水杨酸在植物抗病反应中的作用

柑 蚊 树 "~7f。、’? c>¨I - " " - - 柳 i 植物生理学通讯 第 34卷 第 4期 ，1998年 8月 1 一 -／j I一 I十 水杨酸在植物抗病反应中的作用1 蔡新忠 郑 重 江农业大学植物保护系，杭州3loD29) — — — 一 — — — ／ R0le of Salicylic Acid in Plant Disease Resistance cAI x zbIlg，ZFIENO Zl~ong( 珈竹 ofPlant 吮d ．西 ^b妇如f 时，强咖 u 310029) 提要 介绍最近几年来有关植物体内术橱酸 (sal~ylic acid，sA)水平的调控 、sA在植新抗病反应 中的作用噩算机制、sA信号传导逮径等方面的重大 研 究进展。 水杨酸(salicylic acid，SA)是一种小分子 酚类物质，化学名称为邻羟基苯甲酸。它广 泛存在于植物界。据报道，在 34种主要农作 物的叶片和繁殖器官中都古有 SA，在不同植 物及同一植物不同组织中 sA含量不同．通常 含量极低，但在产热植物花序和受病原物侵 染的植物组织中含量很高 IJ。SA参与调节 植物中许多生理生化过程，如植物开花、产 热、种子发芽、气孔关闭、膜通透性及离子的 吸收等(详见文献 2、3)，因而有人认为 SA及 其盐类是一类新的植物激素f4J。近来又发现 sA在植物抗病反应中起重要作用 5，并且有 关植物体内 sA合成代谢途径、SA在植物抗 病反应中的作用及其机制、sA信号传导途径 等方面的研究也取得了重太进展。 1 SA在植物抗病反应中的作用 外源 SA在植物抗病反应中起作用，70 年代就有报道，90年代后成为植物抗病机制 研究热点之一。目前普遍认为．SA在植物抗 病反应中起重要作用。主要表现在以下几方 面 ： (1)外源 SA诱发植物积累病程相关蛋白 (pathogenesis—related proteins，PRs)并产生抗病 性。外源应用 SA可诱发烟草、黄瓜、马铃薯、 菜豆、豇豆、水稻和拟南芥等多种植物积累 PRs，并产生对真菌、细菌、病毒等多种病原物 的抗性【2,6,7J。 (2)表现抗病反应的植物体内积累 SA， 且这种内源 sA的积累先于PR基因表达和抗 病性的产生。以"ISfV诱导接种烟草，抗性品 种植株的基部接种叶中 SA含量增加 20—50 倍，上部未接种叶中SA含量也增加了5～10 倍 J，且增加后的 SA量足以诱发 PRs的积累 和抗病性的产生【9,io]，SA的增加先于 PR．1 基因的表达及抗病性的产生。而在感病品种 中则投有观察刊 sA的增加、PR-1基因的表 达及抗病性 的产生 J。在诱导接种 的黄 瓜【11． 和拟南芥【7,13]中也观察到类似现象， 说明植物体内 SA水平与植物抗病性的产生 密切相关。 (3)转基因烟草和拟南芥实验证据。水 杨酸羟化酶(E．C．1．14．13．1)能催化 sA转化 成儿茶酚。恶臭假单胞菌( rⅫ pl‘出 血)中的 nahG基因编码此酶。Gaff~ey等 14 构建了能结构性表达 nahG因的烟草植株(下 称 №hC植株)，这种转基因植株表达了太量 酶蛋白，即使受到病原物诱导接种也不能积 累SA，上部未处理叶片不能积累 PR-1，也不 能产生抗性。表明 SA是植物产生系统性获 得抗病性(systemic acquired isLance，SAI1．)所 必需的。以 N日hc拟南芥植株为材料的实验 结果同样支持这个结论。后来还发现，NahC． 烟草和拟南芥植株不仅不能被 TMV诱导产 生 SAR，而且导致产生比一般感病植株更强 的感病性(表现为形成更大的病斑)，甚至导 收稿 19974)4-21 修定 1997-09-94 1 国家 自然科学基金和浙江省 自然科学基金资助项 目。 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 34卷 第 4期，1998年 8月 致正常情况下应产生的基因对基因遗传抗性 的丧失。如含抗病基因 2的 nahG转化型 拟南芥植株叶片上接种含与之相对应的无毒 基因 锄 2的丁香假单 胞菌番茄致病型 (Pseudomonas pv．tomato DC 3ooo)~， 不仅不能限制病菌的生长，反而表现出更严 重的病症；而不转化 nahG基因的野生型植株 接种后则迅速形成很小的褪绿斑，限制病菌 的生长，表现出抗病性。而且，NahG植株无 论遇到真菌、细菌还是病毒性病原均表现出 比野生型更强的感病性。说明 SA的积累不 仅是诱发植物 SAIl所必需，而且是限制毒性 病原物的生长和表现基因对基因遗传抗性所 必需 。 近来以 NahG植株为材料，许多抗性 诱导因子通过积累 SA的途径诱导植物产生 抗病性。如以下香假单胞菌番茄致病型诱发 拟南芥对霜霉病的 SAIlE ，从疫霉菌 Phy- tophthora中提取到的蛋白性诱导物 elieitin诱 发烟草对疫霉病的SAIl[ J，硫胺素诱发烟草 对 T[tt~V的抗性H 等都必须经过积累 SA这 一 途径 。 NahG植株的构建为研究 SA在植物抗病 性中的作用提供了强有力的实验材料，得出 的上述实验结果也是目前证明 SA在植物抗 病性中起重要作用的最有力证据。 2 SA是否是诱发植物 SAIl的可传导的原 初信号(primary Wansloeated 辨 l}? 以坏死型病原物接种或其他诱抗因子处 理植株下部叶片，上部未处理叶片也能获得 对二次接种病原物的抗性 ，这种抗病性即系 统性获得抗病性(SAR)。Ross[ 在 6o年代就 假设植物体内存在一种能诱发 SAlt的系统 性信号。到 80年代，Dean和 KucLl9 通过植株 茎韧皮部环割及嫁接实验，进一步证实 Ross 的假设，并指出这种信号产生于诱导处理叶。 经韧皮部传导到上部未处理 叶。而后诱发 SAR。 SA物理学特性结果表明，SA极适 于在植物韧皮部 中进行长距离转运【20 J。人 们因此认为，SA是作为信号分子来完成其在 SAlt中的作用。然而，SA是否产生于诱导处 理叶，后经韧皮部传导到未处理叶，并诱发 SAIl原初信号?对这个问题回答尚有分歧。 一 种意见认为 SA不是上述那种原初信 号。主要代表为美国的 John RyalsE ”。他们 以NahG植株(诱导后不积累 SA，以 N表示) 和野生型抗病品种烟草(诱导后积累SA，以x 表示)分别作为接穗和砧木进行嫁接试验，设 计了4个组合，即 N／X、X／X、N／N、X／N(接穗 ／石占木)。可以设想，若 SA是诱发 SAIl的可 转运的原初信号，则以 'I?dV诱导接种砧木 后，以野生型植株为砧木的组合 N／X和 X／X 接穗部应表达 PlR．1基因并产生 SAIl；而以 NahG植株为砧木的组合 N／N和X／N接穗部 则不表达 PR-1基因也不产生 。然而试 验结果并非如此。无论砧木为何种类型，凡 以野生型植株为接穗的组合即 X／N和 X／X 的接穗部均在 TMV诱导接种砧木后表达 PR。 l基因并产生 SAlt，而以转化型植株为接穗形 成的组合 N／N和 N／X的接穗部则在 TMV诱 导接种砧木后不表达 PR-1基因也不产生 SAlt。由此他们断定，SA不是诱发 SAR的原 初信号，但它是诱发 SAIl的必需成分。 这一结论与 Rasmussen等_12 J的黄瓜摘叶 试验结果相符。他们发现，诱导处理叶只需 在诱导处理后保留 4—6h，然后摘除，上部未 处理叶即能产生 SAlt，但只有在诱导处理 8h 后，SA才能在诱导处理叶上部的韧皮部提取 液中检测到。故他们认为 SA不是诱发 SAIl 的原初信号。 以美国 Raskin[筮 和瑞士 M tr丑u)【[23 为代 表的学者则认为SA就是诱发植物 SAIl的原 初信号。Raskin等研究发现，催化苯甲酸形 成 SA的酶——苯甲酸。2_羟化酶是一种细胞 色素 P450单加氧酶。利用其以 作底物的 特性，可通过 标记新合成的 sA。结果发 现，以TMV诱导接种烟草植株下部叶片后． 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 34卷 第4期，1998年 8月 上部未处理叶中69％新增加的SA来 自下部 诱导处理叶，并且上部未处理叶中 SA增加最 多的叶片是与诱导接种叶维管束系统最直接 相连的第八叶。证明上部未处理叶中 SA大 多为产生于诱导接种叶并经韧皮部转运到上 部的。此外还发现，若把 TMV诱导接种叶在 接种后 60h摘除(此 时接种叶尚未能积累 SA)，则上部未处理叶也不能积累SA，因而不 能积累PR．1和表达SAR。这与 RaSlTILIfsen等 的黄瓜摘叶试验结果完垒相反。根据上述试 验结果，Raskin等判定 SA就是诱发 SAR的原 初信 号，至少在 烟草．TMV系统 中确 是如 此 MetratLx等【 J以“c标记苯甲酸的来 标记新合成的 SA。将“c标记的苯甲酸注人 黄瓜子叶，黄瓜子叶用 TNv诱导接种后 2d， 植株上部未接种的第一片真叶即能检测到 c标记的 sA，而 c标记的苯甲酸在接种后 3d内均未能在韧皮部中检测到。说明第一 片真叶中新合成的 sA是由诱导接种叶合成 并经韧皮部向上转运而至的，而不是利用由 接种叶转运而至的苯甲酸在上部未处理叶中 合成。另外，第一片真叶中 sA的积累(接种 后 2d)先于 SAR的产生(诱导接种后 3d)。这 一 结论与 RaSlTI~ 等l1 的恰好相反。他们 认为，Rasmussen等未能在产生 SAR前检测到 韧皮部中sA含量的增加是因为他们的检测 手段——薄层层析色谱法灵敏度不够高之 故。因此，不能排除 SA是诱发 SAR的原初 信号的可能性。 用病原物诱导处理后，植物将作出十分 复杂的一系列反应。不同植物．病原物系统 可能产生完全不同的反应，因此，sA到底是 否是诱发植物 SAR的原初信号，尚有待于更 多抗性诱导因子．植物．病原物系统的验证。 3 SA的作用机制 sA在植物抗病性中的作用机制也是近 年来的研究热点。Chela等[24,25]从烟草组织 细胞中分离并纯化到一种水溶性 sA结台蛋 白(SA．binding protein，SABP)。对 纯 化 的 SABP及编码其亚基的cDNA克隆序列的分析 结果表明，SABP是一种过氧化氢酶 J。SA 能抑制过氧化氢酶的活性 ，提高 浓度。 转化编码过氧化氢酶基因反义 RNA的烟草 植株中，过氧化氢酶蛋白量及 PR．1蛋白量均 明显降低，因SA结合而导致过氧化氢酶活性 降低 的程度 与植株抗病 能力呈显著负 相 关l2 J。除烟草外，在其它植物如黄瓜、番 茄、拟南芥中也存在类似的可被 SA结台并抑 制其活性的过氧化氢酶[28J。N．乙酰半胱氨 酸、 抗坏血酸等抗氧化剂的应用，抑制 SA 诱发植株中 PR．1基因表达能力 J。因此， Chen等认为 SA通过抑制过氧化氢酶活性． 提高 H202的浓度，而 02及由它转化而成 的其他形式活性氧作为第二信使，活化防卫 基因的表达，从而诱导植物产生 SAR。 然而John Ryals等的实验结果不支持这 个结论。若 02作为 sA诱发SAR的第二信 使，上部未处理叶表现 sAR前必定有 H202的 积累。但 Rvals等在检测到PR．1积累和 SAR 产生之前未能检测到 02的积累。而注射 可诱发 SA积累，且积累幅度与 02应 用浓度呈正比。这些结果表明，SA不是通过 积累 02的途径诱发 SAR，恰恰相反，H202 是通过积累 SA的途径诱发植物抗病性，即在 以产生 SAR为终点的信号传导链中，SA作用 位置在 02的下游[30J。Raskin实验室 、 Metrattx实验室[13,32 J及 Bi等【33 J的实验结果进 一 步证实了这个结论。 事实上，后来 Chela等 自己也修正、补充 了以前的假设。他们后来研究发现，SA除了 能抑制过氧化氢酶的活性之外，还能诱导脂 过氧化，产生的脂过氧化物能诱发 PRs积累 和抗病性的产生，并且 SA抑制过氧化氢酶活 性的过程与诱导脂过氧化的过程是相互偶联 的。因此，虽然 SA与 SABP结合并抑制过氧 化酶活性本身不能直接诱发 PRs的积累和抗 性的产生，但它可以上述方式间接地起作用 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 34卷 第4期，1998年 8月 (Catmn Z，私人通讯)。虽然对 SA是否通过抑 制过氧化氢酶的括性，提高 浓度并作为 第二信使的途径诱发植物产生 SAR尚有意 见分歧，但都认为，SA可通过这条途径诱发 局部抗性(即诱导处理部位的抗病性)。 最近，Shirasu等 发现，大豆悬浮细胞 中极低浓度 SA(1×10～ ～1×10一 mol·L一 ) 即可显著增强无毒病原丁香假单胞苗大豆致 病型(Pseudomonas y)7~ ae pv．glycima)对防 卫相关蛋白、 累积和过敏性细胞坏死的 诱导作用，这种增强作用是直接的(不需合成 新的蛋白因子)和迅速的(不需与悬浮细胞的 预共培养过程)，一旦遇到病原物，SA即可迅 速启动强化机制。但同浓度 SA对毒性病原 对细胞防卫反应诱导作用的增强远不如对无 毒病原那样强烈和持久，且该研究系统为细 胞悬浮液。因此，在植株上SA能否起相同作 用 ，这种作用在植物抗性产生中的意义，尚需 进一步研究。 4 植物体内SA的代谢 SA在植物体内的合成代谢途径现已基 本明确(图 1)。 甲基木扬酸( )^ 图 1 SA在植物体内的合成代谢途径【删 SA是通过苯丙烷类代谢途径合成的。 催化 SA合成的关键 酶是苯甲酸．2．羟化酶 (BA2H)，此酶 J】If 为 160 000，是可溶性细胞 色素单加氧酶。它在烟草中可被 TMV接种 或注射苯甲酸所诱导，而被 CO及其他细胞 色素 P450羟化酶抑制剂所抑制L36J。但在合 成过程中如何由反式肉桂酸脱羧甲基形成苯 甲酸尚不清楚 J。 在烟草中，SA主要转化为水杨酸葡糖苷 (SAG)，催化此转化反应的酶为尿昔二磷酸： 水杨酸葡糖基转移酶(GI )，该酶需尿苷二 磷酸葡萄糖提供葡糖基。烟草中 GTase的 M 为47 000，等电点(pJ值)为4．5L玎。；而燕 麦根中 J】If 则为50 000。它们都在细胞质中， 高度特异性地以SA为底物。sA在转录水平 上诱导该酶的活性 J。一般认为，SA在体 内形成 SAG主要起解毒作用，因为高浓度 sA 对植物细胞产生毒性。SAG也可能作为 SA 的储存形式，它本身不能诱发 PRs和抗病性， 但它可通过 B_葡萄糖苷酶水解形成 sA，从而 诱发抗性。然而在水稻叶片中存在高浓度的 SA，且都 以游离形式存在，很少形成 SAG。 经测定 ，水稻 GTase活性确与烟草中相似，具 体原因尚不得而知I38J。sA在体 内除形成 SAG外，也可转化为水杨酸葡萄糖酯，但形成 量极少 。 值得注意的是，SA在烟草组织内还可形 成大量的甲基水杨酸酯(MeSA)。MeSA具挥 发性，TMV接种后烟草组织 MeSA迅速大量 产生。经 TMV接种的烟草由32 转到 25 后，组织中 MeSA比不接种的对照植株增加 1O倍。抗病品种烟草植株在 MeSA中放置 24h后，组织内 SA增加 5o倍。即使低浓度 MeSA气体的外源处理也 能在 48h内诱发 PRs积累及抗病性的产生。叶片中 SA的增 加先于 PRs的积累，因此，MeSA很可能作为 ～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 34卷 第 4期，1998年 8月 301 一 种信 号分子在烟草抗病性 中起重要作 用[ 。 上述 SA的合成和代谢途径主要来 自烟 草中的研究结果，至于在其他植物中是否如 此尚待进一步检验。 5 SA信号传导途径 目前对 SA信号传导途径的研究主要集 中于信号途径各组成因子的鉴定。采用的方 法和获得的结果主要有： (1)通过分子生物学手段鉴定对 SA信 号作出应答必需的顺式作用元件(c／s—acting elernehis)和反式作用 因子 (trar~．acting fac． tom)。研究发现，编码烟草 PR．1a、PR-2b、PR一 2d、PR-5、富古甘氨酸蛋白、拟南芥 PR-3的基 因的启动子均为 sA诱导性启动子，其 中以 烟草 PR-la启动子的研究最为广泛。不同研 究L40-43 J均认为，PR-la启动子中位于 一300 一 700bp区域内的至少一个元件是保持对 SA诱导作出高灵敏度反应所必需的。PR-la 的调节机制是相当复杂的。Hagiwara等 认 为它是通过位于一37一一61和 一168一一179 的 2个元件及其结合蛋 白反向调 控的；而 Van de Rhee和 Bol[45 则认为 PR．18启动子至 少包含 4个调节元件，其中元件 1、2、3起正 向调控作用，而元件4则起保证其他 5 端元 件与起始转录位点之间保持正确空间分布的 作用。 对 PR-2基因的启动子也有了一些研究。 Hennig等L 发现 PR-2d启动子中保证对 sA 诱导作 出高灵敏度反应的顺式元件位于 一 321一一607，且在 一318一一607区域至少 有 2个正向调节元件。Van de Rhee等[47J则 发现，PR．2b启动子的 侧约 3oobv区即可保 证对 SA诱导作出低灵敏度反应，但 5 侧另 外35Obp区是保证对 sA诱导作出高灵敏度 反应所必需的。对其它防卫基因启动子也有 人作过类似的研究，但远没有像对 PR．1a和 PR-2基因启动子那样研究得广泛。 (2)通过诱变筛选方法确定 SA信号传 导途径的组成因子。拟南芥被认为是研究植 物体内包括 SA在内的各种抗病信号传导途 径的模式植物。目前已在拟南芥上鉴定多个 影响抗病性表达的基因l柏J，这些基因的克隆 及其功能分析也在进行之中。现已筛选到 3 种拟南芥突变体 sai1( cyuc acid-insensi— tire)L 、r,prl(nonexpreaa,er of PR genes) 和 n／ml(non．inducible imaunity)I51j，它们不能被 SA等诱导因子诱发抗病性。突变体 sa／1和 rdml可被正常诱发积累 SA，但不能被诱发 表达 PR基因。因此推测野生型中 SA／1和 N／M1基因在 sA诱发 PR基因表达中起正调 控作用。最近，N／M1基因已被克隆，发现其 产物 NIM1蛋白序列同源于哺乳动物转录因 子抑制子IxB亚组 a j，表明转录因子NF-KB 在拟南芥 中起抑制 PR基 因表达 的作用， NIM1蛋白与其结合后，阻止其进入细胞核 内，从而解除其对 PR基因表达的抑制作用， 使 PR基因得到表达。 (3)以不同的化学诱抗剂通过化学和生 物化学的手段来分析 sA信号的传导途径。 化学诱抗剂的种类非常广泛，用它来分析 SA信号的传导途径有以下几个优点：首先， 有些诱抗剂可诱导 sA的积累，这种诱发方 法排除了直接应用 SA所产生的干扰。其次， 目前用得最多的抗病性诱导因子是能诱导产 生坏死斑 的病原物。然而当植物识别它们 时，植株体内会同时活化多种不同的信号传 导途径，其复杂的反应不利于 sA信号传导 途径的研究。而化学诱抗剂通常不会引起如 此复杂的反应。还有，不同的化学诱抗剂在 信号传导链中的人 口不同，这使它们成为通 过生化方法研究信号传导途径的有力工具。 多种不同种类诱抗剂的诱抗过程分析，将构 建出诱发 PR基因表达和抗性产生的生化图 谱，这样有利于 sA信号传导途径的研究。 另外，可以运用不同的诱抗剂来筛选新的突 变株，作为对遗传学筛选方法的补充。 6 结语 SA在植物抗病性中的作用至 90年代初 才引起真正关注。晟近几年来关于植物体内 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 卷 第 4期，1998年 8月 SA水平的调控途径、SA在植 物抗性 中所 起 的作用及其机制、SA信号传导途径等方面的 研究虽已取得重大进展，但仍有许多方面尚 待进一步研究。 (1)虽然可以肯定 SA在诱发 SAR中起 着重要作用 ，但 SA是否产生于诱导处理叶 井作为诱发 SAR的可传导的原初信号，尚有 待于更多的植物．病原系统的研究和验证。 (2)关于植物体内 sA水平的调控机制， 一 方面应在现有生化研究的基础上采用分子 生物学方法，进一步验证关键酶如 BA2H、 GTase等对 SA水平的调控作用，另一方面对 SA各种代谢产物的种类及其在诱发植物抗 病性中的作用也应作更深入的研究。 (3)现已明确 SA可由植株诱导处理叶 产生并经韧皮部转运至未处理叶。但对细胞 间的 sA转运机制、sA在细胞内的分布及其 被诱导刺激后向细胞外的转运机制尚缺乏研 究。 (4)SA信号传导途径的研究尚处于起步 阶段，途径中各组成因子亟待鉴定。以植物 寄主和病原物相互识别为起点、以产生抗病 性为终点的信号传导途径是非常复杂的，它 很可能由包括 SA信号传导链在内的许多条 信号传导链相互交织形成一个网络状的系统 结构。sA信号传导链在其中所处的位置，以 及与其它信号传导链如伤 口等之间的关系都 有待研究。 (5)sA除调节植物抗病性之外，还参与 植物的开花、产热、气孔关闭、种子发芽等多 种生理过程的调节。这些过程的调节机制有 何异同点，植物如何利用 sA有机协调控制 这些生理和病理过程 ，也是一个非常有意义 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叶片衰老是一种受遗传和内外界因子 (如高温和干旱等逆境、日照长短、生殖库、激 素、遮荫、病害)影响的、高度有序的程序化过 程。以往人们对叶片衰老的形态、结构、生理 生化等方面进行了广泛深入的研究，并取得 不少成就，但在分子水平上对叶片衰老的本 质、调控了解仍较少L 。近几年．植物分子 生物学技术，尤其是 rnR—A检测技术如 No ． ∞ blot、差示筛选(differential screening)、减式 杂交(substractive hybridization)等的迅速发展 和渗透，使人们可以在基因水平上对叶片衰 老的本质、规律等方面进行研究。叶片衰老 分子生物学研究进展迅速．现已成功分离、克 隆出30多个与叶片衰老相关的基因，并对其 表达、调控进行了初步研究，尤其是通过分子 遗传手段延缓某些植物叶片衰老的成功，显 示出诱人的前景。这方面的研究 已成为植物 衰老研究的前沿和热点。本文简要介绍叶片 收稿 1997-1~91 1 国家自然科学基金资助项目。 维普资讯 http://www.cqvip.com