2-植物组织DNA的提取和鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1. 通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的。 2. 了解CTAB的成分及作用。 3. 学习PCR的原理并掌握其方法。 4. 学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 实验原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析 。 PCR基本原理： 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的DNA片段。 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。 电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长700bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与2Kbp的DNA相同。 T-DNA插入突变体PCR鉴定图解： T-DNA插入突变体的引物位点 PCR电泳图 验仪器材料和试剂 实验材料： 拟南芥叶片 实验仪器： 电热恒温水浴锅；离心机；液氮罐；研钵；离心管；移液管；稳压稳流电泳仪；可调微量移液器；水平电泳槽；暗箱紫外透射仪。 实验试剂： CTAB分离缓冲液；氯仿/异戊醇；无水乙醇；70％乙醇溶液；NaAc；TE缓冲液； 电泳缓冲液；加样缓冲液；溴化乙锭（EB）溶液；琼脂糖凝胶（浓度为1.2%）。 实验步骤 ⑴．植物DNA的提取 1.取CTAB分离缓冲液加入离心试管中，于65℃水浴预热； 2.取2-3片新鲜叶片于离心管，加入液氮研磨细粉末； 3.加入600 ul预热的CTAB分离液，轻轻转动，混匀，65℃水浴保温45min； 4.12000rpm离心10min； 5.将上清液转移到新离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻摇动，混匀； 6.12000rpm离心5-10min，将上清液转移到新离心管； 7.向上清中加入1/10体积3M NaAc，再加入两倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，冰上放置10min； 8.12000rpm离心10min，弃上清，加入500 ul70％乙醇溶液洗涤2min； 9.12000rpm离心5min，弃上清吸干残留并干燥； 10.加40 ulTE缓冲液溶解DNA。 ⑵．PCR反应 按照下装填反应体系： 反应物 用量（ul） H2O 12.3 10×Buffer 2.0 dNTPs 0.5 MgCl2 2.0 LP/BP 0.5 RP 0.5 Taq聚合酶 0.2 DNA 2.0 总计 20.0 调节PCR仪，使其按照94℃ 5min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min30s，重复33次，72℃ 10min的方式进行。 ⑶．琼脂糖凝胶电泳 1．凝胶板的制备： 取琼脂糖0.48g，加0.5×TBE缓冲溶液40ml，微波熔化，制成1.2%的琼脂糖胶液。将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，室温下凝固。完全凝固后，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。 2．加样： 在两份PCR产物中各加4 ul6×Loading Buffer，在样品DNA中加缓冲液2 ul， 混匀，用微量进样器加样，加样量10(l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。 3．电泳： 120V电压电泳，至少40min。 4．染色、观察、显微照相与记录： 关闭电源，取出胶床，浸入EB溶液中，10min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA，并进行显微照相。 实验结果及分析 1.实验结果： 注释： 第一孔道为DL2000 marker；第五至七孔道为本人实验结果（25号样品），依次是PCR前的样品DNA、引物为LP＆RP的PCR产物和引物为BP＆RP的PCR产物。 2.实验分析： 若拟南芥为野生型，即无T-DNA插入，不存在BP位点，因此，电泳时，只有LP＆RP的PCR产物存在，而BP＆RP的PCR产物不存在； 若拟南芥为纯合突变体，即两条链均有T-DNA插入，都存在BP位点，因此电泳时，由于大片段的插入， LP＆RP的PCR产物不存在，只有BP＆RP的PCR产物存在； 若拟南芥为杂合突变体，即有一条条链有T-DNA插入，其中存在BP位点，因此电泳时，突变的那条链，由于大片段的插入，LP＆RP的PCR产物不存在，只有BP＆RP的PCR产物存在，另外一条链则只存在LP＆RP的PCR产物。 观察图片，两个PCR产物电泳所得的结果均是一条条带。LP＆RP的PCR产物大小在1000bp左右，BP＆RP的PCR产物大小在800bp左右，与预期结果相符，因此，25号拟南芥为杂合突变体。