急性白血病的诊断和分型

null急性白血病的诊断与分型急性白血病的诊断与分型陆道培血液.肿瘤中心 童春容 Tongcr.21@163.com 13601301042 正常血液/免疫细胞发育过程正常血液/免疫细胞发育过程白血病的定义白血病的定义 白血病是一组造血干/祖细胞恶变导致分化阻滞、凋亡障碍的异质性恶性肿瘤性疾病。绝大多数表现为骨髓(BM)和/或血液(PB)中的恶性造血系统或免疫系统细胞增加。 急性白血病为原始恶性造血细胞明显增加的疾病。一般表现为乏力、面色苍白等贫血症状，出血，发热等感染症状，白血病细胞浸润导致多部位肿块、肿胀等症状；起病快，从发病到就诊一般数天至一个月 造血干/祖细胞恶变还可导致恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS), 这些疾病有时候难以和白血病鉴别，有些淋巴瘤、MPN、MDS和白血病仅仅是数量的差异，其疾病性质相似。如淋巴母细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的差异主要是后者骨髓或血液恶性原始淋巴细胞25%，其治疗原则和一致。 世界卫生组织将造血干/祖细胞恶性肿瘤统一进行分类（见附表）。 白血病分型的发展历史白血病分型的发展历史 FAB分型: 1976年首次提出，1980、81、85、91年逐步完善。以细胞形态学及细胞化学染色 AML: M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7 ALL: L1、L2、L3 3 WHO分型: 1995年开始，分别于2001、2004、2008年修订 。联合细胞形态、细胞化学、免疫学、染色体、FISH 、基因、组织病理及免疫组化急性白血病诊断的要求急性白血病诊断的要求 全面正确诊断与分型 评估预后 确立检测MRD的标志，追踪MRD 指导个性化治疗： 了解危险分层； 发现靶向治疗标记； 发现抗原丢失、克隆演变或突变 帮助确定病因或发病机制MICM整合诊断技术MICM整合诊断技术 M: 形态学、细胞化学、病理 I: 免疫学，包括免疫组化、流式细胞分析 C: 染色体、荧光标记探针的原位杂交(FISH) M: 分子生物学：白血病融合基因、基因突变、克隆性基因重排、正常基因表达水平过高诊断与分型诊断与分型 形态或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%；病理对及免疫组化对诊断伴骨纤的患者具有重要价值 在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上； 染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率nullnullnull细胞形态及细胞化学分析的优缺点细胞形态及细胞化学分析的优缺点 直观：直接观察细胞形态，对MDS的诊断、一些少见的、大的恶性细胞的确定优于FCM 细胞一般是第一针标本，很少稀释，几乎未处理，因此恶性细胞的比例更准确 经济、快速 人为因素影响大：仅根据形态学诊断急性白血病，FAB专家的一致率仅50-70% 难以鉴别细胞的成熟阶段，B、T等系列的恶性细胞 细胞较成熟时，难以鉴别良恶性 预后价值不太大null树脂切片：红系增生活跃，原早（部分细胞体积偏大）阶段细胞可见小堆，中晚阶段细胞可见小片状分布。 nullGomori：++++null石蜡切片IHC: CD61染色提示小巨核细胞异常增生，且存在聚集现象（MDS特征性改变之一）。nullCD235a染色提示红系成片状增生 MDS伴骨髓纤维化null病理及免疫组织化学的优缺点 标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、MM、淋巴瘤、转移癌、组织细胞、巨噬细胞、树突细胞、何杰金细胞等 可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位 诊断慢、受诊断者个人经验及知识水平影响大 对一些组织结构无破坏、细胞形态改变不大的细胞，难以鉴定良恶性及成熟度 有些恶性细胞在液体中，难以获取组织标本，难以判断组织结构FCM的FCM的工作原理摘自 Flow Cytometry: First PrincipleFCM检测的参数FCM检测的参数 FSC: 细胞大小 SSC:细胞内颗粒多少及细胞内构造的复杂性 FL：3-10多种 正常BM细胞的图形：SSC按对数收集正常BM细胞的图形：SSC按对数收集病例二(本院）病例二(本院）nullFCM 的优缺点 一次可检测数万至数十万个细胞上的数十种标记，可同时检测每个细胞的六个以上参数，敏感性高，分析全面 更容易区分良恶性，恶性细胞的系列及成熟度 可帮助确定免疫治疗的靶点并监测疗效，如CD20、CD19、MHC分子等。是监测MRD覆盖面最广的方法。 快速、简便、重复性好 不能确定组织结构，一些罕见的大细胞不能分析到，一些细胞粘附性高，难以抽出。因此对HL等难以确诊。 染色、洗涤等细胞处理中会损失一些细胞，尤其是DLBCL、幼稚红细胞，因此有时判断恶性细胞的比例不如形态准确，对M6、MDS的诊断不如形态 预后价值不如染色体和基因nullnull 可以发现很多未知基因的染色体异常 有独立的诊断及预后价值 诊断时间长 高度依赖诊断人员的丰富的技术、经验及知识水平 如果恶性细胞不分裂，其结果是假阴性 由于分析的细胞少，多数白血病患者无染色体异常，监测残留白血病不敏感染色体的优缺点null 一些染色体有诊断价值: 如重现性染色体异常，如t(8;21)，inv(16)、他（16；16）、 t(15;17)（q22;q12），t(5;14)(q31;q32) ，t(3;3),t(4;11)可直接诊断急性白血病； 一些染色体和/或基因有辅助诊断价值，如5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY、P53 高度疑似MDS等； 有-7、5q-、 t(3;3)、t(4;11)、t(9;22)、复杂染色体等的急性白血病预后不好；染色体的诊断价值null 男，13岁，外院诊断为AML-M5,初治时无染色体结果。CR后在XX医院查AML1-ETO基因阳性，染色体46,XY[20]。 评估是否需做骨髓移植，遂查初诊时骨髓涂片FISH，是否伴-Y。结果：76%的细胞伴-Y，需移植。红色信号为：Y，绿色信号为：X；多数细胞中丢失Y信号null BCR/ABL阴性（信号类型：两红两绿） 患者，男，6岁，外院行BCR-ABL定性+诊断为ph+ALL, 未做染色体，化疗及格列卫治疗CR后来 我院。将初治的基因做BCR-ABL 定量0.59%. 将初治的BM片回顾FISHnull 有独立的诊断及预后价值 可以检测出显微镜下人眼难以分辨的染色体异常 诊断时间比染色体短 与染色体分析比较，对依断人员的经验依赖程度低 对不分裂的细胞也可以分析，分析的细胞数量比染色体多，更能反映正常和恶性细胞的比例，监测残留白血病比染色体敏感。 可以对既往的骨髓片回顾分析，进一步明确或排除诊断 探针昂贵，每次只能分析1-2种异常，只能分析已知的染色体或基因异常FISH的优缺点null31种白血病融合基因 (122种变异体) 筛查null 患者 正常与10%肿瘤细胞混合 正常 IgH基因重排结果测序图比较测序图比较李** KIT基因突变KIT基因野生型（WT）null 有独立的诊断及预后价值 可以检测出染色体或FISH不能检测出的异常，联合染色体和FISH，增加了对疾病预后的判断能力。 诊断时间比染色体及FISH短 与染色体及FISH分析比较，对检测人员的经验依赖程度低 是最敏感的监测残留白血病的指标 对试验设计、试验质控要求高 对无基因异常的疾病难以诊断 疾病是复杂的，仅有基因异常未必完全决定预后基因检测的优缺点急性白血病的诊断标准(WHO)急性白血病的诊断标准(WHO)ANC：全部有核细胞；NEC：除有核红细胞、浆细胞、淋巴细胞、 组织嗜碱细胞、巨噬细胞以外的有核细胞，主要包括粒细胞、单核细胞null BM穿刺干抽时，要进行BM活检印片、病理及IHC分析，当CD34+细胞>20%可诊断AML BM稀释可降低原始细胞，应结合多张涂片分类的结果报告 对多数AL的诊断，原始细胞不包括原红细胞，但纯红血病，不成熟的有核红细胞80%，以未分化或原始红细胞为主 伴BM纤维化的急性全髓性增生的原始细胞比例不定，诊断主要根据临床急性起病的高热、骨痛、全血细胞减少，发展迅速；BM病理显示在BM纤维化的基础上红系、粒系及巨核细胞系异常幼稚细胞增生，细胞增生异常。 髓系肉瘤列为AML，BM或PB未见白血病原始细胞 有AL重现性染色体和/或基因异常者，如t(8;21)/AML1-ETO，inv(16)/CBFβ/MYH11、 t(15;17)（q22;q12）和/或PML-RARA, t(5;14)(q31;q32)和/或IL3-IGH等原始细胞<20%也可诊断为AL的情况白血病的诊断与分类步骤白血病的诊断与分类步骤 增加的血液细胞是良性还是恶性 前体与外周(成熟)恶性淋巴瘤/白血病的区别，也就是急性和慢性白血病的区别 恶性细胞的系列来源 预后分型 治疗靶点分型 白血病的诊断与分类步骤白血病的诊断与分类步骤 增加的血液细胞是良性还是恶性 细胞形态：急性白血病原始细胞明显增加，一些白血病有明显的特征，如aure’s小体；APL的异常早幼粒细胞有外浆、大量的颗粒等 免疫标志异常表达：跨系表达、早晚期同时表达、罕见细胞大量存在等 单克隆轻链表达、克隆性TCR基因重排、DNA异常 急性白血病特有的染色体和/或基因肿瘤细胞DNA倍体分析肿瘤细胞DNA倍体分析恶性前体与外周（成熟） 淋巴细胞疾病的鉴别恶性前体与外周（成熟） 淋巴细胞疾病的鉴别 前体细胞型: ALL,淋巴母细胞淋巴瘤 B: 除了B细胞标志外,CD45dim/-、 CD34+、TdT+、CD10+ T: 除了T细胞标志外,CD45dim/-、CD34+、 TdT+、cCD3+、sCD3-、CD1a 外周(成熟) 细胞：无以上前体细胞标记 B Tnull白血病细胞的系列特异性标志如有2 系或以上的特异性标志，可诊断为急性混合性白血病null白血病细胞的系列特异性标志注：CLA：皮肤淋巴细胞相关抗原；MxA：干扰素依赖的分子； TIA1: ； HbA：血红蛋白AAML危险分层指标AML危险分层指标 高危险: 染色体单体异常、 Inv(3)/t(3;3)、≥3个的复杂染色体异常、-5、5q-、-7、 7q-、T(9;22)(BCR-ABL)、-17、伴其它改变的17p异常、除t(9;11)MLL-AF9以外的累及11q23/MLL基因的异常、 t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1、 t(6;9)（p23;q34）DEK-NUP214 血WBC >100109/L FLT3-ITD基因突变同时合并以下指标至少一种：TET2、DNMT3A、MLL-PTD突变或+8染色体异常，3年总生存率为14.5% 无FLT3-ITD突变，但有TET2、ASXL1、PHF6和/或MLL-PTD突变 混合型 AML危险分层指标AML危险分层指标 低危险AML : 染色体正常且无FLT3-ITD基因突变，但有NPM1+及IDH1或IDH2突变者 无c-KIT基因突变及-Y的 t(8;21)(q22;q22)/AML1-RUNX1(AML1-ETO)AML、inv(16)(p13q22)/ t(16;16)(p13;q22)/CBFβ-MYH11 AML 中等危险AML：不符合以上null摘自：Patel JP, 2012 摘自：Patel JP, 2012 摘自：Patel JP, 2012 摘自：Patel JP, 2012 null摘自：Patel JP, 2012 指导治疗的染色体和/或基因指导治疗的染色体和/或基因 TKI可能有效的基因突变或易位： FIP1L1-PDGFR、 FIP1L1-PDGFR、FGFR、 bcr-abl，C-KIT、IKZF1、CRLF2、JAK、ABL1、PDGFRB、 EPOR、SH2B3； TKI耐药基因突变检测帮助选择不同类型的TKI 用索拉菲尼、索坦等多靶点药物有效者：对几乎所有的恶性血液病可能有效，对FLT3-ITD突变效果尤其好 ； 可能用JAK抑制剂有效者：JAK、IL7R、CRLF2基因突变或易位 可能用组蛋白去乙酰基酶抑制剂有效者：CREBBP 基因突变，MLL基因突变或易位 干扰NPM1定位的药物如喜树碱、5-氟尿嘧啶、放线菌素D对NPM1突变白血病的疗效 指导治疗的染色体和/或基因指导治疗的染色体和/或基因砷剂可能有效者：PML-RARA AML 可从ATRA获益者：FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突变， PML-RARA、 MLL基因易位。 可能从HD-AraC获益者：NPM及IDH1/2、NRAS、KRAS基因突变、AML1-ETO+、CBFB-MYH11+AML可从HD-AraC 可能从HD-DNR获益者：DNMT3A 、NPM1基因突变，MLL融合基因AML 可从去甲基化等表观基因调节剂获益者：TET2、IDH1、IDH2、DNMT3A、ASXL1、EZH2基因突变，MLL基因突变或易位 CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD52、CD56、VEGF/R、CXCR4等已经有相应的单抗 可能对沙利度胺、雷利度胺、BTK 抑制剂有效者：多种淋巴细胞肿瘤、5q- 可能对NOTCH1抑制剂有效者： NOTCH1 、FBXW7、NUMB基因突变null 原始细胞增多是诊断前体恶性血液病尤其AL的重要指标，但原始细胞应根据免疫学标志/基因/染色体证实为恶性造血前体细胞 一些形态上的原始细胞可是正常造血细胞（尤其见于儿童感染后，G-CSF,GM-CSF等刺激或化疗后），还可以是外周或成熟的恶性血液免疫细胞，如PLL、淋巴瘤细胞、其它系统的实体瘤细胞等； 一些形态上的成熟细胞，FCM分析为恶性造血前体细胞，也应诊断为急性白血病/前体细胞恶性肿瘤 常见误区 原始细胞>20%可诊断ALnull常见的诊断错误 仅根据形态原始细胞增多诊断复发 仅根据骨髓形态分析，将AML诊断为CMML,或将CMML诊断为AML；将M5诊断为APL，或将APL诊断为M5，甚至把病毒感染诊断为AL或淋巴瘤 未分析染色体或基因，致使高危险性AL复发后才移植甚至失去移植机会 未分析cCD3或免疫标记不够或设门不够准确，未诊断出小克隆T恶性细胞，或杂合性白血病，或错把T-ALL诊断为B-ALL 基因分析技术设计或质控差，导致假阳性或假阴性病例三病例三 男性，62岁 乏力、腹胀1月，尿少排不净，体重下降5kg。外院BM诊断ALL 颌下3-4个花生大小质软淋巴结，肝肋下5cm，脾肋下4cm。血常规：WBC 56.3×109/L，HB 140g/L，PLT 24×109/L ALT 258U/L, AST 354U/L ， TBIL 66 umol/L，DBIL 23 umol/L。CR 230umol/L。null(一)骨髓片 骨髓增生Ⅲ级 原始、幼稚淋巴细胞占有核细胞胞71.4%, 粒、红两系增生受抑。 巨核细胞全片未见，血小板少见。 (二)血片 原幼细胞占66.5%。BM形态nullnullnull46,XY,t(2;8)(p12;q24.1)[14]/46,XY,dup(1)(pter q25::q25 q21::q25 qter), t(2;8)(p12;q24.1)[10] dup(1)(pter→q25::q25→q21::q25→qter)：指1号染色体长臂q21至长臂q25片段的反向重复。pter:指短臂末端，双冒号指断裂重接，箭头指从某区到某区，qter指长臂末端。 Burkitt 淋巴瘤常见t(8;14)(q24.1;q32)。t(2;8)(p12;q24.1)是一种变异易位，涉及c-myc基因和Igk基因重排，还有一种变异易位为：t (8;22)(q24.1;q11),涉及c-myc基因和IgL基因重排。约30%的Burkitt 淋巴瘤患者可出现1号染色体长臂的结构异常，常见的有长臂部分片段（q21-q25）的重复。病例三病例三 诊断为Burkitt淋巴瘤 CHOP一疗程，脾脏缩小肋下不可及，肝脏缩小至肋下1cm 准备allo-HSCT病例四病例四 外院确诊AML 1年10个月，复发5个月 反复化疗11疗程，其中中大剂量化疗>4疗程 我院查BM原始细胞>80%, FCM异常原始细胞>60% KIT基因突变阳性，为c.1255_1257delGAC /p.D419del突变，突变为杂合型，位于Exon8。提示TKI可能有效 予以IMT0.4 -0.5 QD 治疗，血WBC稳定，血原始细胞从24%降至5%， 骨髓原始细胞从80%降至10%，FCM 异常原始细胞从60%降至5% 正在移植中，原计划的TBI取消，采用化疗预处理null TKI治疗前 TKI治疗后nullTKI治疗前TKI治疗后null诊断误区三 初诊未做MICM诊断，就不能查MRDnull基因筛查结果 2006.7-2008年7月期间 共筛查了508例标本（结果可追踪） 333例初治、难治复发、或FCM检测出MRD的病例，白血病基因检测阳性率为42.64%； 175例完全缓解且用FCM检测不出MRD的病例，白血病基因检测阳性率为15.43%；null非APL的AML患者白血病基因筛查结果NR或MRD高的患者FCM无MRD的患者nullALL患者白血病基因筛查结果 NR或MRD高者FCM无MRD者nullALL患者FCM/MRD的预后价值CR后用FCM每1-3月检测1次MRD, 观察12月以上: 1. CR后3个月内MRD转阴者; 2. CR后3月-12月MRD阳性nullAML患者FCM/MRD的预后价值CR后用FCM每1-3月检测1次MRD, 观察12月以上: 1. CR后12个月内MRD转阴者; 2. CR后MRD阳性12月nullAL患者FCM/MRD的预后价值 转阴数次后再次转阳者几乎都复发null免疫标志监测指导靶向治疗