分发挥药物的疗效，必须增加有效成分在体内的溶出度、释放度和吸收率，以提高生物利用度。然而药物在体内药效的发挥很大程度上取决于血药浓度的高低，而药物在生物体内的吸收、代谢与血药浓度的高低有密切关系。目前，口服给药在各种给药途径中占有主导地位，因此，药物的ADME/Tox系统研究是生物药剂学研究的重点之一，ADME/Tox 系统区别于以前的吸收、分布、代谢、排泄的串级研究不同在于：①提取与筛选同时进行，可以全面和预见药物提取过程中成分及在体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性各方面的问题；②用细胞（特别是人源细胞）进行，采用高通量技术[6]。国外对药物ADME/Tox系统（吸收、分布、代谢、排泄、毒理、药物－药物之间相互作用）方面的研究非常重视，从而多种研究药物肠道吸收的生物学方法应运而生。ADME/Tox系统研究中最著名的吸收模型——Caco-2模型被美国FDA认为是预测人体药物吸收的行之有效的方法，Caco-2模型辅以大鼠在体肠灌流模型可以从在体和细胞两方面全面阐述药物的ADME过程及其变化。 (1)Caco-2细胞模型[7] Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞。由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结,其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似, Caco-2细胞模型可作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型。其优点为:省时、可测定药物的细胞摄取及跨膜转运、Caco-2细胞内有药物代谢酶,可在代谢状况下测定药物的跨膜转运、Caco-2细胞与小肠上皮细胞近似、Caco-2细胞易于培养且生命力强、Caco-2细胞来源是人结肠癌细胞,同源性好，可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。 ①Caco-2细胞模型的基本特点 Caco-2细胞系结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞,含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系,与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化(反分化)不同, Caco-2细胞在传统的细胞培养条件下,生长在多孔的可渗透的聚酯(Polycarbonate)膜上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞,形成连续的单层(monolayer)[8]。培育约10ｄ后,单层的跨膜电阻约为2600Ω·cm2,细胞密度约为0.9×106细胞·cm2,此时Caco-2细胞单层对漏出标志物如聚乙二醇(Mr4000)或甘露醇是不渗透的,这种性质可以维持恒定约20ｄ,由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞,因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验[9,10]。 ②Caco-2细胞模型的药物转运机理 在Caco-2细胞模型中,药物的转运过程为:药物分子从Caco-2单细胞层的顶侧肠腔侧(ＡＰ侧)跨过Caco-2单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧(ＢＬ侧)。药物跨过肠上皮有4条途径:①被动转运;②胞旁转运;③载体介导转运;④胞饮。 (2)在体肠灌流模型 特点：保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损,同时也保证了血液及淋巴液的供应,提高了生物活性。在该模型中还可测定肠道代谢物。该法既可从肠腔取样,又可从血液中取样。虽然这些研究常在麻醉的小动物上进行,但借助肠插管,非麻醉的实验动物及人体的灌流研究亦可进行[11]。在体肠道灌流不仅提供了较高的组织活性,而且提供了额外的取样部位。已经建立了鼠肠原位灌流实验取得的药物肠道渗透率同人体研究中口服给予药物溶液后吸收的药物量之间的关系。 Hu M.等学者采用Coca-2和肠灌流模型等方法对黄酮和类黄酮成分的吸收与代谢进行了研究[12～19]；研究结果表明[19～23]：黄酮苷类化合物在肠道中降解成苷元再吸收，而淫羊藿苷主要是以它的次级鼠李糖苷形式吸收。类黄酮的吸收与代谢途径可归纳为 Fig 1。 1.4淫羊藿为传统补肾中药，在民间沿用已有千年历史，具补肾阳，强筋骨，祛风湿功效。临床常用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛等证。淫羊藿中含多种黄酮类成分，目前研究证明[24]：淫羊藿总黄酮为淫羊藿主要活性成分。淫羊藿总黄酮在心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗骨质疏松、抗衰老、抗肿瘤等[25]方面取得较大的进展。临床常见的淫羊藿炮制品有淫羊藿、羊脂炙淫羊藿、盐淫羊藿和酒淫羊藿等。 目前对淫羊藿的炮制研究主要有以下两个方面： (1)炮制前后黄酮类等化学成分的变化 陈惠玲等[26]采用紫外分光光度法测定粗毛淫羊藿生品及4种不同炮制品中总黄酮的含量，总黄酮含量由高到低顺序为：生品>清炒品>酒炙品>盐炙品>羊脂炙品。 (2)炮制前后药理、药效的变化 淫羊藿炮制后对心血管、中枢神经系统等方面药理、药效较生品有显著提高，故历代临床用药均以炮制品为主。 淫羊藿炮制品中总黄酮含量低于生品,而临床用药历代均以炮制品为主，且认为淫羊藿炮制后药效较生品有显著提高。因此从淫羊藿炮制前后化学成分变化的角度并不能解释其炮制机理；对炮制后其药效的增强也缺乏令人信服的阐述，即只知其然而不知其所以然。 淫羊藿炮制品中总黄酮含量低于生品,而临床用药历代均以炮制品为主，即其炮制品药效较生品有显著提高，因此我们的假说为：淫羊藿的炮制机理是：淫羊藿炮制后能被机体吸收的黄酮含量相对增加；中药经过炮制，可提高活性成分的吸收，从而达到增强其药效之目的。即该研究试图从活性成分ADME/Tox层次阐明淫羊藿的炮制机理，以期填补国内目前中药炮制机理研究领域的一个空白。 中药炮制的科学研究起步较晚，许多炮制经验，只知道炮制后可以降低毒性、可以增强疗效，但对减毒或增效的物质基础及炮制机理却长期处于无知状态，即只知其然而不知其所以然。目前对中药炮制机理的阐述只是停留在该过程的两端即化学成分的变化和药理药效的变化，而对阐明炮制机理的关键环节——炮制前后中药活性成分的吸收等研究不够深入，本课题拟从更深层次上阐明中药炮制机理，同时为制定合理的炮制工艺和质量标准提供科学依据，为中药现代化、国际化做出更大贡献。 参 考 文 献 1.叶定江主编.中药炮制学[M].上海:上海科学技术出版社,1996:8 2.蔡宝昌等.马钱子不同炮制品中总生物碱的测定及急性毒性试验的比较.中国中药杂志，1994,19(10):598 3.蔡宝昌等.炮制对马钱子中马钱子甙的影响.中国中药杂志,1994,19(6):346 4.蔡宝昌等.马钱子中16个生物碱类化合物13CNMR谱的数据分析.药学学报,1994,29(1):44 5.马聘,蔡宝昌,陈龙.草乌几种炮制品的毒性实验比较.中国中药杂志,1994,19(4):216 6. 王夔主编.中药研究现代方法学[M].北京：化学工业出版社，2004：6 7.杨海涛，王广基，Caco-2单层细胞模型基其在药学中的应用，药学学报，2000,35(10),797-800. 8.AllenRH,robeitAC,PhilipSB.Caco-2 cell monolayers as model or drug transport across the intertinal mucosa[J].Pharm Res ,1990,7(9):902. 9.Hidalgo Ij Raub Tj,Borchardt RT.Characterization of the human colon carcinoma cell line(Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability[J].Gast 10.GanLL,DhirenRT,Applications of the Caco-2 model in the design and development of orally actived drugs;elucidation of biochemical and physical barriers posed by the intestinal epithelium[J].Adv Drug Deliv Rev,1997,23(1):77. 11.Lenernas H Ahrenstedt O.Hallgren R,et al .Reginal jejunal perfusion,a new in vivo approach to study oral drug absorption in man[J].Pharm res,1992,9:1234. 12.Hu M,Chen J,Lin H.Disposition of Flavonoids via Recycling:Mechanistic Studies of Disposition of Apigenininthe Caco-2 Cell Culture Model.J.Pharmacol.Exp.Therap, 307(1)314-21,2003b 13.Hu M,Sinko,PJ,DeMeere,ALJ,Johnson,DA and Amidon,GL Membrane permeability parameters for some amino acids and β-lactam antibiotics:appliction of the boundary layer approach.J. Theor.Biol.,131,107-114,1998 14.Hu M,Roland,K,Ge,L,Chen,J,Tyle,P,and Roy,S.Determination of Absorption Characteristics of AG337,A Noel Thymidylate Synthase Inhibitor,Using a Perfused Rat Intestinal Model.J.Pharm.Sci.,87,886-890,1998 15.Hu M,Chen Z,Zheng L.Functional and molecular characterization of rat intestinal prolidase.Pediat.Res.,e-pub ahead of print publication,2003a 16.Li,Y.and Hu,M.Absorption and Metabolism of Flavonoids in the Caco-2 Cell Culture Model and a Perused Rat Intestinal Model.Drug Metab.Disp.30:370-377,2002 17.Liu,Y.Liu Y,Dai,Y,Xun,L and Hu M.Enteric Dispostion and Recycling of Flavonodis and Ginkgo Flavonodis.J Altern.Complement.Med.,9(5):631-640,2003 18.CrespiCL,Penman,BW and Hu M.The Development of Caco-2 Cells Expressing High Levels of cDNA-Derived Cytochrome P4503A4.Pharm.Res.13,1635-1641,1996. 19.Chen J,Lin H,Hu M.Metabolism of Flavonoids via Enteric Recycling:Role of Intestinal Dispostion.J.Pharmacol.Expt.304:1228-1235,2003 20.Abe K,Nakada Y,Suziki A,et 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H Baohuside Ⅰ(宝藿苷) (1) 淫羊藿黄酮类成分的HPLC和LC-MS的分析方法：建立Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ的HPLC分析方法，并用LC-MS，LC-MS-MS等分析手段对标准提取物中其他成分进行峰归属。 (2) HPLC测定淫羊藿不同炮制品标准提取物中Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ五个单体活性成分的含量变化。 (3) 利用ADME/Tox系统研究Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ五个单体活性成分的吸收与代谢机理、动力学、毒理学、药物－药物之间相互作用 (4) 研究比较生品与羊脂炙炮制品的标准品提取物中，上述5个黄酮单体活性成分（Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ）的吸收与代谢机理及其相互作用。 *拟解决的关键问题： 淫羊藿经炮制后总黄酮含量降低，但是历代临床用药却以炮制品为主，本研究拟采用ADME/Tox系统研究淫羊藿炮制品中黄酮类成分的吸收与代谢，试图从中药活性成分吸收的角度阐述炮制的机理：炮制可提高中药活性成分的吸收。 3.拟采取的研究方案及可行性分析 *技术路线 淫羊藿药材品种鉴定 炮制品制备(盐炙、酒炙、羊脂炙) HPLC测定炮制品中5个黄酮单体（Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ）的含量 LC-MS、LC-MS-MS等技术对标准提取物中其它黄酮类成分进行成分归属 5个黄酮单体（同上）的吸收与代谢动力学 淫羊藿生品与羊脂炙品标准提取物中5个黄酮单体的ADME/Tox系统研究 *研究方法及实验手段： (1)HPLC、LC-MS分析方法： 条件：色谱柱：C18柱（4.6×150，5um）；流动相：A(0.5%冰醋酸溶液),B(乙腈)；B相浓度梯度洗脱：0～20min (25%B)，20～45min(25%～35%B)；流速:1.0 ml/ min ；检测波长:272 nm；进样量:20ul。 (2)Caco－2细胞模型研究黄酮成分的吸收代谢： Fig2 Caco-2 model 细胞培养：Caco-2细胞种植于transwell上，种植密度为（100,000细胞/cm2），培养基为含有10％小牛血清的DMEM溶液，细胞在37℃的CO2培养箱中培养，隔一天更换培养液，单层细胞于19～21天左右分化形成，即可用于试验。 实验过程：37℃下用PH7.4的HBSS将单层细胞冲洗3次，测量跨膜电阻，弃去跨膜电阻值小于500ohms×cm2的细胞。细胞在缓冲液中孵育1h后吸走孵化介质，在细胞层的绒毛面（AP）加入含有待试药物的溶液，随后发生一系列的跨膜转运。AP侧底液于开始和结束时取样两份，BL侧底液每隔30min中取样400ul，并补充同体积空白底液保持BL侧体积恒定。在每份样品中加入50ul溶液（乙腈:冰醋酸＝94:6，其中含作为内标物的100uM睾丸酮），混合物离心(13,000rpm)8分钟，上清液用HPLC法分析。 (3)大鼠在体单向肠灌注模型研究黄酮成分的吸收代谢： 方法：麻醉动物,打开腹腔, 靠近十二指肠处插入胆汁导管，分别在the duodenum；the jejunum；the terminal ileum；the colon两端插管, 实验时用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿，用等渗生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液,用一恒速泵灌流肠腔, 泵的流速为0.191ml/min。每隔30min收集出口管中灌流液，灌注前收集一次胆汁样品（约0.4ml），随后每隔30min收集一份，灌注后测量小肠的长度。出口管中药物浓度用HPLC检测。胆汁样品用缓冲液按（1:10）比例稀释，加入葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶，反应6h，释放出苷元，供HPLC检测。 (4)微粒体： 肠微粒体制备：大鼠禁食24h，不禁水，注射苯巴比妥钠（200mg/kg）处死，切开8只鼠的小肠部分，按照以下的方法分离：小肠部分（始端10cm作为 十二指肠；末端10cm作为回肠；其余的作为空肠）；大肠部分（盲肠弃去，结肠用于微粒体制备）。集中八只鼠肠的相同部分，每段用冰冷的溶液（冰盐水加二硫基丁二醇1mM）清洗。纵向切开各部分肠，洗去排泄物，放置于冰冷溶液A〔8 mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM KCl, 96 mM NaCl, 27 mM sodium citrate, and 0.04 mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)〕中,用溶液A清洗两次，将刮出的粘膜细胞放进溶液B(8mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM EDTA, and 0.5 mM dithiothreitol and 0.04 mg/ml PMSF)中，收集细胞，在900g转速离心5分钟，用12ml均匀的缓冲液洗两次（PH7.4mM KH2PO4,250mM 蔗糖，1mM EDTA，0.04mg/mlPMSF）将细胞重新悬浮于2ml上述缓冲液中，用电动匀浆机使均匀化，经15min低速离心（15,000g，4℃），上清液用巴氏吸管吸走，脂肪层和碎片弃去。微粒体再经高速离心（60min，4℃，90,000g，）将所得微粒体悬浮于250mM 蔗糖溶液中，分装于微量离心管中，－80℃下保存备用。 肝微粒体制备：切除麻醉成年雄性Sprague－Dawley大鼠新鲜肝脏，放于冰冷盐溶液中，称重，切碎，在冰冷缓冲溶液（50mM PH7.4磷酸钾缓冲液，250mM蔗糖，1mM EDTA）中用电动匀浆机搅匀，离心（77,000g，15min，4℃），收集上清液，离心（18,500g，15min，4℃）弃去沉淀，上清液再离心1h（85,600g，4℃），产生微粒体。将所得微粒体悬浮于250mM 蔗糖溶液中，分装于小瓶中（0.5ml/瓶），－80℃下保存备用。以小牛血清蛋白作为标准用BioRad分析方法检测蛋白浓度。 用微粒体检测UDP-葡萄糖醛酸转移酶活性：步骤如下：（1）微粒体混合物（最终浓度大约0.05mg蛋白质/ml），MgCl2（0.88mM）,葡糖二酸单内酯（4.4mM）；丙甲素（0.022mg/ml）；含不同浓度底物的50mM磷酸钾缓冲液（PH7.4）；最后加入3.5mM尿甙二磷酸葡萄糖醛酸(2)混合物在37℃孵化10～30min；（3）加入170ul溶液(乙腈:冰醋酸＝94:6，其中含作为内标物的100uM睾丸酮)终止反应。 (5)数据计算与处理 ①Caco- 2细胞模型表观通透系数 Ｐapp=ΔＱ/(Δｔ·Ａ·Ｃ0) ΔＱ为Δt内的转运量，Ａ为膜面积，Ｃ0为初始给药浓度。吸收良好的药物的表观渗透系数Ｐapp >10-6cｍ.s-1；吸收为1%～100%的药物表观渗透系数Ｐapp为0 .1×10-6～1×10-6cｍ.s-1；而吸收差的药物(即吸收<1%)的Ｐapp <10-7cｍ.s-1。 ②大鼠肠灌注模型中黄酮类物质的吸收公式如下： Mab=Qτ(CAin - CAout) Q：流速（ml/min）；τ：取样间隔时间 30min；CAin 、C Aout 为进口管和出口管中苷元的浓度； ③通过小肠排泄中的量计算公式如下： Mgut=QτCMout CMout为肠腔出口代谢物浓度 ④通过胆汁排泄的变化量： Mbile=VCMbile CMbile为胆汁中代谢物的浓度；V为每30min收集的胆汁体积； ⑤吸收百分比和代谢百分比以下式计算： 吸收百分比= Mab Mtotal 代谢百分比= Mgut Mtotal Mtotal是30min内灌注的药物总量 用方差分析或t检验来处理数据。P＝0.05或p<0.05 *关键技术： (1)HPLC、LC-MS、LC-MS-MS分析技术 (2) ADME/Tox系统研究 4.本项目的特色与创新之处 (1)从中药活性成分吸收的角度阐述中药炮制机理。 (2)应用了ADME/Tox系统研究黄酮单体成分Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ的吸收、代谢机理与动力学及淫羊藿炮制品标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用。 5.年度研究及预期研究结果 *研究计划 (1)2006年1月～2006年3月 淫羊藿药材的品种与鉴定及炮制品制备 (2)2006年4月～2006年6月 淫羊藿炮制品Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ的含量变化，并用LC-MS，LC-MS-MS等分析手段对标准提取物中其他成分进行峰归属 (3)2006年7月～2006年9月 单体Epimedin A的吸收、代谢机理及HPLC、LC-MS分析其代谢产物 (4)2006年10月～2006年12月 单体Epimedin B的吸收、代谢机理研究及HPLC、LC-MS分析其代谢产物 (5)2007年1月～2007年3月 单体Epimedin C的吸收、代谢机理研究及HPLC、LC-MS分析其代谢产物 (6)2007年4月～2007年6月 单体Icariin的吸收、代谢机理研究及HPLC、LC-MS分析其代谢产物 (7)2007年7月～2007年9月 单体BaohusideⅠ的吸收、代谢机理研究及HPLC、LC-MS分析其代谢产物 (8)2007年10月～2008年9月 淫羊藿生品与羊毛脂炙品标准提取物中Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、BaohusideⅠ吸收代谢机理研究 (9)2008年10月～2008年12月 研究资料的汇总、整理等工作，进行评估和技术鉴定。 *项目研究预期成果及效益 (1)从中药活性成分吸收的角度阐明炮制的机理 (2)在国内中文核心期刊上发表2篇以上，在SCI源学术期刊上录用2篇或以上。 (3)完成淫羊藿药材与炮制品的HPLC及LC－MS分析；中药淫羊藿中单体活性成分的吸收和代谢机理；利用ADME/Tox系统阐明淫羊藿炮制品中5个黄酮活性成分的吸收代谢机理及其相互作用，提交一套完整的研究资料。 (二)研究基础与工作条件 1.工作基础 (1)淫羊藿药材质量控制 ①药材中水份的测定 取供试品2～5g,平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定,打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好,移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。 表1 药材水份含量测定结果 样品号 未干燥样品重量（g） 干燥后样品减失重量（g） 含水量（％） 1 2 ②药材中总黄酮含量的测定 对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液。 供试品溶液的制备：精密量取淫羊藿苷测定项下供试品溶液0.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 测定法：分别取供试品溶液和对照品溶液，以试剂为空白，照分光光度法(附录ⅤA），在270nm波长处测定吸收度，计算，即得。 表2 药材中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 平均值（％） 1 2 3 ③药材中淫羊藿苷含量的测定 色谱条件：Zorbax C18 柱（4.6*250mm，5um）；乙腈：水＝（30：70）为流动相；检测波长为270nm；流速：1.0ml/min。 标准品制备：称取淫羊藿苷标准品适量，用甲醇配制成0.1mg/ml的标准品溶液。 样品制备：精密称取淫羊藿炮制品约0.2g，精密称定，于50ml居塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，密塞，超声处理1小时，称定，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定。 表3 药材中淫羊藿苷的含量测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 平均值（％） 1 2 3 ④药材指纹图谱的建立 条件：色谱柱：C18柱（4.6×150，5um）；流动相：A(0.5%冰醋酸溶液),B(乙腈)；B相浓度梯度洗脱：0～20min (25%B)，20～45min(25%～35%B)；流速:1.0 ml/ min ；检测波长:272 nm；进样量:20ul。样品分析色谱图见Fig 3。 Fig 3 HPLC chromatographs of Epimedium (2)淫羊藿炮制研究 ①酒制淫羊藿的炮制研究 不同辅料用量对炮制品水份的影响 表4 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同辅料用量对炮制品中总黄酮含量的影响 表5 不同辅料用量炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同辅料用量对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表6 不同辅料用量炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同炮制时间对炮制品中含水量的影响 表7 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 1.3min 2.3min 3.3min 5.16 不同炮制时间对炮制品中总黄酮含量的影响 表8 不同炮制时间炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 1.3min 2.3min 3.3min 不同炮制时间对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表9 不同炮制时间炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 1.3min 2.3min 3.3min ②盐炙炮制研究 不同辅料用量对盐炙炮制品水份的影响 表10 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同辅料用量对炮制品中总黄酮含量的影响 表11 不同辅料用量炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同辅料用量对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表12 不同辅料用量炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同炮制时间对炮制品中含水量的影响 表13 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 1.3min 2.3min 3.3min 不同炮制时间对炮制品中总黄酮含量的影响 表14 不同炮制时间炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 1.3min 2.3min 3.3min 不同炮制时间对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表15 不同炮制时间炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 1.3min 2.3min 3.3min ③羊脂炙炮制实验研究 不同用量对炮制品水份的影响 表16 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同用量对炮制品中总黄酮含量的影响 表17 不同辅料用量炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同用量对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表18 不同辅料用量炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 10％辅料 20％辅料 30％辅料 不同炮制时间对炮制品中含水量的影响 表19 药材水份含量测定结果 样品号 含水量（％） 1.0min 1.3min 1.5min 不同炮制时间对炮制品中总黄酮含量的影响 表20 不同炮制时间炮制品中总黄酮含量的测定 样品号 总黄酮含量（％） 1.0min 1.3min 1.5min 不同炮制时间对炮制品中淫羊藿苷含量的影响 表21 不同炮制时间炮制品中淫羊藿苷含量的测定 样品号 淫羊藿苷含量（％） 1.0min 1.3min 1.5min 由上述实验结果可以看出，淫羊藿经过炮制后其总黄酮含量和淫羊藿苷含量都有不同程度的下降。临床上常以羊油炙淫羊藿入药，经实验表明，羊油炙淫羊藿中总黄酮含量以及淫羊藿苷含量较其他炮制品种的黄酮和淫羊藿苷含量高。 （3）淫羊藿苷在体肠灌流研究 申请人已经就淫羊藿中活性成分之一——淫羊藿苷的吸收和代谢作了初步实验，精密称取淫羊藿苷加入Kreb-Ringers溶液定容，制成对照品溶液。精密量取淫羊藿苷对照品液10ml，(用含酚红20μg/mlKreb-Ringers溶液)定容，作为灌注液。灌注实验中每半小时收集一份样品。对灌注液以及接收液进行紫外测定其中由于水份吸收引起的酚红浓度的变化。另外，对灌注液和接收液用液相检测其中成分的变化。 实验结果表明淫羊藿苷在大鼠体内很快被吸收，并产生相应的代谢产物（Fig 7中保留时间为2min和21min的成分）。 Fig 4 HPLC chromatographs of Icariin Fig 5 HPLC chromatographs of blank perfused solution Fig 6 HPLC chromatographs of perfused solution Fig 7 HPLC chromatographs of efflux solution （4）植物药成分比较复杂,吸收代谢的研究报道较少，申请人在美国访问期间研究了植物药Red Clover标准提取物的吸收与代谢，方法可行。（Red Clover 标准提取物的HPLC分析图谱见Fig 4） Fig 8 HPLC chromatographs of Red Clover (formononetin and biochanin A) and their Phase II metabolites. Compounds were labeled as internal standard (IS, testosterone, 46.1 min), formononetin-M or formononetin-7-O-glucuronic acid (13.0 min), biochanin A-M2 or biochanin A-5-O-glucuronic acid (14.3 min), biochanin A-M1 or biochanin A-7-O-glucuronic acid (22.1 min), daidzein (23.8 min), genistein (32.2 min), formononetin (40.5 min), and biochanin A (51.5 min). Panel A shows the HPLC chromatograms of a perfusate solution before it enters the perfused segment (solid) or after it exits the perfused segment (dashed line). Panel B shows the HPLC chromatograms of a diluted bile before (dashed line) or after (solid line) treatment of glucuronidases+sulfatases. Panel C shows chromatograms of a microsomal reaction mix before (solid line) or after (dashed line) glucuronidation reaction. The HPLC condition is specified in the “Materials and Methods.”