雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素(sBD-1)表达的影响

动物学杂志ChineseJourn越ofZoo／ogy2008，43(4)：41—47 雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内 B．防御素(sBD一1)达的影响 李淑凤① 曹贵方①+ 宋艳华① 姜丽萍② 郭宏儒① 邵艳红① (①内蒙古农业大学动物科学与医学学院 呼和浩特010018；⑦内蒙古医学院基础医学院呼和浩特010059) 摘要：为了探索雌二醇与p-防御素(sBD．1)表达量的关系，体外模拟蒙古绵羊(侥心口砌)生理周期．用添 加雌二醇浓度10“1、10“o、10一、10～、10～、10。mol／L的培养液及不添加雌二醇的培养液(即对照组) 分别培养蒙古绵羊输卵管上皮细胞，作用24h、48h、72h后，提取细胞总RNA，应用SYBRGreenI荧光定 量RT-PCR法进行定量。结果显示．添加不同浓度雌二醇培养的输卵管上皮细胞中sBD-1的相对表 达量O．000740—0．001758，与对照组0．000190之间差异显著(P<0．05)，且小于10‘8mol／L雌二醇添加 浓度与sBD．1基因相对表达量变化基本呈正相关。此结果为进一步研究雌激素参与机体防御功能奠定 了基础。 关键词：雌二醇；绵羊阻防御素．1(sBD—1)；基因表达量；输卵管上皮细胞；蒙古绵羊 中图分类号：Q492文献标识码：A文章编号：0250．3263(2008)04-41．07 EffectsofEstradiolontheExpressionofI$-Defensin-1(sBD一1)in EpithelialCellsofFallopianTubesintheMongolianSheep LIShu—Feng①CAOGui—Fang①‘SONGYah．Hu—JIANGLi．Ping⑦ GUOHong．Ru①SHAOYah．Hong① (①College矿AnimalScienceandMedicine．InnerMongoliaA咖-ulturalUniversity，Hohhot010018； ②SchoolofBadeMedicalSciences，InnerMongdiaMedical岛如酽，Soh／协010059．‰) Abstract：FallopiantubeepithelialcellsoftheMongolianSheep(D￡括甜协)we托culturedinthemediumcontaining estradi01．Concentrationofestradiol惴10一”，10一”，10一，10一，10～，10～or0mol／L．Afterculturingfor24， 锅．and72hours，totalRNAwa$extractedandthecDNAencodingsBD-IWagamplifiedbyRT-PCR，respectively． TheresuhsshowthatsBD-1expressioninFallopiantubeepithelialcellsisevidentlyaffectedbyestradioltreatment． Thereisapositivecorrelationbd}’啪nsBD-1expressionandestradiolconcentrationwhenthehormoneisaddedless than10—8mal／L．whilesBD．1expressionisdecreasedwhenestmdiolconcentrationisn∞陀than10—8mol／L．The dataa地veryimportantforunderstandingtherelationbetweenesmaliolandthedefensin． Keywords：Emadiol；Sheepp-defensin-1(sBD-I)；Geneexpressionlevel；FallopiantubeepithelialceH；Mongolian sheep 抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要 组成成分n。3，在动植物界广泛存在，具有广谱 抗菌活性‘引。体外实验证明抗微生物肽可抗多 种病原微生物，如革兰阴性和阳性细菌、分支杆 菌、霉菌、螺旋体、被膜病毒掣引；同时病原微 基金项目 国家自然科学基金项目(No．30460093)； *通讯作者，E-mail：印i细l窖c∞@126．eom； 第一作者介绍李淑凤，女，硕士研究生；研究方向：动物组织 胚胎发育与分子生物学；E—mail：shufeng]i33@126．咖。 收稿日期：20084P-4)I，修回日期：2009-04-28 万方数据 ·42· 动物学杂志ChineseJournalofZoology 43卷 生物保守分子，如革兰阴性细菌的LPS、革兰阳 性细菌的磷壁酸、RNA病毒的双链RNA，提供 刺激信号，诱导内源性抗微生物肽的合成。不需 要细胞的增殖和分化，远比特异性抗体及细胞 介导的获得性免疫反应来得简单和快速，可在 感染后数小时内发挥其阻遏、延缓或消除病原 微生物的作用b1；而且内源性抗微生物肽具有 特殊的抗性机理，即它们主要作用于病原微生 物的细胞膜，病原微生物不易对其产生抗性。 基于上述特点，内源性抗微生物肽一直是国内 外学者研究的焦点。2006年，Seebah等构建了 抗菌肽家族的防御素数据库(网址为http：／／ defensins．bii．astar．edu．sS／)№1，收集了350多个 防御素的序列、结构和活性信息，为抗菌肽的研 究提供了极有价值的数据资源。 B．防御素是一类新发现的富含半胱氨酸的 抗微生物肽，其分子内含有由6个半胱氨酸残 基形成的3对二硫键，广泛分布于哺乳动物和 鸟类的上皮组织及白细胞内"1。大量实验已证 明，p．防御素是雌性生殖道天然免疫的重要组 成部分，1998年，Bals【81报道鼠(Musmuscu／us)的 p防御素存在于雌性生殖道的上皮细胞内，并 且起抗菌作用；Quayle掣刮研究了人(Homo sapiens)防御素5在雌性生殖道的基因表达、免 疫定位及分泌；黄宁掣10’发现人子宫颈黏膜能 分泌抗菌多肽，其中B．防御素在子宫颈抗菌机 理中发挥重要作用。2002年，Wiesenfeld等⋯1 研究了中性粒细胞防御素水平的提高与子宫内 膜炎的关系，提出当盆腔受到感染时，病人的生 殖道内中性粒细胞防御素水平比盆腔没有被感 染的正常人要高。2003年，King等¨21系统研究 了自然抗菌肽p防御素3(HBD3)、p防御素4 (HBD4)在人子宫内膜的差异表达。2004年， Yenugu等¨31研究发现，人的附睾分泌的蛋白中 有一种新的p防御素DEFB．118，且DEFB．118 是一种精子结合蛋白，通过抑菌试验证明随着 时间和剂量的增加其抗菌活性也增加。以上研 究表明，人及鼠的生殖系统由于其特殊的生理 功能，能够形成黏膜屏障，此屏障具有先天性免 疫功能，也具有保护生殖健康的功能。 关于生殖道口．防御素的研究主要涉及人 类、小鼠，国内外对家畜、反刍动物生殖道防御 素研究较少。本文主要研究绵羊p防御素1 (sBD．1)，实验通过体外模拟蒙古绵羊(Ov／s aries)生理周期，在无菌条件下，添加不同浓度 的雌二醇，培养输卵管上皮细胞，根据GenBank 中已知的sBD．1eDNA序列合成引物，利用 荧光定量RT．PCR技术定量检测sBD．1基因相 对表达量变化，进而探索雌二醇与sBD．1基因 相对表达量变化之间的关系。 1材料与方法 1．1材料成年、健康状况良好的间情期雌性 蒙古绵羊，由呼和浩特市回民屠宰场提供。绵 羊屠宰后立刻割取输卵管组织，放人生理盐水 中备用。 1．2主要仪器设备及试剂 1．2．1仪器设备Eppendorf5417R低温高速 离心机，德国生物公司生产；TC一100PCR仪、 DNAEngineOPTICONCFD．3200，美国MJ生物公 司生产；DYY．Ill型稳压稳流电泳仪，北京六一 仪器厂生产；TanonGis．1000凝胶成像分析系 统，天能科技(上海)生物公司生产；37。C恒温 培养箱等。 1．2．2主要试剂DMEM／F12培养基、17．8-雌 二醇(No：E2758)购自Sigma公司；总RNA极速 抽提试剂盒FASTA6肼-RN‰(Cat．No．220010) 购自上海飞捷生物公司；SYBRExScript任RT- PCRKit(No：DRR041S)购自大连宝生物公 司。 1．3 PCR引物的设计与合成根据C,enBank 提供的羊sBD．1基因及内标基因p肌动蛋白 (p-actin)序列(U75250，AFlD35422)，用Primer5．0 设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成。 所用引物序列见表1。 1．4输卵管上皮细胞的培养 1．4．1输箩H管上皮细胞原代培养于无菌条 件下取蒙古绵羊输卵管，用0．1mol／LPBS(含双 抗)洗三次，然后用眼科剪刀剪开输卵管管腔， 0．1mol／LPIgS冲洗三次，用灭菌刮刀轻刮输卵 万方数据 4期 李淑风等：雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内B-防御素(sBD-1)表达的影响．·43‘ 管上皮细胞，将刮下来的上皮细胞吹打成单细 胞，1000r／rain离心10min，以1．0×105个／ml 的浓度接种于DMEM／F12培养液中。置于 37。C，5％co：培养箱中培养。约48h可贴壁， 每三天换液一次。 表1引物序列 Table1 Primersequence 1．4．2传代培养待原代的细胞80％汇合后 (约7d)，弃去培养液，用PBS洗一次，加入1：1 的0．25％胰蛋白酶：0．02％EDTA(Na)溶液，于 37℃消化5～15min，再加入含20％血清的培 养液终止消化，1000dmin离心8min，吹打成 单细胞，以1．0x1旷个／nd接种于新的培养皿 培养。传代细胞约24h可贴壁，3d后约有 80％聚集长满。 1．4．3激素添加量与作用时间待传代细胞 80％汇合后换无血清培养液。处理10h后，分 别换加含10～、10～、lO～、10一、10。10、10．11、0 mol／L雌二醇的无血清培养液，其中10一mol／L、 10一omol／L分别用来模拟生理状态下的发情期 和妊娠期，以上浓度依据赵伟等¨引文献提供的 羊发情周期和妊娠期外周血浆中雌二醇浓度添 加。各浓度分别培养24h、48h、72h，每隔24h 换一次培养液。 1．5上皮细胞总RNA的提取采用上海飞捷 生物公司的总RNA极速抽提试剂盒，按其说明 进行。最后用无RNA酶去离子水溶解RNA沉 淀，一70"C保存备用。 1．6荧光定量RT．PCR 1．6．1sBD．1基因的RT．PCRcDNA第一链的 合成参照TaKaRaSYBRE】【scnptTMRT-PCRKit 试剂盒说明书进行。RNA逆转录反应体系为 lOm：5×PrimeScriptBuffer(forRealTime)2出， PrimeScriptRTF抛ymeMix0．5m，OligodT Primer(50pmol／L)0．5m，Random6nler8(100 pmol／L)0．5脚，TotalRNA500ng，补加无RNA酶 水至lOm；反应条件：37℃15min，85oC5 8， 4℃保存，得到cDNA置于一20℃保存备用。 cDNA扩增反应体系总体积为20m：SYBR PremixEx呦僧10m，上、下游引物各0．5出， TemplatecDNA2础，无菌水7止。PCR反应条 件：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸208，72℃读板，80℃二次读板， 40个循环。PCR反应结束后执行熔解曲线测 定步骤。同时以不加的体系和RNA为模 板的体系作对照，以排除试剂污染和基因组 DNA污染引起假阳性的可能。PCR产物用琼 脂糖凝胶电泳进行检测。 1．6．2p-actin基因的RT．PCRRT．PCR反应体 系及反应条件均同于1．6．1。 1．6．3实时定量PCR扩增效率曲线制作将 cDNA以10倍浓度梯度进行稀释，分别做sBD．1 基因和t3-actin基因实时定量PCR扩增效率反 应，反应体系及运行程序同1．6．1，程序结束后 机器自动给出不同浓度下sBD．1基因及B-actin 基因PCR扩增效率曲线。 1．7 PCR产物序列测定定量PCR产物送上 海生工生物工程公司进行基因序列测定。 1．8 sBD-1基因的表达水平取1．4．3培养的 蒙古绵羊输卵管上皮细胞，提取RNA，进行荧光 定量PCR，且每个时间段、每个浓度的样品分别 重复3次，分别得到sBD-I基因和pactin基因的 ct值，根据公式2。6c‘m1求出添加不同浓度雌二 万方数据 ·44· 动物学杂志Ch／ne∞JournalofZoology 43卷 醇蒙古绵羊输卵管上皮细胞sBD．1基因的相对 表达量，其中ACt=Ctp-defensin—Ctp-actin。 2结 果 2．1细胞培养结果 准备培养的原代细胞形 态为圆形，细胞悬浮在液体中，极少数3—5个 聚集。培养48h后，细胞极少数聚集贴壁生 长。培养7d后细胞长成漩涡状排列的致密单 层细胞集落(图1)。传代细胞生长迅速，72h 后即可有80％以上聚集生长。 图l上皮细胞培养结果 Fig．1Epithelialcellsafterculture A．培养48h后上皮细胞形态。×16；B．培养7d的上皮细胞形态，×100。 A．EpithelialceLls48hafterculture，X16；B．Epithelialcells7dafterculture，x100 2．2 RNA及RT．PCR结果 RNA经琼脂糖凝胶电泳，成像系统显示清晰的 2．2．1RNA纯度及质量分析所提取的总 28S及18S条带，无明显5S条带降解(图2)。 图2输卵管上皮细胞RNA电泳圈 Flg．2TheofetectrophoretogramoftotalRNAinFallopiantubeepithelialcells 1—6．分别为添加雌二醇t0～、lO-。、10～、lO一、lO‘”、10“tool／L；7．不加激素的对照组；M．D12000DNA分子量标准。 l一6．Estradiol10一，10～，10～，10一．10一”，10’“tool／L；7．Controlgroup；M．D12000DNA]山trkt'r． 2．2．2标准品的鉴定以含有sBD．1及p-actin 基因片段的cDNA作为模板进行荧光定量PCR 扩增反应。产物经凝胶电泳显示条带清晰，片 段长度正确(图3)。经过测序证实其序列与 GenBank中sBD．1及8-actin基因序列一致。 2．3 sBD-1基因与Ibaclin基因的扩增曲线及 扩增效率曲线含sBD．1基因的标准品分别以 10倍等比稀释(稀释成4个浓度)后做定量 PCR，所得到的Ct值与不同浓度标准品的初始 模板量对数值之间具有良好的线性关系，并拟 合得出扩增效率曲线(图4)。结果可见，sBD—l 相关系数为0．994，B-actin的相关系数为0．992。 2．4雌二醇对输卵管上皮细胞内sBD-1基因 的相对表达量的影响 2．4．1sBD．1基因的相对表达量由表2可 知，添加不同浓度雌二醇，输卵管上皮细胞 sBD．1基因的相对表达量较对照组(即不添加 雌二醇培养的输卵管上皮细胞)均有所提高。 万方数据 4期 李淑凤等：雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内p防御素(sBD．1)表达的影响·45· 图3 sBD-I及p-actinPCR电泳图 隐．3 TheelectrophoretogramofPCRproductsofsBD-Iandp-actin 1．对照组；2—7．分别舔加雌二醇lO“、lO“、10一、10～、10-‘、10～mol／L；M．DL2000DNA分子量标准。 1．Controlgroup；2—7．Estradiol10一”，lO一”，lO一，lO一，10～，10一tool／L；M．DL2000DNAMarker． 图4肌动蛋白与防御素的扩增曲线和扩增效率曲线 Fig·4mamplificationcurveandtheamplificationefficiencycurveofp-fit'tingeueand}defensimgene ^．肌动蛋白扩增曲线；B．防御素扩增曲线；C．肌动蛋白扩增效率曲线；D．防御素蛋白扩增效率曲线。 A、B横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度；C、D横坐标为循环阈值，纵坐标为初始模板量对数值。 A．TherealtimePCRamplificationcurveof争actingene；B．TherealtimePCRamplificationcum0fpdefensingene； C．Theampli6cafiouefl3ciencycumofp-actingene；D．1'”amplificationefl3ciencycurve0f弘defensingene．A，BX-axisshowcycle； Y—axis8IⅪ-fluorescence；C，DX-axisshowCTcycle；Y．axisshowtosquantity0fortgin-lsample． 万方数据 ·46· 动物学杂志ch／neseJournalo／Zoology 43卷 其中添加雌二醇10’8mol／L的输卵管上皮细胞 sBD．1基因相对表达量最高，而添加雌二醇 10。11mol／L的输卵管上皮细胞sBD．1基因相对 表达量最低，基本接近于对照组。 表1添加不同浓度雌二醇对sBD-I 基因表达的影响 Tablel 11leinfluenceofdm他ntconcentrationsof estradiol彻sBD-Iexpression 2．4．2雌二醇与细胞内sBD．1基因相对表达 量的关系 用SAS9．0统计软件分析表2数 据。在P<0．05水平下，添加不同浓度雌二醇， sBD一1基因的相对表达量均有显著差异，其中 添加10“mol／L雌二醇与对照组之间差异极显 著，10。1mol／L雌二醇与对照组之间差异不显 著，其他浓度与对照组之间差异均显著，而且，3 个不同培养时间之间差异不显著。此外每个浓 度的3个重复之间差异不显著。结果表明，低 浓度的雌二醇与sBD．1基因相对表达量变化基 本呈正相关，但当浓度达到10。mol／L之后，继 续增加雌二醇浓度，sBD一1基因的相对表达量 不再增加，反而有所下降(图5)。 色墨1．50 ×霉 錾= 0．∞ 对照10。“ lo．‘o lo-9 lo．8 10。7 l旷 浓度Concenmuion(tool／L) 圈5雌二醇与细胞内sBD-I相对 表达量的关系 隐．5 Therelationshipbetweenestradloi concentrationandrelativesBINlexpression 3讨论 p防御素作为一类大量存在于哺乳动物上 皮组织内的内源性抗微生物肽，由于它们在非 特异性免疫反应中占重要地位，国内外研究者 非常重视其在感染免疫中的作用，其研究成果 有可能为一些重要的感染性疾病的防治开辟新 思路。 鉴于国内外对于反刍动物雌性生殖道B．防 御素研究比较缺乏，进行sBD．1相对表达量变 化及其与体内性激素之间关系的研究，对于探 索口．防御素基因工程表达的可行性，了解反刍 动物妊娠期间防御素表达调控的基本规律及在 机体防御功能方面的作用均具有重大的意义。 本实验与白萨日娜《孕酮对绵羊输卵管上 皮细胞p防御素表达的影响》’一文中讨论的 孕酮与sBD．1表达量之间的关系相辅相成，实 验结果表明，雌二醇与孕酮对生殖道sBD一1基 因相对表达量均有促进作用。低浓度的雌激素 接近于机体的生理状态，与sBD．1基因的相对 表达量变化基本呈正相关，但当浓度达到10。 moL／L之后，继续增加雌二醇浓度，sBD．1基因 的相对表达量不再增加，反而有所下降，推测大 ·白萨日■．孕酮对绵羊输卵管上皮细胞争防御素表达的影响 呼和拮特：内蒙古农业大学顿士学位论文．∞嘶． 万方数据 4期 李淑凤等：雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内p防御素(sBD-1)表达的影响·47· 剂量的激素可能破坏细胞内部代谢平衡。由此 得出，雌二醇在准备受精、妊娠期间大量分泌， 能够促进sBD．1基因表达量的增加，从而增加 机体抵抗力，保证怀孕过程的顺利完成。 本文为进一步研究雌性动物体内性激素与 组织内|3．防御素的相对表达变化提供了理论依 据，为动物生殖免疫学与内分泌学等方面的进 一步研究奠定了初步基础，但是体内多种性激 素对阻防御素相互作用产生的影响、性激素对 8-防御素的影响机理、防御机制中还有哪些蛋 白起到防御作用，以及各种蛋白之间的相互作 用机理还有待于进一步研究。 参 考文献 [1】 [2] 【3】 [4】 [5] [6] BotllnnHG．Peptideantibioticsandtierroleininnate immunity．概届"Immuno／AsmRevlmmund，1995，13： 6l一92． 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Gui-Fang,SONG Yan-Hua,GUO Hong-Ru,SHAO Yan-Hong(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特,010018)， 姜丽萍 ,JIANG Li-Ping(内蒙古医学院基础医学院,呼和浩特,010059) 刊名： 动物学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF ZOOLOGY 年，卷(期)： 2008,43(4) 被引用次数： 1次 参考文献(16条) 1.Boman H G Peptide antibiotics and their role in innate immunity[外文期刊] 1995 2.Ganz T;Lehrer R I Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia[外文期刊] 1997(4) 3.Thouzeau C;Maho Y L;Froget G Spheniscins:avian β-defensins in preserved stomach contents of the king penguin,Aptenodytes patagonicus[外文期刊] 2003 4.Ganz T;Lehter R I Defensins[外文期刊] 1995 5.Meddutov R;Janeway C A Innate immunity impact:on the adaptive immune response[外文期刊] 1997 6.Seebah S;Suresh A;Zhuo S Defensins knowledgebase:a manually curated database and information source focused on the defensins family of antimicrobial peptides 2006 7.Lehrer R I;Ganz T Endogenous vertebrate antibiotics:defensins,protegrins,and other cysteine-rich antimierobial peptides[外文期刊] 1996 8.Bals R;Mitchell J Mousee β-defensin-1 is a 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