_薄层色谱法检查熊去氧胆酸的有关物

_薄层色谱法检查熊去氧胆酸的有关物 薄层色谱法检查熊去氧胆酸的有关物质 佟爱东，劳瑞珍，李思源 （广州市药品检验所，广州510160） 摘要 目的：建立熊去氧胆酸有关物质检查的薄层色谱方法。方法：以丙酮－水（9∶1）为溶剂，制备熊去氧胆酸溶液（10mg· －1－1 mL－1），鹅去氧胆酸对照溶液+熊去氧胆酸对照溶液（各0.4mg·mL）、鹅去氧胆酸对照溶液（0.1mg·mL）、胆石酸对照－1－1 0.02，0.05mg·mL－1）；各点样5μL于硅溶液（0.01mg·mL）、胆酸对照溶液（0.05mg·mL）、系列自身对照溶液（0.01， 胶G薄层板上，以二氯甲烷－丙酮－冰醋酸（60∶30∶3）为展开剂，以4.5%磷钼酸硫酸溶液－冰醋酸（1∶20）溶液为显色剂。结果：熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸分离较好；熊去氧胆酸可能含有的各有关物质的斑点清晰可见。结论：本法适用于熊去氧胆酸的质量控制。 关键词：薄层色谱法；胆石溶解药；熊去氧胆酸；有关物质限量；鹅去氧胆酸；胆酸；杂质限度检查中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254－1793（2012）09－1654－04 TLCexaminationofrelatedsubstancesinursodeoxycholicacid TONGAi－dong，LAORui－zhen，LISi－yuan （GuangzhouInstituteforDrugControl，Guangzhou510160，China） AbstractObjective：ToestablishaTLCmethodfordeterminationoftherelatedsubstancesinursodeoxycholic acid．Methods：Acetone－water（9∶1）wasusedasthesolventforpreparationofursodeoxycholicacid（10mg·mL－1），ursodeoxycholicacidpluschenodeoxycholicacidsolution（eachat0.4mg·mL－1），chenodeoxycholicacidcontrolsolution（0.1mg·mL－1），lithocholicacidsolution（0.01mg·mL－1），cholicacidcontrolsolution（0.05andseriesofself－controlsolutions（0.01，0.02，0.05mg·mL－1）．5μLofeachsolutionwasaddedmg·mL－1）， inGplate，amixtureofmethylenechloride，acetoneandglacialaceticacid（60∶30∶3）wasadoptedasdeveloper，andphosphomolybdicacid－sulphuricacidsolution（4.5%，w/v）－glacialaceticacid（1∶20）wasusedascolorrea-gent．Results：Ursodeoxycholicacidandthechenodeoxycholicacidcanbeseparatedwell；relatedsubstancesofur-sodeoxycholicshowedclearlyseparatedprincipalspots．Conclusion：Theestablishedmethodcanbeusedforthequalitycontrolofursodeoxycholicacid． Keywords：TLC；gallstonedissolutiondrug；ursodeoxycholicacid；relatedsubstancelimitofamount；chenodeoxy-cholicacid；cholicacid；impuritylimittest ［1］ 1920年发现，熊去氧胆酸为胆石溶解药， 1937年确定结构，1957年开始用于临床，已广泛被 对薄层色谱法检查熊去氧胆酸的有关物质进行研究， 修订了中国药典2005年版有关物质检查的薄层色谱2010年版药典对熊去氧胆酸原料可能存在的鹅去法，氧胆酸、胆石酸、胆酸3种杂质进行限量检查，限度分0.1%，0.5%，别为1.0%，并采用自身对照对其他杂 ［6］ 杂质总量不得过0.5%。质进行控制，1 仪器与试药 薄层层析硅胶（HG/T2354－92，化学纯，青 岛海洋化工有限公司制造）；硅胶G60薄层板 各国药典收载。中国药典1990年开始收载该品种，至2005年版二部，均延用薄层色谱法检查熊去氧胆酸的有关物质。中国药典2005年版二部对鹅去氧胆酸进行限量检查，规定为1.5%，采用胆石酸为对检查其他杂质，限度为0.1%；由于供试品溶液的照， ［2，3］ 。在熊去氧点样量小，没能起到控制杂质的作用 ［4］［5］ 胆酸修订工作中，比较了BP2008与JP15， 第一作者Tel：（020）26283409；E－mail：tongad@gzfda．gov．cn （Merck1.05626.0001）；硅胶G60铝板（Merck 1.05553.0001）。 对照品：胆酸（批号：078－9312）、胆石酸（批 鹅去氧胆酸（批号：110806－号：100127－199701）、 200303）、熊去氧胆酸（批号：0755－9003）均购于中 国食品药品检定研究院。 熊去氧胆酸原料（1）（批号：XQ080301）；熊去氧胆酸原料（2）（批号：060801）。 硫酸、冰醋酸、乙醇、磷钼酸、二氯甲烷、三氯甲丙酮均为市售纯；乙腈、甲醇为色谱纯。烷、22.1 方法与结果 图1Fig1mL－1 ChP（2010）法的TLC图（点样量：5μL）TLCofChP（2010）（samplingamount：5μL） 2．原料2（sample2）10mg· 4．鹅去氧胆酸（che-7～9．原料1 3．熊去氧胆酸（ursodeoxycholicacid）0.4mg·mL－1+鹅去氧 5．胆石酸（lithocholicacid）0.01 溶液的制备取本品约100mg，精密称定，置10mL量瓶中，用丙酮－水（9∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取熊去氧胆酸对照品与鹅去氧胆酸对照品各4mg，置10mL量瓶中，用丙酮－水（9∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶精密称定，置液（1）；取鹅去氧胆酸对照品约1mg，10mL量瓶中，用丙酮－水（9∶1）溶解并稀释至刻 摇匀，作为对照溶液（2）；取胆石酸对照品约1度， mg，精密称定，置10mL量瓶中，用丙酮－水（9∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该液1mL，置10mL量瓶中，加丙酮－水（9∶1）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（3）；取胆酸对照品约5mg，精密称定，置10mL量瓶中，用丙酮－水（9∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该液1mL，置10mL量瓶中，加丙酮－水（9∶1）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（4）；精密 置10mL量瓶中，加丙酮－水量取供试品溶液1mL， （9∶1）稀释至刻度，0.2，摇匀，分别精密量取该液0.1， 0.5mL，分别置10mL量瓶中，加丙酮－水（9∶1）稀释（6）、（7）。至刻度，摇匀，作为对照溶液（5）、 2.2检测结果吸取供试品溶液与7种对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷－丙酮－冰醋酸（60∶30∶3）为展开剂，展开，晾干，于120℃干燥10min，喷以4.5%磷钼酸的硫酸－冰醋酸（1∶20）溶液［称取磷钼酸4.5g，置100mL量瓶中，用硫酸－冰醋酸（1∶20）溶解并稀释至 ，刻度，摇匀］再在120℃加热3～5min，立即检视。结果如图1所示：对照溶液（1）（系统适用性溶液） 中的的熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸的分离较好。熊去氧胆酸原料（1）含鹅去氧胆酸、胆石酸、胆酸均低于 0.1%，0.5%）；有一杂质斑点，规定的限度（1.0%， 颜色浅于对照溶液（6），不过0.2%，符合规定；熊去 氧胆酸原料（2）不符合规定，除鹅去氧胆酸、胆石酸、胆酸外，其他杂质总量超0.5% 。 1．原料1（sample1）10mg·mL－1 胆酸（chenodeoxycholicacid）0.4mg·mL－1nodeoxycholicacid）0.1mg·mL－1mg·mL－1 6．胆酸（cholicacid）0.05mg·mL－1 （sample1）0.01，0.02，0.05mg·mL－1 2.3 灵敏度试验取胆石酸对照品适量，分别加丙 0.005，酮－水（9∶1）制成每1mL中含0.0025， 0.0075，0.01，0.02，0.04mg的6个浓度的溶液；取分别加丙酮－水（9∶1）制鹅去氧胆酸对照品适量， 0.05，0.1，0.2，0.4mg的5成每1mL中含0.0025， 个浓度的溶液；取胆酸对照品适量，分别加丙酮－水（9∶1）制成每1mL中含0.005，0.025，0.05，0.1，0.2mg的5个浓度的溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版二部附录ⅤB）试验，吸取上述16个溶液各5μL，分别点于同一硅胶G铝层板上，以二氯甲烷－丙酮－冰醋酸（60∶30∶3）为展开剂，展开，晾干，于120℃干燥10min，喷以4.5%磷钼酸的硫酸－冰醋酸（1∶20）溶液，再在120℃加热3～5min，立即检视。结果如图2所示：各对照溶液的斑点颜色随浓度的增加而加深，线性明显；胆石酸相当于供试品0.05%（点样量0.025μg）、鹅去氧胆酸相当于供试品0.25%、胆酸相当于供试品0.05%的斑点清晰可见。33.1 讨论 供试品溶液的制备为防止点样环形色谱效应，配制供试品溶液时，应选择对组分溶解度相对较 ［7］ 小得溶剂。中国药典（2005年版）与JP15均采用三氯甲烷－乙醇（9∶1）制备供试品溶液，中国药典浓 －1 JP15浓度为2.0mg·mL－1，度为1.0mg·mL，点样均为10μL；BP2008用丙酮－水（9∶1）制备供试品 －1 溶液，浓度为40mg·mL，点样5μL；考虑三氯甲烷中国药典（2010年版）选用丙酮－水（9∶1）的毒性大， －1 制备供试品溶液，浓度为10mg·mL，点样5μL。 —1656—32（9）药物分析杂志ChinJPharmAnal2012， 图2Fig2 灵敏度试验的TLC图（点样量：5μL）TLCofsensitivitytest（samplingamount：5μL） 7～11．鹅去氧胆酸（chenodeoxycholicacid）0.025， 12～16．胆酸（cholicacid）0.005， 1～6．胆石酸（lithocholicacid）0.0025，0.005，0.0075，0.01，0.02，0.04mg·mL－1 0.05，0.1，0.2，0.4mg·mL－10.025，0.05，0.1，0.2mg·mL－1 图4Fig4 BP法的TLC图（点样量：10μL）TLCofBP（samplingamount：10μL） 2．原料2（sample2）40mg·mL－1 4．鹅去氧胆酸（chenode- 1．原料1（sample1）40mg·mL－1oxycholicacid）0.4mg·mLmL －1 －1 3.2 JP15与展开与显色中国药典2005年版、 BP2008均采用硅胶G薄层板。中国药典、JP以三氯甲烷－丙酮－冰醋酸（7∶2∶1）为展开剂；20%磷 3．胆石酸（lithocholicacid）0.04mg·mL－16．原料1（sample1）0.1mg·mL－1 5．胆酸（cholicacid）0.2mg·mL－1 7．原料2（sample2）0.1mg· 钼酸乙醇溶液显色。结果如图3所示，鹅去氧胆酸和主斑点的分离效果较好，但胆石酸对照斑点没能显色，表明其点样量太少，不能起到控制杂质的作用。BP以二氯甲烷－丙酮－冰醋酸（60∶30∶1）为4.76%磷钼酸的硫酸－冰醋酸（1∶20）溶液展开剂， 显色。结果如图4所示，供试品溶液的主斑点大，拖尾，胆酸的比移值偏小。考虑三氯甲烷的毒性大，中国药典2010年版选用二氯甲烷－丙酮－ 冰醋酸为 8．熊去氧胆酸（ursodeoxycholicacid）0.4mg·mL－1+鹅去氧 胆酸对照（chenodeoxycholicacid）0.4mg·mL－1 展开剂，选用不同的硅胶G薄层板（手涂板、预制板、铝板）对二氯甲烷－丙酮－冰醋酸组成的比以二氯甲烷－丙酮－冰醋酸例进行优化试验， （60∶30∶3）为展开剂，4.5%磷钼酸的硫酸－冰醋酸（1∶20）溶液显色。 3.3杂质限度熊去氧胆酸（3a，7β二羟基－5β－ ）为原料进胆甾烷－24－酸）化学合成法是用胆酸（Ⅰ ），7β－二乙酰行酯化得胆酸甲酯（Ⅱ经乙酰化得3α， 7β－二乙酰氧基－12－胆酸甲酯（Ⅲ），经氧化得3α，酮基胆烷酸甲酯（Ⅳ），经还原得鹅去氧胆酸（Ⅴ），再 氧化为3α－羟基－7－酮基胆烷酸（Ⅵ），再还原后制得熊去氧胆酸（Ⅶ）。国内企业采用生化制药法用鹅 ［8］ 去氧胆酸为原料，经氧化、还原制备熊去氧胆酸。鹅去氧胆酸即熊去氧胆酸C7位的差向异构体。熊去氧胆酸中含鹅去氧胆酸的多少反映工艺好与坏，中 ［1］ BP2008限度国药典2005年版规定为不得过1.5%，为1%，中国药典2010年版规定为不得过1.0%；中 图3Fig3mL－1 ChP（2005）与JP法的TLC图（点样量：5μL）TLCofChP（2005）andJP（samplingamount：5μL） －1 国药典2010年版参照BP2008对胆石酸、胆酸杂质限量规定分别为不得过0.1%和0.5%，其他合成中的有关物质因对照品问暂不规定限度；采用自身对照法，配制系列浓度，对除鹅去氧胆酸、胆石酸、胆酸外的其他杂质（单个或多个）进行控制，总量规定为不得过0.5%，而BP2008仅控制单个杂质。3.4 预制板与手涂板吸附剂（硅胶）分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等有关，预制板颗粒均 1．原料1（sample1）1.0mg·mL2．原料2（sample2）1.0mg· 5．原料1（sample1） 7．鹅去氧胆酸 3．鹅去氧胆酸（chenodeoxycholicacid）0.015mg·mL－1 6．原料2（sample2）2.0mg·mL－1 4．胆石酸（lithocholicacid）0.001mg·mL－12.0mg·mL－10.002mg·mL－ 1 （chenodeoxycholicacid）0.03mg·mL－1 8．胆石酸（lithocholicacid） 32（9）药物分析杂志ChinJPharmAnal2012，—1657— 匀，涂布好，灵敏度高。采用手涂板分析时，可通过 增加点样量，提高检出量。如图5 。胆酸0.4%、其他杂质8%，以峰鹅去氧胆酸0.6%、 面积归一化法计算熊去氧胆酸峰纯度仅为87%，未灵检出胆石酸。由于熊去氧胆酸的紫外吸收不强， ［3］ 胆石酸的检出限度为0.2μg；而薄层敏度不高， 色谱法具有多路柱效应，可同时平行分离多个样品， 大大节约分析时间，完成1次分离，只需少量展开剂，试验表明胆石酸的检出限度为0.02μg。采用薄层色谱法分析熊去氧胆酸的有关物质与高效液相色谱法相比较，具有成本低，时间短，灵敏度高等检测优势。 参考文献 12 TheMerckIndex.14thed.2006.1699 LIHai－sheng（李海生），ZHOUJunHUANGZhe－su（黄哲甦）， （周珺）．Reviewandpropositionforlithocholicacid'sdetectionlimitofursodeoxycholicacidinChinesepharmacopeia（对中国药典收载品种熊去氧胆酸中胆石酸检出量的考察及修订）．ChinJPharmAnal（药物分析杂志），2000，20（3）：2663 TONGAi－dong（佟爱东）．SuggestionPENGGui－zi（彭贵子）， onimprovingthemethodforrelatedsubstancesofursodeoxycholic《中国药典》2005acidinChinesepharmacopoeia2005edition（改进 年版熊去氧胆酸原有关物质检查方法的建议）．DrugStandChi-na（中国药品标准），2008，9（6）：4084567 BP.2008．VolⅡ：2231JP15.2006.357 ChP（中国药典）.2010．VolⅡ（二部）：1105 HeLi－yi（何丽一）），XULian－SHENGLong－sheng（盛龙生）， lian（徐连连），etal．PharmaceuticalAnalysis（药物分析）．Beijing（北京）：ChemicalIndustryPress（化学工业出版社），2003.958 LIMing－hua（李明晔）．NewPreparationLILiang－zhu（李良铸）， TechnologyofBiochemicalDrugs（最新生化药物制备技术）．Bei-jing（北京）：ChinaMedico－PharmaceuticalScienceandTechnolo-gyPublishingHouse（中国医药科技出版社），2002.3629 TANGYu－hong（唐玉红）．HPLCdeterminationofursodeoxycholicacid（HPLC法测定熊去氧胆酸含量）．ModInstrum（现代仪器），2007（1）：74 （本文于2012年3月19日修改回） 图5Fig5mL－1 ChP（2010）法的TLC手涂板（点样量：10μL） TLCofChP（2010）（handcoatingplate；samplingamount：10μL） 2．原料2（sample2）10mg· 5．熊去氧胆酸对照 3．鹅去氧胆酸对照（chenodeoxycholicacid）0.1mg·mL－1 1．原料1（sample1）10mg·mL－1 4．胆石酸对照（lithocholicacid）0.01mg·mL－1cholicacid）0.4mg·mL－1mg·mL－1 （ursodeoxycholicacid）0.4mg·mL－1+鹅去氧胆酸对照（chenodeoxy-6～8．原料1（sample1）0.01，0.02，0.05 3.5 与高效液相色谱法的比较高效液相色谱法 测定熊去氧胆酸多采用乙腈－磷酸盐缓冲液为流动210nmUV检测相，十八烷基硅烷建合硅胶色谱柱， ［9］ 波长。取熊去氧胆酸原料（1）、原料（2），配制25 －1 mg·mL－1溶液，鹅去氧胆酸配制0.25mg·mL、 －1胆酸配制0.125mg·mL、胆石酸配制0.025mg· mL，5μm）色用HypersilODS（4.0mm×125mm， 0.001mol·L－1磷酸二氢钾（磷酸调pH至谱柱， 2.0）－乙腈（50∶50）为流动相，检测波长210nm，进结果原料（1）含鹅去氧胆酸行高效液相色谱分析，0.3%、胆酸0.1%、其他杂质0.2%，以峰面积归一化法计算熊去氧胆酸峰纯度为98.9%；原料（2）含 －1 （上接第1653页） 5 PANRui－le（潘瑞乐），CHENDi－hua（陈迪华），SIJian－yong（斯建勇），etal．Determinationof27－deoxyacteininvariousspeci-mensofRhizomaCimicifugaebyRP－HPLC（反相高效液相色谱法测定不同品种升麻中27－脱氧升麻亭的含量）．CentSouthPharm（中南药学），2007，5（3）：206 6ZHANGHan－li（张汉利），HUIYu－hu（慧玉虎），HUIMin－quan（惠民权），etal．HPLC－ELSDdeterminationof27－deoxy-acteininblackcohoshextract（HPLC－ELSD法测定黑升麻提取物中27－deoxyactein的含量）．ChinJPharmAnal（药物分析杂志），2001，21［Suppl（增刊）］：97 （本文于2012年6月7日修改回）