中和抗体实验
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第三章 中和试验(Neutralization)及中和抗体
简介:
中和试验(Neutralization)是
中和抗体对相应蛋白(或细胞因子)的生物活性的干涉能力。本
文以中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α为例,讲述如何用中和试验来确定此中和抗体对重组 TNF-α蛋
白的生物活性的中和/干涉能力。
原理:
用 TNF-α敏感小鼠 L929 细胞(成纤维肉瘤细胞)的微量细胞毒试验来
兔抗大鼠 TNF-α(中
和抗体)对重组 TNF-α蛋白的中和能力。因为在无中和抗体存在的情况下,TNF-α对 L929 细胞
有细胞毒杀伤作用,而加入中和抗体后,TNF-α的细胞毒作用会减弱或完全被抑制,即可得知
不同浓度的中和抗体的中和能力的高低。
实验仪器和材料:
小鼠 L929 细胞
RPMI-1640 培养液
细胞因子--重组大鼠 TNF-α,产品标号:400-14,规格:20ug,生产商:Peprotech
中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α,产品标号:500-P72,规格:50ug,生产商:Peprotech
培养板
离心机
培养箱
实验方法:
[试剂配制]
细胞因子:
8. 快速离心细胞因子(重组 TNF-α)的冻干粉管,使管盖和管壁上的粉末收集至管
底;
9. 加入无菌的双蒸水 100ul,将细胞因子重悬配制成浓度为 0.2mg/ml的贮存液,
4oC可保存 1 周,如长期保存,则需分装冻存于 -20oC;
10. 取一定量的贮存液(0.2mg/ml),用 RPMI-1640 培养液进行 1:100,000 稀释,即
获得浓度为 2.0 ng/ml 的重组 TNF-α 工作液。
中和抗体:
1. 快速离心中和抗体(兔抗大鼠 TNF-α)的冻干粉管,使管盖和管壁上的粉末收集至管底;
2. 加入无菌的双蒸水 200ul,将中和抗体重悬配制成浓度为 0.25mg/ml的贮存液,4 oC可
保存 6 个月,如长期保存,则需分装冻存于 -20oC;
3. 根据细胞因子(重组TNF-α)的ED50(半数有效浓度)来确定中和抗体工作液的浓度
此细胞因子(重组TNF-α,产品标号:500-P72,生产商:Peprotech)的ED50 为 0.05ng/ml,
配制的中和抗体工作液的浓度是此ED50的 10000X,5000X,2000X,1000X,500X,
200X,即 500ng/ml,250ng/ml,100ng/ml,50ng/ml和 25ng/ml和 10ng/ml。因此需将
0.25mg/ml的中和抗体贮存液用RPMI-1640 工作液分别作 1:500,1:1000,1:2500,
1:5000,1:10000 和 1:25000 稀释。
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[检测步骤]
第 1 天:
1. 收集对数生长期的 L929 细胞,用培养液调细胞至适当浓度,加入培养板的小孔中,3
x 104 个细胞/孔;
2. 置 37℃,5%CO2的培养箱中培养 16~24h;
第 2 天:
1. 在一个干净的 96 孔培养板的不同孔中分别加入 50ul 细胞因子工作液和 50ul 各稀释
度的中和抗体;
2. 混匀,并置 37℃,5%CO2的培养箱中孵育 30 分钟;
3. 将第 1 天培养好的 L929 细胞从培养箱取出,小心吸除培养板中的培养液;
4. 从培养箱取出上述加入细胞因子和中和抗体的 96 孔培养板,将孔中 100ul 的细胞因子
和中和抗体的混合液缓慢、小心地加到 L929 细胞上,再在细胞上另加入 100ul 新鲜
的培养液和适当浓度的放线菌素 D;
5. 将细胞培养板放回培养箱中,37℃,5%CO2孵育 18 个小时。
[检测步骤]
1. 从培养箱取出细胞培养板,弃培养液;
2. 经 Hanks 液洗涤后,每孔加入适当浓度的结晶紫染色液;
3. 37℃培养 1h,使活细胞充分着色;
4. 然后各孔加 1%SDS 短时温育使染色细胞溶解;
5. 以酶标测定仪测各孔A570nm值,此值愈小,表明培养板中细胞含量愈少,TNF-α的细胞
毒作用越弱,提示中和抗体对重组TNF-α的中和活性越强。另外可将中和抗体的浓度
vs A570nm值作“量-效曲线”图,从而计算出中和率为 50%时的中和抗体浓度,即半数
中和浓度(ND50)。
中和抗体:
美国 Peprotech 公司生产上百种细胞因子的中和抗体,并不断更新,查询请见网站:
www.peprotech.com。
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抗体名称 种属 产品编号 规格
BMP-2 Human 500-P195 50ug/100ug
b-NGF Human 500-P85 50ug/100ug
抗体名称 种属 产品编号 规格
IL-1alpha Rat 500-P180G 50ug/100ug
IL-1beta Human 500-P21B 50ug/100ug
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抗体名称 种属 产品编号 规格
Cardiotrophin-1 Human 500-P101 50ug/100ug
CNTF Rat 500-P79 50ug/100ug
CSF Human 500-P44 50ug/100ug
EGF Human 500-P45 50ug/100ug
ENA-78 Human 500-P91 50ug/100ug
Eotaxin Human 500-P41 50ug/100ug
Eotaxin Mouse 500-P67 50ug/100ug
Eotaxin Mouse 500-P175G 50ug/100ug
Eotaxin-2 Human 500-P103G 50ug/100ug
Eotaxin-3 Human 500-M32 500ug
Eotaxin-3 Human 500-P156G 50ug/100ug
Exodus-2 Human 500-P109 50ug/100ug
Exodus-2 Mouse 500-P114 50ug/100ug
FGF-9 Mouse 500-P66 50ug/100ug
FGF-10 Human 500-P151G 50ug/100ug
FGF-17 Human 500-P152 50ug/100ug
FGF-acidic Human 500-P17 50ug/100ug
FGF-basic Human 500-P18 50ug/100ug
flt3 Ligand Human 500-P42 50ug/100ug
GCP-2 Human 500-P120 50ug/100ug
G-CSF Human 500-P43 50ug/100ug
G-CSF Mouse 500-P69 50ug/100ug
GM-CSF Human 500-P33 50ug/100ug
GM-CSF Mouse 500-P65 50ug/100ug
GRO-/MGSA Human 500-P92 50ug/100ug
GROb/MIP-2 Rat 500-P75 50ug/100ug
GRO-beta Human 500-P104 50ug/100ug
GRO-gamma Human 500-P105 50ug/100ug
IFN-alpha Human 500-P32A 50ug/100ug
IFN-gamma Human 500-P32 50ug/100ug
IFN-gamma Rat 500-P122G 50ug/100ug
IGF-I Human 500-P11 50ug/100ug
IGF-I Mouse 500-P157G 50ug/100ug
IGF-II Human 500-P12 50ug/100ug
IL-1alpha Human 500-P21A 50ug/100ug
IL-1alpha Mouse 500-P51A 50ug/100ug
抗体名称 种属 产品编号 规格
IL-1beta Human 500-P21BG 50ug/100ug
IL-1beta Human 500-M01B 500ug
IL-1beta Mouse 500-P51 50ug/100ug
IL-1beta Rat 500-P80 50ug/100ug
IL-2 Human 500-P22 50ug/100ug
IL-2 Human 500-P22G 50ug/100ug
IL-2 Mouse 500-P111 50ug/100ug
IL-3 Mouse 500-P53 50ug/100ug
IL-3beta Rat 500-P177G 50ug/100ug
IL-4 Human 500-P24 50ug/100ug
IL-4 Mouse 500-P54 50ug/100ug
IL-5 Human 500-P25 50ug/100ug
IL-6 Human 500-P26 50ug/100ug
IL-6 Mouse 500-P56 50ug/100ug
IL-6 Rat 500-P73 50ug/100ug
IL-6 Rat 500-P73G 50ug/100ug
IL-7 Human 500-M07 500ug
IL-7 Human 500-P27 50ug/100ug
IL-7 Mouse 500-P57 50ug/100ug
IL-8 Human 500-P28 50ug/100ug
IL-9 Human 500-P29 50ug/100ug
IL-9 Mouse 500-P59 50ug/100ug
IL-10 Human 500-P139 50ug/100ug
IL-10 Human 500-P20 50ug/100ug
IL-10 Mouse 500-P60 50ug/100ug
IL-11 Human 500-M11 500ug
IL-11 Human 500-P01 50ug/100ug
IL-12 Human 500-P154G 50ug/100ug
IL-12 Mouse 500-P155G 50ug/100ug
IL-13 Human 500-P13 50ug/100ug
IL-15 Human 500-P15 50ug/100ug
IL-16 Human 500-P06 50ug/100ug
IL-17 Human 500-P07 50ug/100ug
IFN-r Mouse 500-P119 50ug/100ug
IP-10 Human 500-P93 50ug/100ug
IP-10 Mouse 500-P129 50ug/100ug
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抗体名称 种属 产品编号 规格
I-TAC Human 500-P132 50ug/100ug
JE (MCP-1) Mouse 500-P113 50ug/100ug
LIF Human 500-P39 50ug/100ug
Lymphotactin Human 500-P40 50ug/100ug
MCAF/MCP-1 Human 500-P34 50ug/100ug
MCP-1 (MCAF) Rat 500-P76 50ug/100ug
MCP-2 Human 500-P35 50ug/100ug
MCP-3 Human 500-P37 50ug/100ug
MCP-3 Mouse 500-M73 500ug
MCP-4 Human 500-P04 50ug/100ug
MCP-4 Mouse 500-M70 500ug
MCP-5 Mouse 500-P61 50ug/100ug
M-CSF Mouse 500-P62G 50ug/100ug
MDC Human 500-P107 50ug/100ug
MIG Human 500-P50 50ug/100ug
MIP-1alpha Rat 500-P77 50ug/100ug
MIP-1beta Human 500-P38B 50ug/100ug
MIP-2 Mouse 500-P130 50ug/100ug
MIP-3 Human 500-P124 50ug/100ug
MIP-3alpha Human 500-P95A 50ug/100ug
MIP-3beta Human 500-P95B 50ug/100ug
MIP-4 Human 500-P108 50ug/100ug
MIP-5 Human 500-P123G 50ug/100ug
NAP-2 Human 500-P03 50ug/100ug
Neurturin Human 500-P102 50ug/100ug
NT-3 Human 500-P82 50ug/100ug
NT-3 Human 500-P82G 50ug/100ug
NT-4 Human 500-P83 50ug/100ug
抗体名称 种属 产品编号 规格
NT-4 Human 500-P83G 50ug/100ug
Oncostatin M Human 500-P30 50ug/100ug
PDGF-AA Human 500-P46 50ug/100ug
PDGF-BB Human 500-P47 50ug/100ug
PF-4 Human 500-P05 50ug/100ug
Rantes Human 500-M75 500ug
RANTES Mouse 500-P118 50ug/100ug
Rantes Human 500-P36 50ug/100ug
Runt Domain Human 500-P95 50ug/100ug
SCF Human 500-P48 50ug/100ug
SCF Mouse 500-P71 50ug/100ug
SCF Rat 500-P202G 50ug/100ug
SCGF Human 500-P99G 50ug/100ug
sTNF receptor Human 500-P143 50ug/100ug
Tarc Human 500-P97 50ug/100ug
Teck Human 500-P134 50ug/100ug
TGF-a Human 500-P16 50ug/100ug
TNF-alpha Human 500-M26 500ug
TNF-alpha Human 500-P31AG 50ug/100ug
TNF-alpha Mouse 500-P64 50ug/100ug
TNF-alpha Mouse 500-P64G 50ug/100ug
TNF-alpha Rat 500-P72 50ug/100ug
TPO Human 500-P49G 50ug/100ug
Trail/Apo2 Human 500-P135 50ug/100ug
Tweak Human 500-P137G 50ug/100ug
VEGF Human 500-P10 50ug/100ug
VEGF Human 500-P10G 50ug/100ug
VEGF Mouse 500-P131 50ug/100ug
注:Peprotech 的中和抗体,除具有中和作用外,还可以用于免疫组织化学、免疫沉淀、Western
Blot 和 ELISA 等。欲了解详细情况,请向联科生物技术有限公司咨询(全国免费咨询/订购电话
--800 8571 184),或登陆 www.peprotech.com 进行查询。
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