12种藏药对鸡法氏囊病毒感染鸡胚成

12种藏药对鸡法氏囊病毒感染鸡胚成 江苏农业学报（肋ｎｇｓｕ上Ｄ，Ａｇｒ．蹦．），２００９，２５（Ｉ）：２１９—２２１ ２１９ １２种藏药对鸡法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响 赵晓娜１， 牛家强２，胡元亮１，黄小燕１，王君敏１，朱广双１ （１．南京农业大学中兽医学研究室，江苏南京２１００９５；２．西藏农牧学院动物科学技术系，西藏林芝８６００００） 关键词：藏药；鸡胚成纤维细胞；鸡传染性法氏囊病毒；感染细胞能力 文献标识码：Ａ 中图分类号：Ｓ８５３．７２ 文章编号：１０００４坳（２００９）０１－０２１９－０３ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴｗｅｌｅｖｅＴｉｂｅｔａｎＨｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｏｎ ＣｅｌｌｕｌａｒＩｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩｎ－ ｆｅｃｔｉｏｎｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓｔｏＣｈｉｃｋＥｍｂｒｙｏＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ ＺＨＡＯＸｉａｏ－ｍ１，ＮＩＵ Ｊｉａ－ｑｉａｎ９２，删Ｙｕａｎ—ｌｉａｎ９１，ＨＵＡＮＧ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｘｉａｏ－ｙａｎｌ，ＷＡＮＧＪｕｎ．ｎｆｉｎｌ，ＺＨＵＧｕａｎｇ－ｓｈｕａｎ９１ （Ｉ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇ，ｌｅ础ｕｍｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊ蛔ｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ０，Ａｎｉｍａｌ５ｃ妇ⅫａｎｄＨ．ｓｋ，ｕｔ．７，ＴｉｂｅｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉｎｚｈｉ８６００００，Ｃｈｉｎａ） Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｉｂｅｔａｎｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ；ｃｈｉｃｋｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｅｓ；ｃｅＨｕｌａｒｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ 藏医藏药有着独特的理论体系，在世界医学中独树一帜，是仅次子中医中药而有系统理论的民族医药。由于青藏高原平均海拔在４ ０００ 简称松石丸）、二十五味珍珠丸（以下简称珍珠丸）３种藏药制剂，由西藏农牧学院抗禽源性病毒藏药材筛选及制剂研制课题组提供。分别称取９种藏药饮片２０ｇ，加８倍量水先武火加热至沸腾，再文火煮沸３０ｍｉｎ，滤出药液，药渣加６倍量水再煎２次。合并３次滤液，离心，浓缩至生药浓度１ ｇ／ｍｌ， ｍ以上，无污染，氧气稀薄，太阳辐射 强，紫外线丰富，光合作用强，加之干湿季节和冷暖季节变化明显，昼夜温差大等特点，使得藏药植物有效成分积累多，生物活性成分一般较其他地区同种药用植物高。而这些有效成分。通常是现代新药开发中重要的、天然的先导化合物’”。 离心取上清，分装。分别称取３种成方制剂２０ｇ，加入８倍量水，７０℃水浴溶解，离心取上清，分装。各药液均在１００℃下高压灭菌３０ｒａｉｎ，４℃冰箱保存。 测定各药对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）的最大安全浓度，结 本研究拟采用Ｍ”法测定藏菖蒲、红景天、决明子、灵芝盖、 灵芝柄、龙胆、天冬、降香、乳香、仁青芒觉、二十五味珍珠丸、二十五味松石丸共１２种藏药对鸡传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响，旨在为进一步筛选抗鸡传染性法氏囊病毒藏药复方的组分药提供理论依据。 果为：红景天３１．２５彬ｌＩｌｌ；天冬、决明子、降香、松石丸均为 ６２．５０略／ｍ１；乳香１２５．００ｉｘｅ／ｍｌ；珍珠丸２５０．００峙／Ｔｒｄ；藏菖 蒲、灵芝柄均为ｌ０００．００ｔｗ，／ｒｌＩｌ；龙胆、仁青芒觉均为 ２５００．００ １材料与方法 １．１藏药准备 藏菖蒲、红景天、灵芝柄、灵芝盖、决明子、天冬、龙胆、降香、乳香计９种藏药饮片和仁青芒觉、二十五味松石丸（以Ｆ Ｏｅ：／ｍｌ；灵芝盖５０００．００斗Ｓ／ｍｌ。临用前红景天以 ３１．２５阻ｇ／ｍｌ为高浓度．分别用细胞维持液依次倍比稀释成 １５．６２．ｅ／ｍｌ、７．８１肛ｇ／ｌＩＩｌ、３．９１∥ＩＩｌｌ和１．９５ｔｗ，／ｍｌ共５种浓度；天冬、决明子、降香、松石丸均６２。５０彬Ｉｎｌ为高浓度，分别用细胞维持液依次倍比稀释成浓度３１．２５∥Ｉｎｌ、１５．６３∥Ｉｎｌ、７．８１ｔｗ，／ｍｌ和３．９１ｏｇｍｌ共５种浓度；乳香以 １２５．００ 收稿日期：２００８－０７，１０ 基金项目：西藏自治区科学技术厅重点科技项目（０６９１２０２０） 作者简介：赵晓娜（１９８２一），女，河南濮阳人，硬士研究生，主要研究方 向为中药药理学。 ｖｇｎａ为高浓度，分别用细胞维持液依次倍比稀释成 ６２．５０斗ｇ／，ｒａ、３１．２５峙／Ｉｎｌ、１５．６３ｔｗ，／ｍａ和７．８１ｔｗ，／ｍｌ共５种浓度；珍珠丸以２５０．００ｇｃ＇ｍｌ为高浓度，分别用细胞维持 液依次倍比稀释成１２５．００峙／Ｉｌｌｌ、６２．５０峙／Ｉｌｌｌ、３１．２５衅／Ｉｎｌ 通讯作者：胡元亮，（Ｔｅｌ）０２５－８４３９５２０３；（Ｅ－枷Ｉ）ｙｌｈｕ＠ｎｊａｎ．ｅｄｕ．ｃａ 和１５．６２∥ｌｌｌｌ共５种浓度；藏菖蒲、灵芝柄均以ｌ ０００．００ 万方数据　 汀苏农业学报２００９年第２５卷第１期 ｐｇ／ｍｌ为高浓度，分别用细胞维持液依次倍比稀释成５００．００¨ｇ／ｍｌ、２５０．００斗ｇ／ｍｌ、１２５．００ｐｇ／ｍｌ和６２．５０斗ｇ／ｌｌｌｌ共５种浓度；龙胆、仁青芒党以２５００．００“昏／ｍｌ为高浓度，分别用细胞维持液依次倍比稀释成１ ２５０．００彬ｍｌ、６２５．００∥“、 ３１２．５０斗ｇ／ｍｌ和１５６．２５Ｉ＿Ｌｅ，／ｍ］共５种浓度；灵芝盖以 ５ ０００．００斗∥ｍｌ为高浓度，分别用细胞维持液依次倍比稀释 成２５００．００斗ｇ／ｍｌ、１２５０．００斗吕／ｍｌ、６２５．００ｉＪｅ／ｍｌ和３１２．５０“∥ｍｌ共５种浓度。１．２鸡传染性法氏囊病毒 用鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中等毒力活疫苗（ＮＦ８株，南京药械厂生产，批号０５１０６３７）接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，连续传代培养得鸡传染性法氏囊痫病毒（ＩＢＤＶ）。以细胞维持液１０倍系列稀释，用Ｒｅｅｄ・ｌ～ｌｕｅｅｈ法２测得半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ５０）为ＩＯ～，ｌ临用前用细胞维持液稀释成１× １０。（ＩＯＯＴＣＩＤＳＯ）。 １．３主要试剂 ＭＥＭ培养基，Ｃｉｂ口。公司产品，按说明配制，再加入双抗（１００Ｉｇ／ｍ１）和犊牛血清（达５％为细胞生长液，达２％为细胞维持液）。胰蛋门酶，科威公司进Ｌ１分装，用ＰＢＳ配制成０．２５％的溶液，凋ｐＨ值毫７．４，０．２２斗ｍ混合纤维素酯微ｆＬ滤膜过滤除菌，分装，一２０℃保存备用。四唑盐（Ｍ１１），Ｓｉｇ－ｒｆｔｏ．公司产品，用ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）溶解成２％溶液，０．２２岬混 合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，４℃避光保存，１个月内用完。裂解液、二甲亚砜（ＤＳＭＯ）均为纯。１．４主要仪器 ＣＯ：培养箱，美国Ｒｅｖｅｏ公司产品；ｘｓｚ—Ｄ：型倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品；ＤＧ３０２２型酶联免疫仪，国营华东电子管厂产品；７５－２Ａ型微量振荡器，上海医用分析仪器厂产品；９６孑Ｌ细胞培养板、２４ｉＬ细胞培养板和细胞培养瓶，德国Ｎｕｎｅｌｏｎ公司产品。１．５试验方法 按文献［３］方法制备ＣＥＦ，计数后用细胞生长液将细胞数调整至１ｍｌ×１０６个，加到９６孔细胞培养板中，每孔１００斗Ｉ，３８．５℃、５％ＣＯ，条件下培养２４ｈ待细胞长成单层时，试验组分别以３种方式。¨加入各浓度药液和病毒液。 ｌ，５．１先加藏药后接种病毒倾去单层细胞上的生长液．分别加入不同浓度的藏药液１００Ｉｘｌ，３７℃下作用２ｈ后倾去藏药液，接种ＩＯＯＴＣＩＤ５０的ＩＢＤＶ病毒液１００¨ｌ。１．５．２先接种病毒后加藏药 倾去单层细胞上的生长液， 接种ＩＯＯＴＣＩＤ５０的ＩＢＤＶ病毒液，３７℃下作用４ｈ后倾去病毒液，再分别加入不同浓度的藏药液１００山。 １．５．３藏药和病毒感作后同时加先将病毒液分别加入到不同浓度的藏药液中，４℃下感作２ｈ后加入到已长成单层的ｃＥＦ中，每孔１００ｍ。对照组用的病毒液同条件放置２ ｈ。 以上每种浓度药液重复４孔，同时设病毒对照组（只加病毒）、细胞对照组（只加维持液）和无细胞的空白调零孔。 万　 方数据３８．５℃、５％ＣＯ：下继续培养７２ｈ测定细胞活性。１．６细胞活性测定 用ＭＴｒ法。测定前４ｈ每孔加入３０山ＭＴＴ溶液，测定时快速翻转培养板，甩去孔内培养液，每孔加入１００一裂解液，室温振荡１０ｍｉｎ使结晶物溶解，然后用酶联免疫检测仪测定５７０ｎｍ波长处的吸光（Ａ５７０）值一Ｊ，作为藏药抵抗ＩＢＤＶ病毒感染ＣＥＦ的指标。当藏药组的ＡｓＴｏ值显著大于病毒对照组时，表明有显著抵抗病毒感染细胞的作用。１．７数据分析 数据用平均数４－标准差表示。用ＳＰＳＳ统计分析软件进行方差分析和多重比较。 ２结果 ２．１ 先加藏药后加病毒对ｍＤＶ感染细胞能力的影响降香和藏菖蒲的５个浓度组、灵芝柄的后４个浓度组和 红景天的后３个浓度组的细胞Ａ，。值显著大于病毒对照组（Ｐ＜０．０５）；乳香的５个浓度组，天冬的２、４浓度组，灵芝盖的１、３浓度组，仁青芒觉的５个浓度组和珍珠丸的２、５浓度组的细胞Ａ。值稍大于病毒对照组。表明降香在３．９１—６２．５０斗ｇ／ｍｌ、藏菖蒲在６２．５０～ｌ０００．００肛ｇ／ｍｌ、灵芝柄在 ６２．５０—５００．００峙／ｍＩ、红景天在１．９５—７．８１彬ｍｌ能显著抑 制ＩＢＤＶ感染细胞；乳香７．８１～１２５．００斗昏／ｍｌ、天冬在７．８１斗ｇ／ｍｌ和３１．２５｜Ｌｇ／ｒｎｌ、灵芝盖在ｌ２５０．００卜∥ｍｌ和５０００．００斗ｇ／ｔｌＩｌ、仁青芒觉１５６．２５～２５００．００ｔＬｇ／ｍ］、珍珠丸在１５．６３肛ｇ／ｍｌ和１２５．００斗∥ｍｌ时，可能对ＩＢＤＶ感染细胞有抑制作用；龙胆、决明子、松石丸各浓度组的细胞Ａ，，。值都与病毒对照组的差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５），说明龙胆、决明子、松石丸对ＩＢＤＶ感染细胞无明显影响。 ２．２后加藏药对ＩＢＩ）Ｖ感染细胞能力的影响 降香、红景天、藏菖蒲的５个浓度组，灵芝柄的前２个和 后２个浓度组，天冬和龙胆的第５浓度组，灵芝盖的第１浓度组，仁青芒觉的２、４浓度组．珍珠丸的ｌ、４、５浓度组，松石丸的第２浓度组的细胞Ａ５７０值均显著大于病毒对照组（Ｐ＜Ｏ．０５）；乳香５个浓度组的细胞Ａ，。值稍大于病毒对照组。表明降香在３．９ｌ一６２，５０斗ｇ／ｍｌ、红景天在１．９５～３Ｉ．２５斗昏／ｌｎＩ、藏菖蒲在６２．５０—１０００．００｜Ｌｇ／ｍｌ、灵芝柄在６２．５０一 １２５．００“ｇ／ｍｌ和５００．００—１０００．ＩＸ）斗ｇ／ｍｌ、天冬在３．９ｌ Ｉ＿Ｌｇ／ｍｌ、龙胆在１５６．２５¨善／ｍｌ、灵芝盖在５０００．００斗ｇ／ｍｌ、松石丸在３１．２５肛ｇ／“、仁青芒觉在３１２．５０ＮＬｅ，／ｍｌ和１ ２５０．００ 斗ｇ／ｍｌ、珍珠丸在１５．６３—３１．２５ｌａｅ，／ｍｌ和２５０．００峙／ｌｌｌｌ、松石丸在３１．２５“∥ｍｌ时能显著抑制ｌｌｔｌ？Ｖ感染细胞；乳香在 ７，８Ｉ一１２５ ００¨ｇ／ｍｌ时可能对ＩＢＤＶ感染细胞有抑制作用； 决明子各浓度组的细胞Ａ５７０值与病毒对照组的差异不显著（Ｐ＞０．０５），表明决明子对ＩＢＤＶ感染细胞无明显影响。 赵晓娜等：１２种藏药对鸡法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响 ２．３藏药和病毒感作后同时加入对１ＢＤＶ感染细胞能力的影响 天冬的第５浓度组，决明子的ｌ、４浓度组，珍珠丸的ｌ、２、３、５浓度组的细胞Ａ，。值均显著大于病毒对照组（Ｐ＜０．０５）；降香的第１浓度组，乳香的ｌ、５浓度组，藏菖蒲的第２浓度组和灵芝盖前３个浓度组的细胞Ａ。值稍大于病毒对照组。表明天冬在３．９ｌ斗∥Ｉｎｌ、决明子在７．８１斗ｇ／ｍｌ和６２．５０¨晷／“、珍珠丸在１５．６３斗∥Ｉｎｌ和６２．５０一２５０．００¨ｇ／ｍｌ时能显著抑制ＩＢＤＶ感染细胞；降香在６２．５０¨ｇ／“、乳香在７．８ｌ 斗ｇ／ｍＪ和１２５．００彬“、藏菖蒲在５００．００ ｐ，ｇ／ｍｌ、灵芝盖在 ｌ２５０．００—５ ０００．００“∥ｆ｜Ｉｌ时可能对ＩＢＤＶ感染细胞有抑制 作用。龙胆、灵芝柄、红景天、仁青芒觉和松石丸各浓度组的细胞Ａ，。值都与病毒对照组差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５），表明龙胆、灵芝柄、红景天、仁青芒觉和松石丸对ＩＢＤＶ感染细胞无明显影响。 ３讨论 本试验结果表明，１２种藏药对ＩＢＤＶ感染鸡胚成纤维细胞均有不同程度的抑制作用。与加药方式和药物浓度有一定的相关性。先加藏药后接种病毒时，降香在３．９１—６２．５０阻昏／ＩＩｌｌ、藏菖蒲在６２．５０～１０００．００峙／１１１ｌ、红景天在１．９５～７．８Ｉ雌／ｌｌｌｌ、灵芝柄在６２．５０—５ ０００．００ ｐ．ｇ／ｍｌ显著抑制ＩＢ－ ＤＶ感染细胞。这种方式相当于阻断感染试验，可能阻止ＩＢ—ＤＶ进入细胞芦ｏ。先接种病毒后加藏药时，降香在３．９Ｉ一 ６２．５０彬“、藏菖蒲在６２．５０～１００００．００彬“、红景天在 １．９５—３１．２５斗ｇ／Ⅱｄ、灵芝柄在６２．５０一１２５．００斗ｇ／ｍｌ和 ０００．００ ｐ．ｇ／ｍｌ、天冬在３．９１斗∥ｍｌ、龙胆在 １５６．２５彬ｔＩＩＩ、灵芝盖在５０００．００∥ｌＩｌｌ、松石丸在３１．２５ “ｇ／ｍｌ、仁青芒觉在３１２．５０）培／ｍｌ和１２５０，００峭／ｒＩｌｌ、珍珠丸在１５．６３—３１．２５峭／“和２５０．００“ｇ／ｒｎｌ、松石丸在３１．２５斗∥【１１１时显著抑制ＩＢＤＶ感染细胞。这种方式相当于抑制增殖试验，可能抑制病毒在细胞内增殖［５】。藏药与病毒感作后 同时加入，天冬在３．９ｌ峭／“、决明子在７，８１峙／ｍｌ和６２．５０ 恤∥ｌＩｌｌ、珍珠丸在１５．６３“∥ｌｎｌ和６２．５０—２５０．００∥ｒｎｌ时显 著抑制ＩＢＤＶ感染细胞。这种方式相当于直接灭活试验．可 能直接杀灭病毒。６１。 综合３种加药方式，降香、藏菖蒲、红景天、灵芝柄在前２ 万　 方数据种加药方式，天冬、珍珠丸在后２种加药方式中均有显著效果；降香、藏菖蒲在第３种加药方式，天冬、珍珠丸在第１种加药方式中也表现一定效果，说明这几种藏药的体外抗病毒效果较好。从显效浓度方面分析。红景天最低，其次为降香、天冬、珍珠丸、藏菖蒲、灵芝柄。研究表明，鸡传染性法氏囊 病最大的危害是破坏鸡的免疫器官一法氏囊，使携带ＳＩｇＭ 标志的Ｂ淋巴细胞变性和坏死，导致严重的、长期的免疫抑制”，并引起肌肉、肠粘膜和腺胃出血。石菖蒲、红景天、灵芝能增强正常的和免疫抑制动物的免疫功能‘””Ｊ，降香活血、安神‘“Ｊ，天冬养阴清热”Ｊ，这些作用都有助于鸡传染性法氏囊病的防治。因此，降香、藏菖蒲、红景天、灵芝柄、天冬和二十五昧珍珠丸可考虑作为防治鸡传染性法氏囊病藏药复方的组分药。 参考文献： ¨３燃尝轰淼篙，黼：１４０－鲫１４４．．栅椴麟¨Ｌ西 ［２］ 姜宗敏．中草药俸矫抗鸡新城疫病毒活性及作用方式研究［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学，２００４． ［３］胡元亮，孔祥峰，张宝康，等．１０种中药成分对鸡胚成纤维细 胞生长的影响［Ｊ］．中国兽医学报，２００３，２３（６）：６０１－６０３． ［４］殷震．刘景华．动物病毒学［Ｍ］．２版．北京：科学出版社． １９９７：２０４－２４６． ［５］许小琴，ＭＯＨＡＭＭＥＤＫ，部平光，等．转化趔桔梗皂苷抗ＩＢＤＶ、 ＡＩＶ和ＮＤＶ的研究［Ｊ］．扬州大学学报，２００６。２７（Ｉ）：２４－２８．［６］孔祥峰．中药成分对细胞增殖、病毒感染和抗体生成的影响 ［Ｄ］．南京：南京农业大学，２００３． ［７］陈玉库．中药防治鸡传染性法氏囊病新制剂的研究［Ｄ］．南 京：南京农业大学，２００２． ［８］卢振，陈金和，王雨来，等．灵芝的研究及应用进展［Ｊ］．时 珍国医国药，２００３，１４（９）：５７７－５８０． ［９］朱英，来平凡．石菖蒲的研究近况［Ｊ］．浙江中医学院学报， ２００１，２５（３）：８０－８ｉ． ［１０］李刚，张述禹．藏药红景天的药理学研究进展［Ｊ］，中国民 族医药杂志，２００４，ｔｏ（３）：４０－４２． ［１１］訾慧，沙明．中药降香研究进展［Ｊ］．辽宁中医学院学报， ２００３。５（２）：９０－９１． ［１２］于金平，任全进．养阴清热天冬草［Ｊ］．园林，２００３（１０）：６２． ５００．００一ｌ