生物气溶胶核酸检测技术分析

生物气溶胶核酸检测技术分析 ｏｌ．３７Ｎｏ．２Ｖ １６　舰船电子工程 ｈｉＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｎｉｎｅｅｒｉｎＳ　ｐｇｇ　总第２７２期 ２０１７年第２期 生物气溶胶核酸检测技术分析 韩丽丽　齐秀丽　徐　莉 ）（防化学院　北京　１０２２０５ ＊ 真菌、病毒等微生物粒子构成，有时又被称为微生物气溶胶。生物气溶胶作为绝大多摘　要　生物气溶胶由一些细菌、 数生物战剂的施放形式，经常在生物恐怖袭击中扮演重要角色。论文在介绍生物气溶胶定义、来源、特点的基础上，深入分析生物气溶胶核酸检测技术原理、优缺点、装备应用及国内外研究现状，并针对我国生物气溶胶检测技术的研究提出自己的几点建议。 关键词　生物气溶胶；核酸检测技术；建议 ：／中图分类号　Ｘ８３１　　ＤＯＩ１０．３９６９．ｉｓｓｎ．１６７２７３０．２０１７．０２．００５９－ｊ ＡｎａｌｓｉｓｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＡｅｒｏｓｏｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏ　　　　ｙｇｇｙ ＬｉｌｉＩＸｉｕｌｉＬｉＨＡＮ　　Ｑ　　ＸＵ　 （，）ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｆｅｎｃｅＢｅｉｉｎ０２２０５　　　　１ｊｇ ，Ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｌｏｉｃａｌａｅｒｏｓｏｌｉｓｃｏｍｏｓｅｄｏｆｂａｃｔｅｒｉａｆｕｎｉａｎｄｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｉｓｓｏｍｅｔｉｍｅｓｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏａｓｍｉｃｒｏｂｉａｌａｅｒｏ　Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　－ｇｐｇ，ｆｏｒｍｏｆｍｏｓｔｂｉｏｌｏｉｃａｌｗａｒｆａｒｅａｅｎｔｓｂｉｏａｅｒｏｓｏｌｏｆｔｅｎｌａｓａｎｉｍｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｂｉｏｌｏｉｃａｌｔｅｒｒｏｒｉｓｔｏｌ．Ａｓａｒｅｌｅａｓｉｎｓ　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｇｐｙｐｇｇ　 ，，，ａｔｔａｃｋｓ．Ｔｈｉｓａｅｒｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｔｈｅｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅａｎｄｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｂｉｏａｅｒｏｓｏｌｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ　　　　　　　　　　　　　ｐｐ，ｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｂｉｏｌｏｉｃａｌａｅｒｏｓｏｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏ．Ｉｔａｌｓｏｍａｋｅｓａｄｅｅａｎａｌｓｉｓｏｎｔｈｅｒｉｎｃｉｌｅｓｓｔｒｅｎｔｈｓａｎｄｗｅａｋｎｅｓ　　　　　　　　　　　　　　－ｙｐｐｇｇｇｙｐ　，，ｓｅｓｔｈｅｅｍｌｏｍｅｎｔｏｆｅｕｉｍｅｎｔａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｅａｃｈｔｅｃｈｎｏｌｏａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄａｎｄｕｔｆｏｒｗａｒｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐｐｙｑｐｇｙ　ｓｕｅｓｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏａｅｒｏｓｏｌａｒｅｕｔｆｏｒｗａｒｄ．　　　　　　　　ｇｇｐ ，，ｔｅｃｈｎｉｕｅｓｕｅｓｔｉｏｎｓＫｅＷｏｒｄｓｉｏｌｏｉｃａｌａｅｒｏｓｏｌｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｔｅｓｔｉｎ　ｂ　　　ｑｇｇｇｇｙ　　ＣｌａｓｓＮｕｍｂｅｒ８３１　　Ｘ １　引言 当前，国际战略环境错综复杂，战争的非对称性和作战手段的多样性更加明显，尽管从１９７２年，以来已有１禁止生物武器公约》６２个国家签署了《但是不少国家仍在致力于生物武器的研制，造成了一定的生物威胁。２美国炭疽粉末邮件００１年的“事件”引起了全球范围内的恐慌，标志着生物恐怖袭击己经成为现实威胁。生物气溶胶作为绝大多数生物战剂的施放形式，经常在生物恐怖袭击中扮演重要角色。如何对生物气溶胶实施快速、准确的检测，已经成为防生物战和反生物恐怖袭击的重要课题。对此，世界各国都越来越重视对生物气溶胶检测技术的研究，以最大限度地杜绝生物恐怖袭击 ＊ 的发生。 ２　生物气溶胶概述 ２．１　生物气溶胶的定义 具有生命的气溶胶粒子（包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子）和活性粒子（花粉、孢子等）以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒被统称为生物气溶胶。由于空气微生物是大气生物气溶胶的主要组成部分，所以生物气溶胶有时又被称为微生物气溶胶，依其种类可划分为细菌气溶胶、真菌气溶胶、病毒气溶胶等。 ２　生物气溶胶的来源２． 由于空气中缺少微生物直接可利用的养料，不能繁殖生长，因此空气中无固有的微生物群系，其 修回日期：收稿日期：２０１６年８月３日，２０１６年９月１７日 作者简介：韩丽丽，女，硕士，讲师，研究方向：生物防护与安全。齐秀丽，女，硕士，副教授，研究方向：生物防护与安全。徐莉，女，博士，副教授，研究方向：生物防护与安全。 ０１７年第２期２舰船电子工程 １７　 均由暂时悬浮于空气中的尘埃携带着的微生物所构成，所以大气生物气溶胶主要来源于土壤、灰尘、江河湖海、动物、植物及人类本身。具有较大意义的生物气溶胶的粒径范围是０．１ｍ～２０．０ｍ。生μμ物气溶胶种类繁多，分布广泛，涉及很多领域，与人类社会的关系较为密切。 ３　生物气溶胶的特点２． 体积小且无色无味，从而使得以此为施放形式的生物战剂隐蔽性较强；易渗透，使其对应的生物战剂难于防护，尤其是难于进行物理防护；易扩散，直接喷洒的生物气溶胶可随风飘到较远地区，杀伤范围可达数百至数千平方公里。 方法对ＰｉＣＲ技术检测结果的影响。Ｓｏｕｃｈｉ人为地－把炭疽直接加入到空气微生物采样液中，然后用结果１个炭疽细胞在１小时ＣＲ技术进行了分析，Ｐ 内就可检出。Ｙａｄａｖ应用ＰＣＲ技术直接检测工作环境中导致职业病的分枝杆菌和假单孢菌的气溶胶总数，用于对气溶胶暴露的危险评估。ＺｅｎＣＲ技ｇ用Ｐ术检测了农场环境空气中ｗａｌｌｅｎｉａｓｅｂｉ并与培养计数方法进行了比较，发现ＰＣＲ技术比培养计数法更灵敏，可以检测出更小浓度的气溶胶。由于生物气溶胶沉降在物体表面可再次形成气溶胶造成二次污染，ｕｔｔｎｅｒ研究了生物气溶胶的二次污染对ＰＣＲ技Ｂ术的影响以及利用ＰＣＲ技术检测物体表面消毒前后污染菌的数量以评价消毒措施是否有效。快速、灵敏度高并可对初ＣＲ技术具有特异、Ｐ 始生物气溶胶浓度进行定量分析，在生物气溶胶的检测中具有很好的应用前景。 如今，如荧光定量ＣＲ技术及其改进技术（Ｐ多重Ｐ已广泛应用于致病微ＣＲ技术、ＣＲ技术等）Ｐ 生物的检测与鉴定领域。随着自动化与集成化程度的提高，基于ＰＣＲ技术的生物战剂检测装备已开始应用于战场。例如，ｄａｈ公司研制的耐用型病Ｉ原菌检测装备能够在３肉毒０ｍｉｎ内实现对炭疽菌、梭菌、布鲁菌属、沙门菌属和李斯特菌属等的检测，目前已有４０多个国家的军队配备了该装备。３　基因芯片技术３． 基因芯片技术的基本原理是利用核酸探针捕获靶基因来识别生物体的种类。它通过平面微加工技术将大量的核酸探针有规律地排列固定于硅片或玻片等固相支持物上，构成二维探针阵列，用于捕获预先经过荧光物质或核素标记的靶基因，再通过激光共聚焦显微等技术对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测与分析。该技术结合了微电子、微机械、化学合成、光学、计算机等一系列现代科学前沿技术，利用构建的基因芯片及其表面微流分析系统，快速、准确地完成对微生物的鉴定。Ｃ００５年，Ｚｈｏｕ等根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＳＡＲＳｏＶ基２－因组序列，设计了靶向ＳＣＡＲＳｏＶ保守序列的寡－核苷酸探针，并将这些探针整合到７０－ｍｅｒ基因芯片上，实现了对ＳＣＡＲＳｏＶ的早期检测。通过对－临床样品的检测结果表明，基于基因芯片的有效，对ＳＣＡＲＳｏＶ早期检测方法特异、ＡＲＳ患Ｓ－ 者的检测敏感性约为９１％。２００９年，Ｆｅｌｄｅｒ等建立了基于基因芯片技术检测环境样品中炭疽菌的方法，其构建的基因芯片包含靶向炭疽菌质粒毒力基因ｒ蜡样芽孢杆菌 和Ｂ以及各亚型炭疽菌、ｏｐ ３　核酸检测技术 微生物基因组内均含有特异的、有别于其他种或属的核酸序列，这些特征序列相当于微生物的。利用核酸检测技术检测微“身份证”或者“指纹”生物样品中的特征序列及丰度即可实现微生物的鉴别从而进一步检测生物气溶胶。 １　核酸杂交技术３． 核酸杂交技术依据碱基互补配对原理，将带有标志物的核酸探针与被检样品中的目标核酸序列特异性地结合，然后利用特定手段测定标志物，通过确定样品中目标核酸序列的丰度来实现对微生物的鉴别。如果以某种微生物的特征序列为探针，那么通过杂交技术就可以检测样品中是否含有该微生物。核酸杂交技术具有高特异性、高灵敏度的优点，能在几分钟至几小时内检测出ｐｇ水平的基利用荧光原位杂交还可以实现目标序因组ＤＮＡ；列的定位与可视化。 如今，核酸杂交技术已经广泛应用于致病微生物中，以生物气溶胶形式施放的病毒、细菌、立克次体等多种生物战剂都可以被成功检测出来。２　ＰＣＲ技术３． 是一种能在体外快速扩增聚合酶链反应（ＣＲ）Ｐ特定基因片段的方法，即通过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，对寡核苷酸引物所界定的基因片段进行扩增，通过检测出来的ＤＮＡ和ＲＮＡ来实现对微生物的鉴别。Ｈｌａｕａｎｄ第一次用ＰＣＲ技术－ｇ检测了人工发生真菌Ｓｔａｃｈｂｏｔｒｃｈａｒｔａｒｕｍ的气溶ｙｙ　胶，检测值与直接镜检和已知浓度值相符，证明ＰＣＲ可以快速定量空气中某种生物气溶胶的浓度。随后他又研究了真菌孢子不同ＤＮＡ提取方法对ＰＣＲ技术结果的影响。Ｃｅｒｕｚｒｅｚ研究了应用ＰＣＲ技术检－ｐ测环境真菌的引物和探针，并评价了各种ＤＮＡ纯化 ８１　 韩丽丽等：生物气溶胶核酸检测技术分析总第２７２期 枯草芽孢杆菌１并利６ＳｒＤＮＡ的寡核苷酸探针，用该芯片对１５８份环境样品进行了检测。结果表明：该方法可将炭疽菌与其他杆菌有效区分，整个检测过程仅需１２小时。 目前基因芯片已在生物战剂气溶胶检测领域广泛应用。多国权威媒体和刊物中都已有采用基因芯片技术检测大肠埃希菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、西部马脑炎病毒、出血热病毒等和采用免疫芯片技术检测葡萄球菌肠毒素的研究报道。 但是基因芯片的制作成本还很高，并且需要昂贵的检测仪器，因此该技术主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床致病微生物的检测与鉴定。４　核酸检测技术特点分析３． 核酸检测技术具有如下优点：和免疫学技术优点相同，该技术具有高特异性、高灵敏度的优点，能在几分钟至几小时内检测出ｐＮＡ。ｇ水平的基因组Ｄ 可是核酸检测技术也有自身的缺陷：该技术本身的专业要求较高，导致形成装备的难度偏大，一定程度上限制了该技术的应用。 ５　国内外研究现状３． 西方发达国家便已早在２０世纪９０年代初期，发明了以ＰＣＲ技术为代表的核酸检测技术。在随核酸检测技术以其高特异性、后的２高灵０多年里，敏度的优点得到广泛关注和良好发展。 汪晓辉等于１９９６年利用逆转录半套式ＰＣＲ技术对风疹病毒气溶胶进行检测。但随后，由于各种条件的限制，迟迟未能有创新进展，与西方发达 检测技术遥测免疫学核酸质谱生物发光 分析时间较快一般很快很快较快 灵敏性一般一般很强较强一般 国家的水平差距较大。 ４　对我国研究生物气溶胶检测技术 的几点建议 　　通过对生物气溶胶检测技术国内外研究现状的分析，本文认为国内生物气溶胶检测技术与发达国家相比，存在起步较晚、发展较慢、研究较浅、技术较为落后的问题。为提高我国生物气溶胶检测水平，需要做的工作还有很多，本文针对我国实际研究情况，提出以下建议。 １　加大对生物气溶胶检测技术的研究力度４． 我国对生物气溶胶检测技术的研究起步较晚，在人力物力投入方面明显不够，导致一些关键技术较发达国家相比落后较多。而随着生物气溶胶检测技术向自动化、实时化、远程化的趋势发展，其在技术上的要求必定越来越高，这更是需要我国加大对此的研究力度，紧紧追踪国外生物气溶胶检测技术的发展动态和前沿水平，将积极引进先进技术和自主研制有机结合起来，集中力量，联合攻关，以期在不久的将来研究出具有国际先进水平和我军特色的生物气溶胶检测技术。 ２　重点发展核酸检测技术４． 检测生物气溶胶的技术很多，遥测技术、免疫学技术、核酸技术、质谱技术、生物发光技术等。每种技术各有优缺点，从目前检测技术发展的现状来看，核酸检测技术在分析时间、灵敏性、可靠性、特异性等方面均优于其他技术，结果如表１所示。 可靠性一般一般强较强差 特异性一般较强强一般差 设备一般复杂较复杂一般简单 备注商品化商品化发展中商品化商品化 表１　各种检测技术的比较 但是其　　虽然核酸检测技术有以上多方面的优势， 对专业技术的要求较高，一些关键技术尚未得到优化，仍需广大科研人员继续攻坚克难。因此，本文认为我国的研究重点应放在核酸检测技术上，做到优化技术，简化流程，高效地完成对生物气溶胶的检测。３　尝试发展集多种检测技术优点于一身的新型４． 技术 生物气溶胶的检测已经发展为一个涉及多种学科与技术的系统工程，它包括遥测、免疫、核酸、质谱等多种技术。每种技术都含有其特定的优缺点，经研究发现，有时仅靠一种技术很难高效地完 成对生物气溶胶的检测。因此，早在２０世纪８０年代美国等先进国家已开始研究由几种技术、几种仪器组成的ＪＢＰＤＳ系统来解决某些复杂的生物气溶胶检测难题。我国应跟随国际先进水平的步伐，尝试发展集多种检测技术优点于一身的新型技术，以期高效的完成对生物气溶胶的检测。 参考文献 ［］许强，金伟其，董立泉．超光谱侦察系统的光学参数设１ ］（）：计［北京理工大学学报，９Ｊ．２００６，２６１０８９８０６．－ （下转第２４页 ） ４２　 李　宁等：海上作战指挥训练评估方法研究 参考文献 总第２７２期 。果为“良” ６　结语 本文突破海上作战指挥训练评估对象以受训者，即海上作战指挥机构为主的传统做法，将训练内容设计、训练计划拟制、训练实施保障等训练组织环节，以及指挥训练环境和条件模拟、作战效果裁判、系统稳定性和恢复能力等，指挥信息系统训练功能的效能也纳入到海上作战指挥训练评估对象范畴。按照此思路，构建了基于组训、受训和指挥信息系统三要素的海上作战指挥训练评估指标体系，并建立了相应的评估模型，提高了海上作战指挥训练评估的全面性和准确性。评估模型求解主要采用基于灰色理论的层次分析法，通过将专家的定性评判转化为灰类程度不同的评估指标权重向量，再经过对该向量的一致性检验和归一化处理，形成定量的评估判断，实现评估的定性与定量相结合，一方面减少了人为因素对评估的干扰，另一方面也提高了评估模型的计算准确度。通过实例验证，该评估模型及其求解方法对于提高海上作战指挥训练评估的科学性和准确性效果良好。 ［］戴钧陶．现在管理评估技术［北京：机械工业出版１Ｍ］． 社，９９４：６５９．６１－ ［］张卓．作战系统效能评估［北京：军事科学出版社，２Ｍ］． ９９６：８７１．１９－ ［］毕长剑，董冬梅．作战模拟训练效能评估［北京：国３Ｍ］． 防工业出版社，０１４：４７４．２５－ ［］张海波，胡剑光，常国任．基于模糊评价的水面舰艇综４ ］（）：合性能评估［舰船电子工程，００７３１１１１４．Ｊ．２１－［］刘宪，王平．基于灰色层次分析法的舰载机部队训练评５ ］（）：估［舰船电子工程，Ｊ．２２０１６３５８．２－ ［］郭齐胜．装备效能评估概论［北京：国防工业出版６Ｍ］． 社，２１００５：１０００６．－ ［］黄希利，杜红梅，罗小明．通信对抗系统作战能力评估７ （）：］模型［装备指挥技术学院学报，０１０２８３６．Ｊ．２８－［］张笑，徐廷学，范树海．基于灰色层次分析法的武器系８ ］统综合保障能力评估［海军航空工程学院学报，Ｊ．（）：２３００９３３５１５５．－ ［］黄勇，孙德翔，邢国平．基于灰色层次分析法的装备备９ ］（）：件重要度评价［航空维修与工程，Ｊ．２０１０４６８．６６－［］邵帅，戴明强，张肖．基于正态云关联度的军事后勤仓１０ 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